CN103675062A - 一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器。该免疫传感器利用电极表面修饰技术，将制备的氧化石墨烯-聚苯胺复合物(GO-PANI)修饰电极表面，然后通过电聚合的方法在电极表面聚合一层铂金合金（Au-PtNPs），再修饰17β-雌二醇完全抗原在电极表面，同时修饰抗体复合物（PDA-PtNPs-AuNPs-Ab-HRP）和17β-雌二醇标准品在电极表面，这样其完全抗原和标准品同时竞争结合抗体复合物上的抗体，结合在电极表面的抗体复合物上的HRP催化底物H2O2产生信号，这样通过添加底物H2O2前后的信号变化和标准品浓度之前的关系绘制工作曲线，达到检测17β-雌二醇的目的。本文发明的PDA-PtNPs-AuNPs纳米材料是第一次合成，且GO-PANI复合物导电性能强，Au-PtNPs纳米合金具有良好的生物相容性，对H2O2具有一定的催化性能。电化学免疫传感器具有灵敏度高，检测速度快的优点，检测周期短。便于实际样品的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料和食品添加剂检测领域，提供了一种检测17β-雌二醇的的电化学免疫传感器，可以用于检测食品中的17β-雌二醇。
背景技术
雌激素是一种G 18类固醇激素，目前在人体中发现的雌激素有三种：雌二醇、雌酮和雌三醇，其中雌二醇的生物活性最强。雌二醇可以和体内雌激素受体结合，改变内分泌系统正常的生理功。由于其合成代谢的作用而用于畜牧生产中以期促进增长，而低浓度的雌激素可以引起人类性发育的异常，减少人类精子的数量。在欧盟一些国家，雌激素已经禁止用于畜牧业。因此，迫切需要建立一种快速便捷的检测方法来检测环境中存在的雌激素的含量。目前检测17β-雌二醇的方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法等，但这些方法具有检测成本高，样品处理复杂且时间较长，仪器操作复杂等缺点。
发明内容
本文研究了一种快速便捷，灵敏度和精确度都较高的电化学免疫传感器检测食品中的17β-雌二醇，操作简单，成本低廉。在玻碳电极的表面修饰一层可以增加电化学信号的纳米复合物，然后将17β-雌二醇完全抗原通过和修饰在电极表面的金之间的静电引力吸附在电极表面。我们制备17β-雌二醇抗体和辣根过氧化物酶的标记层，将其和游离的17β-雌二醇的标准品同时滴加在电极表面，这样电极表面修饰的完全抗原和游离的标准品竞争结合标记的抗体。清洗电极以后，结合在电极表面标记层上的辣根过氧化物酶催化底物过氧化氢产生电信号。利用电信号的变化就可以达到待测物检测的目的。
本文发明内容之一是提供了一种新型电化学免疫传感器的制备方法。
本文发明内容之二是将制备的免疫传感器用于检测食品中的17β-雌二醇。
本文发明的技术方案，包括以下步骤：
1、检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：
(1)石墨烯-聚苯胺的制备：
25 mg的GO溶于50 ml 1 mol/L H2SO4中，超声1 h，形成分散均匀的溶液。加入200 μL的苯胺单体再超声30 min。加入0.06 g的(NH4)2S4O8，20 ℃超声2 h。得到的复合物通过过滤收集，60℃干燥。
(2) 抗体和辣根过氧化物酶标记层的制备：
2 ml 1%的H2PtCl6·6H2O加入到8 ml 水中，80℃搅拌状态下加入1%的硼氢化钠溶液，搅拌4 h，得到PtNPs。5.0 mg的多巴胺加入到5.0 ml PtNPs溶液中，用Tris–HCl将pH 调节至8.5，室温下搅拌5 h。离心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs。在将其加入到含有20 mg柠檬酸钠的HAuCl4溶液中，室温下搅拌两个小时。离心清洗得到PDA-PtNPs-AuNPs纳米材料，溶于5 ml水中备用。100 μL，1mg/mL的辣根过氧化物酶 (HRP) 和100 μL，5 μg/mL的雌二醇抗体 (Ab)加入到2 ml的上述材料中，4℃下搅拌一夜。用PBS缓冲溶液清洗三次，得到纳米复合物标记层PDA-PtNPs-AuNP-HRP-Ab.
