CN101458223B - 一种微囊藻毒素-lr定量快速检测传感器的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
一种微囊藻毒素-LR定量快速检测生物传感器的制备及应用，属于生物技术领域。该检测传感器为阻抗型电化学传感器，由CHI760C型电化学工作站，三电极体系：免疫电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极组成；将L-半胱氨酸，胶体金，微囊藻毒素抗体复合物分别包被于裸金电极表面作为工作电极；当微囊藻毒素抗体与样液中的抗原(MC-LR)结合时将引起参比电极与工作电极之间电势差的变化，与样品中抗原浓度呈定量关系，以此进行微囊藻毒素的检测；成功建立了快速、特异、灵敏的检测微囊藻毒素抗原的生物传感器；检测线性范围：0.05～300ng/mL，检出限1.82×10-2ng/mL。既可以对天然湖泊水进行实时监测，又可以对水厂饮用水的制备过程进行实时监控。
Description
技术领域
一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应用，属于生物技术领域。
背景技术
藻毒素(Microcystins，简称MC)已成为环境水体中被普遍关注的污染物之一。MC是一类具有生物活性的环状七肽化合物，主要由淡水藻类铜绿微囊藻产生，至今已发现MC有70多种异构体。它是一种以肝为靶器官的、高度特异的毒素，具有明显的肝细胞毒性，随着对MC毒性的深入研究，发现MC具有多器官毒性、遗传性和致癌性。藻毒素结构主要由N-甲基脱氢丙氨酸及两个L-氨基酸残基X和Z组成，常见的有MC-LR，RR，YR三种毒素(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸)，而淡水中尤以MC-LR为主要毒素，藻毒素是一种藻细胞内毒素，当藻细胞衰老、死亡后，毒素才被释放到水体中。大面积严重的水华会使水体中的毒素浓度达到mg/L的水平，所以，在水华爆发的夏、秋两季节湖体中微囊藻毒素的浓度会较高。冬春两季节，部分随着藻细胞和悬浮物沉淀在沉积物中的毒素，也会在外界因素的影响下慢慢释放出来，有报道沉底泥中吸附的藻毒素含量达到13mg/L-24mg/L。因此，对饮用水源水中微囊藻毒素的监测应该是一项长期的工作，分析方法的研究也主要针对MC-LR来建立的。
国内外关于水质监测的方法很多，饮用水源水和自来水中微囊藻毒素的测定方法主要是高效液相色谱/质谱联用(HPLC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、气相色谱(GC)等，其中HPLC为我国生活饮用水卫生标准推荐采用的测定微囊藻毒素的方法。但是这些方法都费时费力，具有滞后性，无法对源水进行实时监控。
本发明提出将无标记免疫传感技术应用到微囊藻毒素的监测上，在国内外尚未见报道，既可以对源水进行实时监测，又可以对水厂饮用水的制备过程进行实时监控，做到及早知道，及早处理，对于人民生活安定，社会的和谐会有着巨大的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备及应用，该方法主要利用抗原抗体反应的高特异性、电化学信号的高灵敏性以及现代信息技术的高智能化相结合，构建无标记型电化学免疫传感装置，实现自来水水源、水处理过程及出厂水中微囊藻毒素的实时快速全自动监测。
本发明的技术方案：一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备方法，该检测传感器为阻抗型电化学传感器，由CHI760C型电化学工作站，三电极体系：免疫电极为工作电极，饱和甘汞标准电极为参比电极，铂丝电极为对电极组成；将L-半胱氨酸、胶体金、微囊藻毒素抗体复合物依次分别包被于裸金电极表面制成免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器；步骤为：
(1)电极清洗
先将Φ＝2mm金电极置于Piranha溶液中浸泡10min，再用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉将电极表面抛光成镜面，最后分别用金电极等量的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，置于4℃冰箱备用；
(2)电极的修饰
选择L-半胱氨酸-纳米金作为自组装方式，将清洗好的Au电极浸入到pH为5.0的0.5％的L-半胱氨酸L-Cys中室温下浸置5h，取出用超纯水洗净得到L-Cys修饰的Au电极，然后浸入纳米金溶胶溶液中4℃自组装12h；
所述纳米金溶胶的配置：用新制双蒸水配制100mL质量浓度为0.01％氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37℃保温的质量浓度1％柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持温度和转速不变，继续搅拌加热15min，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，4℃冰箱保存备用；
(3)检测抗体的包被
藻毒素-LR-KLH免疫得到藻毒素-LR多抗；