(3) 检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：
5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是300 s。这样在GO-PANI表面修饰了一成Au-PtNPs的纳米合金。滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h。用10 μl BSA (1%)封闭残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液清洗电极。得到制备的免疫传感器电极，4℃储存备用。
2、如上所制备的一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器，用于检测17β-雌二醇的步骤如下：
(1) 滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品。
(2) 以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s。根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线。
(3) 将待测样品代替17β-雌二醇标准品，根据标准曲线进行检测。
本文所述的一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备及应用，所有试剂和抗体均在化学试剂公司购买。
本发明体现的优势和特点是：
(1) 本文发明的PDA-PtNPs-AuNPs纳米材料是第一次合成，且GO-PANI复合物导电性能强，Au-PtNPs纳米合金具有良好的生物相容性，对H2O2具有一定的催化性能。
(2) 本发明的电化学免疫传感器具有灵敏度高，检测速度快的优点，检测周期短。
(3) 本发明的检测17β-雌二醇的方法，操作简单，灵敏，便于实际样品的快速检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些具体实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明。此外，还需要理解，在阅读了本发明所讲述的内容以后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例 1
一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备方法， 步骤如下：
(1)5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；
(2)将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是300 s。
(3)滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h。
(4)用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极，得到制备的免疫传感器电极。
(5)滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品。
(6)以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s。根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线。
实施例2
(1)5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；
(2)将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是200 s；
(3)滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h；
(4)用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极，得到制备的免疫传感器电极；
(5)滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品；
(6)以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s。根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线。
实施例3
(1)5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；
(2)将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是200 s；
(3)滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h；
(4)用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极，得到制备的免疫传感器电极；
(5)滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品；
(6)以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有6 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s。根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线。
实施例4
(1)5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；、
(2)将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是200 s；
(3)滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h；
(4)用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极，得到制备的免疫传感器电极；
(5)滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品；
(6)以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s。根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线。
(7) 将待测样品代替17β-雌二醇标准品，根据标准曲线进行检测；
(8) 用构建的电化学免疫传感器检测牛奶样品1，平均检测6次，为检测出含有17β-雌二醇，属于合格样品；加标回收试验，相对标准偏差是4.7%。
实施例5
(1)5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；
(2)将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是200 s；
(3) 滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h；
(4)用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点。每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极，得到制备的免疫传感器电极；
(5)滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品；
(6)以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s。根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线。
(7)将待测样品代替17β-雌二醇标准品，根据标准曲线进行检测。
(8)用构建的电化学免疫传感器检测牛奶样品2，平均检测6次，为检测出含有17β-雌二醇，属于合格样品；加标回收试验，相对标准偏差是3.7%。
Claims (2)
1.本文发明的技术方案，包括以下步骤：
1、检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：
(1)石墨烯-聚苯胺的制备：
25 mg的GO溶于50 ml 1 mol/L H2SO4中，超声1 h，形成分散均匀的溶液；加入200 μL的苯胺单体再超声30 min；加入0.06 g的(NH4)2S4O8，20 ℃超声2 h；得到的复合物通过过滤收集，60℃干燥；
(2) 抗体和辣根过氧化物酶标记层的制备：
2 ml 1%的H2PtCl6·6H2O加入到8 ml 水中，80℃搅拌状态下加入1%的硼氢化钠溶液，搅拌4 h，得到PtNPs；5.0 mg的多巴胺加入到5.0 ml PtNPs溶液中，用Tris–HCl将pH 调节至8.5，室温下搅拌5 h；离心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs；在将其加入到含有20 mg柠檬酸钠的HAuCl4溶液中，室温下搅拌两个小时；离心清洗得到PDA-PtNPs-AuNPs纳米材料，溶于5 ml水中备用；100 μL，1mg/mL的辣根过氧化物酶 (HRP) 和100 μL，5 μg/mL的雌二醇抗体 (Ab)加入到2 ml的上述材料中，4℃下搅拌一夜；用PBS缓冲溶液清洗三次，得到纳米复合物标记层PDA-PtNPs-AuNP-HRP-Ab；
(3) 检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：
5 mg GO-PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO-PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为-0.2 V，扫描时间是300 s；这样在GO-PANI表面修饰了一成Au-PtNPs的纳米合金；滴加10 μl，10 μg/mL的17β-雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h；用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点；每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极；得到制备的免疫传感器电极，4℃储存备用。
2.如权利要求1所述的一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器，用于检测17β-雌二醇的步骤如下：
(1) 滴加10 μl抗体标记层和10 μl游离的17β-雌二醇标准品在制备的电极表面，室温下培养30 min，用PBS缓冲溶液冲洗未结合的抗体和标准品；
(2) 以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对比电极，制备的电极为工作电极，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中进行循环法扫描，扫描电压是-0.4 V至0.6 V，扫描速率是50 mV/s；根据添加H2O2前后的的信号变化和17β-雌二醇标准品浓度之间的关系，绘制标准曲线；
(3) 将待测样品代替17β-雌二醇标准品，根据标准曲线进行检测。
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