用超纯水充分清洗nano-Au/L-Cys/Au修饰电极，然后电极表面滴加10μL500μg/L的藻毒素-LR多抗溶液，37℃恒温恒湿温育60min后取出，最后滴加10μL含有1％BSA的PBS溶液，37℃恒温恒湿培育30min后取出，用PBS洗涤，制得的免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器，利用电化学工作站CHI760C，进行样品中藻毒素的检测，未立即使用的免疫电极需用氮气吹干后，置于pH 7.4的PBS中于4℃保存待用。
所述方法制备的微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器产品的应用方法：
(1)绘制检测标准曲线：
取出已制备好的MC-LR免疫电极，平衡至室温，按照浓度从低到高的顺序，在电极表面依次滴加10μL不同浓度的MC-LR标准溶液，并分别于37℃下孵化15min后，PBS洗净吹干，均采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中测定工作电极界面的变化，并对电极表面抗体的固定效果进行表征；CV的测试条件：电压-0.2～0.6V，扫描速度0.1V/S，扫描至稳定；EIS的测试条件：初始电位为0.2V，振幅0.05V，频率范围为1～100kHz，静置时间2s，所有测试均在室温下进行，检测时间为3min；
(2)纯净水，矿泉水，自来水出口水的检测：
水样无需前处理，直接进行测定，取10μL待测水样，滴加于免疫电极表面，37℃恒温恒湿培育15min，PBS洗净吹干，采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中进行测定，测定条件同上。
(3)天然湖泊水，污水，自来水的检测
由有机玻璃深水采样器进行采样，采水深度为0.5m以下，采样量为5L；经砂芯漏斗去除大颗粒杂质，再经过0.45μm滤膜减压过滤，于-20℃低温冰箱中保存待检；吸取样液10μL，滴加于免疫电极表面，37℃恒温恒湿培育15min后，PBS洗净吹干，采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中进行测定，测定条件同上；
(4)等效电路计算：计算公式为：
ΔRet＝Ret(Ab-Ag)-Ret(Ab)
Ret(Ab)：免疫电极封闭后的电子传递阻抗值；
Ret(Ab-Ag)：免疫电极与MC-LR标准品反应后的电极电子传递阻抗值；
ΔRet：反应前后电子传递阻抗的变化值；
以标准溶液浓度(C)为横坐标，阻抗变化值(ΔRet)为纵坐标绘制标准曲线，并根据样液实测阻抗变化值计算水样中微囊藻毒素-LR浓度。
本发明的有益效果：通过将L-半胱氨酸，胶体金，微囊藻毒素抗体复合物分别包被于裸金电极表面，采用微型甘汞标准电极为参比电极，铂电极为对电极，Au作为工作电极材料。当微囊藻毒素抗体与样液中的抗原(MC-LR)结合时将引起参比电极与工作电极之间电势差的变化，这种电势差的变化与样品中抗原浓度呈现定量关系，以此进行微囊藻毒素的检测。从而成功地建立了快速、特异、灵敏的检测微囊藻毒素抗原的生物传感器。
具体实施方式
实施例1：天然湖水中微囊藻毒素-LR的定量快速检测：
1前处理：
由有机玻璃深水采样器进行采样，采水深度为0.5m以下，采样量为5L。经砂芯漏斗去除大颗粒杂质，再经过0.45μm滤膜减压过滤。收集滤液。取适量滤液进行检测分析。
2微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的使用方法：
取出已制备好的MC-LR免疫电极传感器，平衡至室温。按照浓度从低到高的顺序，在电极表面依次滴加10μL不同浓度的MC-LR标准溶液和待测样品提取液，并分别于37℃下孵化15min后，PBS洗净吹干。采用循环伏安法(CV)，交流阻抗法(EIS)于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中进行测定。CV的测试条件：电压-0.2～0.6V，扫描速度0.1V/S，扫描至稳定；EIS的测试条件：初始电位为0.2V，振幅0.05V，频率范围为1～100kHz，静置时间2s，所有测试均在室温下进行。
取样液10μL，滴加于免疫电极表面，37℃下恒温恒湿培育15min后，PBS洗净吹干。采用循环伏安法(CV)，交流阻抗法(EIS)于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中进行测定。测定条件同上。该方法微囊藻毒素检测线性范围为：0.05～300ng/mL，检出限为1.82×10-2ng/mL。
Claims (2)
1.一种微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器的制备方法，其特征是该检测传感器为阻抗型电化学传感器，由CHI760C型电化学工作站，三电极体系：免疫电极为工作电极，饱和甘汞标准电极为参比电极，铂丝电极为对电极组成；将L-半胱氨酸、胶体金、微囊藻毒素抗体复合物依次分别包被于裸金电极表面制成免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器；步骤为：
(1)电极清洗
先将Φ＝2mm金电极置于Piranha溶液中浸泡10min，再用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉将电极表面抛光成镜面，最后金电极分别用等量的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，置于4℃冰箱备用；
(2)电极的修饰
选择L-半胱氨酸-纳米金作为自组装方式，将清洗好的Au电极浸入到pH为5.0的0.5％的L-半胱氨酸L-Cys中室温下浸置5h，取出用超纯水洗净得到L-Cys修饰的Au电极，然后浸入纳米金溶胶溶液中4℃自组装12h；
所述纳米金溶胶的配制：用新制双蒸水配制100mL质量浓度为0.01％氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37℃保温的质量浓度1％柠檬酸三钠溶液4.5mL，保持温度和转速不变，继续搅拌加热15min，直至溶液呈现清亮的酒红色，室温冷却，4℃冰箱保存备用；
(3)检测抗体的包被
藻毒素-LR-KLH免疫得到藻毒素-LR多抗；
用超纯水充分清洗nano-Au/L-Cys/Au修饰电极，然后电极表面滴加10μL500μg/L的藻毒素-LR多抗溶液，37℃恒温恒湿温育60min后取出，最后滴加10μL含有1％BSA的PBS溶液，37℃恒温恒湿培育30min后取出，用PBS洗涤，制得的免疫电极作工作电极即为藻毒素传感器，利用电化学工作站CHI760C，进行样品中藻毒素的检测，未立即使用的免疫电极需用氮气吹干后，置于pH 7.4的PBS中于4℃保存待用。
2.如权利要求1所述方法制备的微囊藻毒素-LR定量快速检测传感器产品的应用方法，其特征是：
(1)绘制检测标准曲线：
取出已制备好的MC-LR免疫电极，平衡至室温，按照浓度从低到高的顺序，在电极表面依次滴加10μL不同浓度的MC-LR标准溶液，并分别于37℃下孵化15min后，PBS洗净吹干，均采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中测定工作电极界面的变化，并对电极表面抗体的固定效果进行表征；CV的测试条件：电压-0.2～0.6V，扫描速度0.1V/S，扫描至稳定；EIS的测试条件：初始电位为0.2V，振幅0.05V，频率范围为1～100kHz，静置时间2s，所有测试均在室温下进行，检测时间为3min；
(2)纯净水，矿泉水，自来水出口水的检测：
水样无需前处理，直接进行测定，取10μL待测水样，滴加于免疫电极表面，37℃恒温恒湿培育15min，PBS洗净吹干，采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中进行测定，测定条件同上；
(3)天然湖泊水，污水，自来水的检测：
由有机玻璃深水采样器进行采样，采水深度为0.5m以下，采样量为5L；经砂芯漏斗去除大颗粒杂质，再经过0.45μm滤膜减压过滤，于-20℃低温冰箱中保存待检；吸取样液10μL，滴加于免疫电极表面，37℃恒温恒湿培育15min后，PBS洗净吹干，采用循环伏安法CV，交流阻抗法EIS于[Fe(CN)6]3-/4-探针电解液中进行测定，测定条件同上；
(4)等效电路计算：计算公式为：
ΔRet＝Ret(Ab-Ag)-Ret(Ab)
Ret(Ab)：免疫电极封闭后的电子传递阻抗值；
Ret(Ab-Ag)：免疫电极与MC-LR标准品反应后的电极电子传递阻抗值；
ΔRet：反应前后电子传递阻抗的变化值；
以标准溶液浓度(C)为横坐标，阻抗变化值(ΔRet)为纵坐标绘制标准曲线，并根据样液实测阻抗变化值计算水样中微囊藻毒素-LR浓度。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Jinneng Inventor after: Zhu Wenqi Inventor after: Zhang Jing Inventor after: Sun Xiulan Inventor after: Zhang Yinzhi Inventor before: Sun Xiulan Inventor before: Zhang Yinzhi Inventor before: Shi Hui Inventor before: Xiao Liwen Inventor before: Li Luning Inventor before: Xu Xin Inventor before: Xu Dan |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20170724 Address after: 201620 Shanghai city Songjiang District Guangfulin road 697 Lane 21, room 1324-1 Patentee after: Shanghai xiongtu Biological Technology Co. Ltd. Address before: Food College of Jiangnan University No. 1800 214122 Jiangsu city of Wuxi Province Li Lake Avenue Patentee before: Jiangnan University |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120125 Termination date: 20171226 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |