CN110006976A - 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用 - Google Patents
一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110006976A CN110006976A CN201910399480.6A CN201910399480A CN110006976A CN 110006976 A CN110006976 A CN 110006976A CN 201910399480 A CN201910399480 A CN 201910399480A CN 110006976 A CN110006976 A CN 110006976A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pda
- aupd
- solution
- nanostructure
- disease marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 38
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- DSVGQVZAZSZEEX-UHFFFAOYSA-N [C].[Pt] Chemical compound [C].[Pt] DSVGQVZAZSZEEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004070 electrodeposition Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001652 electrophoretic deposition Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 20
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 14
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 12
- 108010060159 Apolipoprotein E4 Proteins 0.000 claims description 11
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 8
- 229960002163 hydrogen peroxide Drugs 0.000 claims description 8
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CTENFNNZBMHDDG-UHFFFAOYSA-N Dopamine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 CTENFNNZBMHDDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 4
- 229960001149 dopamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229910003603 H2PdCl4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001548 drop coating Methods 0.000 claims description 3
- 238000001027 hydrothermal synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 3
- IJRVLVIFMRWJRQ-UHFFFAOYSA-N nitric acid zinc Chemical compound [Zn].O[N+]([O-])=O IJRVLVIFMRWJRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 3
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 150000002171 ethylene diamines Chemical class 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 abstract 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920001690 polydopamine Polymers 0.000 description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 3
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 108010060219 Apolipoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 108010060215 Apolipoprotein E3 Proteins 0.000 description 1
- 102000008128 Apolipoprotein E3 Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N Dopamine Natural products NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- 229910019029 PtCl4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000000970 chrono-amperometry Methods 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- -1 dopamine hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000006919 peptide aggregation Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用，具体包括以下几个步骤：①铂碳电极的预处理，通过电沉积的方式将氧化石墨烯量子点沉积到铂碳电极上；②制备的金双锥包铂纳米结构作为基底材料，并将之通过电泳沉积法沉积到氧化石墨烯量子点表面，从而进一步提高阿尔茨海默症标志物捕获抗体的固载量，并加速电极表面的电子传递速率；③制备的AuPd‑PDA纳米复合材料作为信号放大标签固载检测抗体；通过基底材料与AuPd‑PDA复合纳米材料的协同作用，进一步提高传感器的灵敏度；制备的电化学免疫传感器，可用于阿尔茨海默症标志物的检测；具有特异性强、灵敏度高、检测限低的特点。
Description
技术领域
本发明属于电化学免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用。
背景技术
阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）是一种以认知障碍和行为损害为主要特征的神经退行性疾病，是老年痴呆症最常见的一种形式，约占老年痴呆症的50-60%。临床表现为记忆功能减退、语言障碍、智力低下、思维迟钝等症状，严重时甚至会导致死亡。 AD是一个非常复杂的疾病，通常情况下没有明显的遗传学特征，似乎年龄是其主要的危险因素。AD在诊断上的复杂性决定了它在临床上有一个很宽泛的界定，一些外部环境因素和内部基因因素会进一步加重病情。外在的因素主要有脑外伤、抽烟、肥胖、糖尿病、高血压以及高金属离子含量等。内部基因因素主要有早老素基因突变，APOE4基因多态性，编码凝集素和网格蛋白的基因等。研究发现，含有APOE4基因的人患阿尔茨海默症的风险较不含该基因的人高3～10倍，此外有研究发现，APOE4蛋白还具有促进Aβ肽聚集和抑制Aβ肽降解酶活性的作用，由此可见，APOE4蛋白与阿尔茨海默症的发病有重要关系。因此，检测血液中的APOE4蛋白含量对阿尔茨海默症的预防与早期诊断有重要的意义。
检测血液中的APOE4蛋白对阿尔茨海默症的预防以及早期诊断有重要意义。目前对阿尔茨海默症标志物的检测方法有很多，如放射免疫分析法、电化学发光法、比色法等等，但多数检测方法繁琐、操作复杂、费用昂贵或检测限高，因此建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。
目前电化学免疫传感器已经广泛用于疾病标志物的检测，双抗夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性免疫分析技术和高灵敏、速度快的电化学分析技术的优势，兼具了高灵敏度、高特异性、检测速度快等优点，在临床检测、环境检测、食品安全控制以及生物分析等领域都有重要的应用价值。
本发明构建的电化学免疫传感器是基于电信号强弱确定标志物浓度的一类检测装置，具有以下优点：其一是采用简单、快速、有效的方法捕获抗体固定在电极表面；其二是利用检测抗体修饰AuPd-PDA纳米材料，进一步放大信号。
金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯量子点表面，大大增加了基底材料的比较面积，可以显著提高捕获抗体的固载量，并有效加速电极界面的电子传递速率；同时，AuPd-PDA纳米结构本身具有很好的过氧化氢催化性能，与检测抗体结合后，大大提高了检测信号，从而应用于阿尔茨海默症标志物的灵敏检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种AuPd-PDA纳米结构，通过下述步骤制得：
（1）取 ZnO纳米棒超声分散于Tris-HCl缓冲液中，随后加入多巴胺盐酸盐，60 ±5℃搅拌3.5~4.5h；离心分离，收集固体得到ZnO@PDA纳米棒；最后，将ZnO@PDA纳米棒分散于超纯水中，加入NH4Cl 溶液60 ±5℃搅拌0.5~1.5h用以刻蚀ZnO纳米棒，得到PDA纳米管，ZnO纳米棒与多巴胺盐酸盐的质量比为1:1；
（2）将0.4-2 mL HAuCl4 和 0.1-0.5 mL H2PdCl4 加入煮沸的PDA纳米管水溶液中，搅拌，然后加入抗坏血酸溶液，反应50~70分钟后，离心分离，收集固体得AuPd-PDA纳米结构。
其中，所述ZnO纳米棒的具体制备过程如下：将硝酸锌和氢氧化钠溶解在30 mL超纯水中，使得硝酸锌的浓度为0.5M，氢氧化钠浓度为10M；然后依次加入25 mL 乙醇和5 mL乙二胺；然后180 ℃水热反应 20 h，收集固体，即得。
进一步地，所述步骤（1）中ZnO纳米棒的用量为10mg，Tris-HCl的浓度为10mM、用量为20mL，NH4Cl 溶液的浓度为0.1M，用量为10mL。
一种利用上述AuPd-PDA纳米结构制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，制备步骤如下：
（1）将ApoE4检测抗体与AuPd-PDA纳米结构混合，超声50~70min后，离心分离，可得检测抗体修饰的AuPd-PDA纳米结构，分散至PBS缓冲液，记为Ab2-AuPd-PDA溶液，备用；
（2）铂碳电极的预处理：通过电沉积的方法将氧化石墨烯量子点沉积到铂碳电极表面得到一层氧化石墨烯颗粒；
（3）然后通过电泳沉积的方法将金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯颗粒上，用超纯水冲洗后，晾干；
（4）步骤（3）得到的电极表面滴加捕获抗体，孕育，然后用超纯水冲洗后，晾干；
（5）滴加的BSA溶液封闭非特异性结合位点，孕育，然后用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（6）滴加0.01-20000ng/mL的疾病标志物ApoE4溶液，孕育，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（7）将Ab2-AuPd-PDA溶液滴涂于电极表面，孵化，用超纯水冲洗电极表面后，晾干，制得一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器。
所述金双锥包铂纳米结构，通过下述步骤制得：
种子生长法制备金纳米双锥溶液，将2mL的金纳米双锥溶液离心，将沉淀分散于2mL、0.08M CTAC中，依次加入10μL、0.01M AgNO3、5μL、0.1M抗坏血酸后混匀，60℃摇床放置5小时，离心后，分散于2mL、0.005M CTAB中，再依次加入2-30μL、0.001M H2PtCl4、2-30μL、0.01M抗坏血酸混匀后，搅拌反应8~12h，离心后，分散于2mL水中可得金双锥包铂纳米结构。
进一步地，步骤（1）的具体过程如下：将100μL、1mg/mL ApoE4的检测抗体与1mL、1mg/mL AuPd-PDA纳米结构混合，超声1h后，离心分离，可得检测抗体修饰的AuPd-PDA纳米结构，分散到1mL、10mM PBS缓冲液中，备用。
进一步地，步骤（2）中氧化石墨烯量子点的浓度为1mg/mL，在-2.8V沉积5min；所述步骤（3）中在-1.0V沉积15min；所述步骤（4）中捕获抗体的浓度为100μg/mL，用量为10μL，所述步骤（5）中BSA溶液浓度为1mg/mL 、用为10μL；所述步骤（6）疾病标志物抗原溶液的用量为5μL，所述步骤（7）中Ab2-AuPd-PDA溶液浓度为100 μg/mL，用量为5μL。
进一步地，所述孕育或孵化是指在37℃保持1h，所述，晾干是在4℃冰箱中进行。
上述方法制得的检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器。
上述电化学免疫传感器在检测阿尔茨海默症标志物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20 mL、10 mM的pH为5.5-7.8的磷酸缓冲液中进行测试；
（2）用时间-电流法检测过氧化氢的电流响应值，输入电压为-0.2V，取样间隔为0.1s，运行时间600 s；
（3）当背景电流稳定后，每隔50s向20 mL、10 mM的pH为5.5-7.8的磷酸缓冲液中滴入20μL 1M的过氧化氢溶液，记录电流变化。
本发明的有益成果：
①本发明制备的金双锥包铂纳米结构时在金纳米双锥的表面包覆了大量的铂颗粒，大大增加了金双锥本身的比较面积，具有强大的电子传输能力，同时能有效的与抗体结合，实现捕获抗体的固载；金双锥包铂这种大表面积的纳米结构，对于提高传感器的灵敏度具有重要意义。
②本发明用AuPd-PDA纳米结构连接检测抗体，一个AuPd-PDA分子能同时连接多个检测抗体，从而进一步提高检测的灵敏度和检测限。
③检测抗体无需标签，AuPd-PDA本身能有效的催化过氧化氢分解，可直接作为检测标签；避免因酶失活而引起的检测误差。
④本发明制备的双抗夹心型电化学免疫传感器对阿尔茨海默症标志物载脂蛋白E4的检测范围为0.1 ng/mL-2 μg/mL，检测限为0.03 ng/mL。
附图说明
图 1为本发明实施例1制备的金纳米双锥的扫描电镜照片；
图2为本发明实施例1制备的金双锥包铂的扫描电镜照片；
图3为本发明实施例1制备的AuPd-PDA纳米结构的电镜照片；
图4为本发明实施例制备的传感器的检测性能分析图（即标准曲线）；
图5为本发明实施例制备的传感器的特异性分析图。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1
一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
1、金双锥包铂纳米结构的制备
首先用种子生长法制备金纳米双锥，具体步骤如下：
种子溶液的制备：
向9.625mL超纯水中依次加入250μL柠檬酸钠（0.01M）、125μLHAuCl4 (0.01M)、150μLNaBH4 (0.01M)搅匀，室温放置两小时后使用；
生长溶液制备：向40mLCTAB（0.1M）溶液中依次加入2mL HAuCl4 (0.01M)、0.4mLAgNO3(0.01M)、0.8mLHCl（1M）、0.32mL抗坏血酸（0.1M）；
将0.5 mL的种子溶液加入9.5 mL生长溶液中，搅拌30秒，室温过夜；
离心分离，将沉淀分散于10 mLCTAB溶液(0.01M)中，得到金纳米双锥（AuBP），如图1所示，得到的金纳米双锥大小均匀，尺寸约为100 nm。
将2mL的AuBP用离心机7000rpm离心8分钟，将沉淀分散于2mLCTAC（0.08M）中，依次加入10 μLAgNO3(0.01M)、5μL抗坏血酸（0.1M）后混匀，60℃摇床放置5小时，离心后，分散于2 mL CTAB（0.005M）中，再依次加入2 μLH2PtCl4(0.001M)、2 μL抗坏血酸（0.01M）混匀后，过夜。
4000rpm离心后，分散于2mL水中可得金双锥包铂纳米结构，如图2所示，在金纳米双锥表面包覆了一层铂纳米颗粒，整体大小约为125nm。
2、检测抗体修饰的AuPd-PDA纳米材料（Ab2-AuPd-PDA）的制备
聚多巴胺（PDA）纳米管的制备：将一定量的硝酸锌(Zn(NO3)2)和氢氧化钠(NaOH) 溶解在30 mL超纯水中，使得硝酸锌的浓度为0.5M，氢氧化钠浓度为10M；然后依次加入25 mL 无水乙醇(C2H5OH)和5 mL乙二胺(C2H4(NH2)2)；然后180 ℃水热反应 20 h，收集白色粉末。 然后取 10 mg ZnO纳米棒（上述白色粉末）超声分散于20 mL Tris-HCl(10 mM, pH 8.5)缓冲液中，随后加入10 mg多巴胺盐酸盐，60℃搅拌4h。离心分离，收集灰色的ZnO@PDA纳米棒，超声分散于10mL超纯水中，得到ZnO@PDA纳米棒水溶液。最后，向10 mL ZnO@PDA纳米棒水溶液中加入1mLNH4Cl（0.1M）刻蚀ZnO纳米棒（即在60 ℃搅拌1h），2000rpm离心后分散到10 mL超纯水中，可得PDA纳米管溶液。
AuPd-PDA纳米结构的制备：将0.4 mL HAuCl4 和 0.1 mL H2PdCl4 加入10mL煮沸的PDA纳米管水溶液中，搅拌10分钟，然后加入0.5mL抗坏血酸（0.01M），搅拌反应60分钟后，离心分离可得AuPd-PDA纳米结构，如图3所示，在PDA纳米管上附着着大量的金钯合金，单个金钯合金颗粒的大小从十几纳米到几十纳米不等，将AuPd-PDA分散于10 mL超纯水中，得到1mg/mL溶液，备用。
将100 μLApoE4的检测抗体（1mg/mL，厂家Novus，型号：NBP1-49529H）与1mLAuPd-PDA纳米结构（1mg/mL）混合，超声1h后，离心分离，可得检测抗体修饰的AuPd-PDA纳米结构，将之分散到1mLPBS缓冲液（10mM）中，Ab2-AuPd-PDA浓度为100 μg/mL，记为Ab2-AuPd-PDA溶液，备用。
3、电化学免疫传感器的制备
（1）铂碳电极的预处理：通过电沉积的方法将氧化石墨烯量子点(1mg/mL，南京先锋纳米材料科技有限公司，货号100082)沉积到铂碳电极表面（-2.8V，5min）得到一层氧化石墨烯颗粒；
（2）然后通过电泳沉积的方法（-1.0V，15min）将步骤1制得的金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯颗粒上，用超纯水冲洗后，4℃冰箱里晾干；
（3）继续在电极表面滴加10μL捕获抗体（Ab1， 100μg/mL，厂家abcam，型号：ab1907），37℃，孕育1h，然后用超纯水冲洗后，4℃冰箱里晾干；
（4）滴加10μL1mg/mL的BSA溶液，封闭非特异性结合位点，37℃，孕育1h，然后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱里晾干。
（5）滴加5μL0.01-20000ng/mL的疾病标志物载脂蛋白E4(厂家：北京拜尔迪生物技术有限公司；型号：350-04，配制系统浓度的抗原溶液时以10 mM的pH为7.4的磷酸缓冲液为溶剂)，37℃，孕育1h，用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱里晾干；
（6）将步骤2中配制的Ab2-AuPd-PDA溶液（100 μg/mL）5μL滴涂于电极表面，37℃，孵化1h，用超纯水冲洗电极表面后，在4℃冰箱中晾干，制得一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学米免疫传感器。
实施例2
阿尔茨海默症标志物ApoE4的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极（实施例1中步骤（5）中疾病标志物载脂蛋白E4溶液浓度为1ng/mL），在20 mL、10 mM的pH为7.4的磷酸缓冲液中进行测试；
（2）用时间-电流法检测过氧化氢的电流响应值，输入电压为-0.2V，取样间隔为0.1s，运行时间600 s；
（3）当背景电流稳定后，每隔50s向20 mL、10 mM的pH为7.4的磷酸缓冲液中滴入20μL1M的过氧化氢溶液，记录电流变化。
实施例3
制备传感器的性能分析
为了评估所制备电化学免疫传感器的性能，对以pH为7.4的磷酸缓冲液配制的不同浓度的ApoE4标准品（浓度依次为0.1、1、10、100、1000、10000、20000 ng/mL）制备不同的免疫传感器进行分析。通过时间电流法测试不同浓度标准品对应的电流变化值，并绘制标准曲线，（如图4所示，ΔI=18.191LgC+200.78; R2=0.9841）如图4所示。本发明的传感器对阿尔茨海默症标志物ApoE4检测的检测限为0.03 ng/mL (S/N性噪比为3) ，线性范围0.1 ng/mL-2 μg/mL。
实施例4
制备传感器的特异性分析
将牛血清白蛋白（BSA，10 μM）、磷酸缓冲液（PBS，10μM）、载脂蛋白E2（10 μM）、载脂蛋白E3（10 μM）以及10 nM的载脂蛋白E4按照实施例的方法分别制备成不同的免疫传感器并均采用实施例2中的方法进行测定。结果如图5所示，由图5可知，在待测物ApoE4浓度远低于其他样品时，其信号仍远高于其他样品。说明，本发明制备的传感器具有良好的特异性。
Claims (10)
1.一种AuPd-PDA纳米结构，其特征在于，通过下述步骤制得：
（1）取 ZnO纳米棒超声分散于Tris-HCl缓冲液中，随后加入多巴胺盐酸盐，60 ±5℃搅拌3.5~4.5h；离心分离，收集固体得到ZnO@PDA纳米棒；最后，将ZnO@PDA纳米棒分散于超纯水中，加入NH4Cl 溶液60 ±5℃搅拌0.5~1.5h用以刻蚀ZnO纳米棒，得到PDA纳米管，ZnO纳米棒与多巴胺盐酸盐的质量比为1:1；
（2）将0.4-2 mL HAuCl4 和 0.1-0.5 mL H2PdCl4 加入煮沸的PDA纳米管水溶液中，搅拌，然后加入抗坏血酸溶液，反应50~70分钟后，离心分离，收集固体得AuPd-PDA纳米结构。
2.根据权利要求1所述的AuPd-PDA纳米结构，其特征在于，所述ZnO纳米棒的具体制备过程如下：将硝酸锌和氢氧化钠溶解在30 mL超纯水中，使得硝酸锌的浓度为0.5M，氢氧化钠浓度为10M；然后依次加入25 mL 乙醇和5 mL乙二胺；然后180 ℃水热反应 20 h，收集固体，即得。
3.根据权利要求1所述的AuPd-PDA纳米结构，其特征在于，所述步骤（1）中ZnO纳米棒的用量为10mg，Tris-HCl的浓度为10mM、用量为20mL，NH4Cl 溶液的浓度为0.1M，用量为10mL。
4.一种利用权利要求1所述的AuPd-PDA纳米结构制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，其特征在于，制备步骤如下：
（1）将ApoE4检测抗体与AuPd-PDA纳米结构混合，超声50~70min后，离心分离，可得检测抗体修饰的AuPd-PDA纳米结构，分散至PBS缓冲液，记为Ab2-AuPd-PDA溶液，备用；
（2）铂碳电极的预处理：通过电沉积的方法将氧化石墨烯量子点沉积到铂碳电极表面得到一层氧化石墨烯颗粒；
（3）然后通过电泳沉积的方法将金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯颗粒上，用超纯水冲洗后，晾干；
（4）步骤（3）得到的电极表面滴加捕获抗体，孕育，然后用超纯水冲洗后，晾干；
（5）滴加的BSA溶液封闭非特异性结合位点，孕育，然后用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（6）滴加0.01-20000ng/mL的疾病标志物ApoE4溶液，孕育，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（7）将Ab2-AuPd-PDA溶液滴涂于电极表面，孵化，用超纯水冲洗电极表面后，晾干，制得一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器。
5.根据权利要求4所述制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，其特征在于，所述金双锥包铂纳米结构，通过下述步骤制得：
种子生长法制备金纳米双锥溶液，将2mL的金纳米双锥溶液离心，将沉淀分散于2mL、0.08M CTAC中，依次加入10μL、0.01M AgNO3、5μL、0.1M抗坏血酸后混匀，60℃摇床放置5小时，离心后，分散于2mL、0.005M CTAB中，再依次加入2-30μL、0.001M H2PtCl4、2-30μL、0.01M抗坏血酸混匀后，搅拌反应8~12h，离心后，分散于2mL水中可得金双锥包铂纳米结构。
6.根据权利要求4所述制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程如下：将100μL、1mg/mL ApoE4的检测抗体与1mL、1mg/mLAuPd-PDA纳米结构混合，超声1h后，离心分离，可得检测抗体修饰的AuPd-PDA纳米结构，分散到1mL、10mM PBS缓冲液中，备用。
7.根据权利要求4所述制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，其特征在于，步骤（2）中氧化石墨烯量子点的浓度为1mg/mL，在-2.8V沉积5min；所述步骤（3）中在-1.0V沉积15min；所述步骤（4）中捕获抗体的浓度为100μg/mL，用量为10μL，所述步骤（5）中BSA溶液浓度为1mg/mL 、用为10μL；所述步骤（6）疾病标志物ApoE4溶液的用量为5μL，所述步骤（7）中Ab2-AuPd-PDA溶液浓度为100 μg/mL，用量为5μL。
8.根据权利要求4所述制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，其特征在于，所述孕育或孵化是指在37℃保持1h，所述，晾干是在4℃冰箱中进行。
9.权利要求4所述的方法制得的检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器。
10.权利要求4所述的电化学免疫传感器在检测阿尔茨海默症标志物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20 mL、10 mM的pH为5.5-7.8的磷酸缓冲液中进行测试；
（2）用时间-电流法检测过氧化氢的电流响应值，输入电压为-0.2V，取样间隔为0.1s，运行时间600 s；
（3）当背景电流稳定后，每隔50s向20 mL、10 mM的pH为5.5-7.8的磷酸缓冲液中滴入20μL 1M的过氧化氢溶液，记录电流变化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910399480.6A CN110006976B (zh) | 2019-05-14 | 2019-05-14 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910399480.6A CN110006976B (zh) | 2019-05-14 | 2019-05-14 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110006976A true CN110006976A (zh) | 2019-07-12 |
| CN110006976B CN110006976B (zh) | 2021-06-15 |
Family
ID=67176884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910399480.6A Expired - Fee Related CN110006976B (zh) | 2019-05-14 | 2019-05-14 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110006976B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111060569A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-24 | 黄河科技学院 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学适配体传感器、其制备方法及应用 |
| CN112525962A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-03-19 | 深圳大学 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪 |
| CN113311160A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-08-27 | 山东科讯生物芯片技术有限公司 | 快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009155A1 (en) * | 1992-10-13 | 1994-04-28 | Duke University | Methods of detecting alzheimer's disease |
| CN103639407A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-19 | 苏州大学张家港工业技术研究院 | 一种三金属纳米粒子及其制备方法 |
| CN103675062A (zh) * | 2013-12-18 | 2014-03-26 | 济南大学 | 一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN108746595A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-06 | 黄河科技学院 | 一种不同形貌金纳米双锥-金银纳米复合材料及其制备方法 |
| CN109115855A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-01-01 | 山东理工大学 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
-
2019
- 2019-05-14 CN CN201910399480.6A patent/CN110006976B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009155A1 (en) * | 1992-10-13 | 1994-04-28 | Duke University | Methods of detecting alzheimer's disease |
| CN103639407A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-19 | 苏州大学张家港工业技术研究院 | 一种三金属纳米粒子及其制备方法 |
| CN103675062A (zh) * | 2013-12-18 | 2014-03-26 | 济南大学 | 一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN108746595A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-06 | 黄河科技学院 | 一种不同形貌金纳米双锥-金银纳米复合材料及其制备方法 |
| CN109115855A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-01-01 | 山东理工大学 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GUANGLI HE等: "Electrochemical sensing of H2O2 released from living cells based on AuPd alloy-modified PDA nanotubes", 《ANAL. METHODS》 * |
| JIA ZHANG等: "Preparation of graphene oxide-based surface plasmon resonance biosensor with Au bipyramid nanoparticles as sensitivity enhancer", 《COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111060569A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-24 | 黄河科技学院 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学适配体传感器、其制备方法及应用 |
| CN112525962A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-03-19 | 深圳大学 | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪 |
| CN113311160A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-08-27 | 山东科讯生物芯片技术有限公司 | 快速检测SARS-CoV-2抗原和IgG/IgM抗体的微流控生物芯片 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110006976B (zh) | 2021-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Multisegment nanowire/nanoparticle hybrid arrays as electrochemical biosensors for simultaneous detection of antibiotics | |
| CN108802133B (zh) | 一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Vidotti et al. | Biosensors based on gold nanostructures | |
| Huang et al. | A disposable electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on nano-Au/multi-walled carbon nanotubes–chitosans nanocomposite film modified glassy carbon electrode | |
| Zhang et al. | A novel electrochemical immunosensor based on nonenzymatic Ag@ Au-Fe3O4 nanoelectrocatalyst for protein biomarker detection | |
| CN101980018B (zh) | 用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法 | |
| CN110006976A (zh) | 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用 | |
| Lv et al. | The label-free immunosensor based on rhodium@ palladium nanodendrites/sulfo group functionalized multi-walled carbon nanotubes for the sensitive analysis of carcino embryonic antigen | |
| Liu et al. | Electrochemical immunosensor for salbutamol detection based on CS-Fe3O4-PAMAM-GNPs nanocomposites and HRP-MWCNTs-Ab bioconjugates for signal amplification | |
| Ali et al. | Intracellular K $^+ $ Determination With a Potentiometric Microelectrode Based on ZnO Nanowires | |
| CN108918853B (zh) | 一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Mishra et al. | Bio-functionalized Pt nanoparticles based electrochemical impedance immunosensor for human cardiac myoglobin | |
| CN111999363B (zh) | 一种用于kim-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和使用方法 | |
| Shu et al. | Ultrasensitive label-free electrochemiluminescence immunosensor based on N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol-functionalized graphene composite | |
| Nong et al. | An ultrasensitive electrochemical immunosensor based on in-situ growth of CuWO4 nanoparticles on MoS2 and chitosan-gold nanoparticles for cortisol detection | |
| Zhang et al. | An oriented antibody immobilization based electrochemical platform for detection of leptin in human with different body mass index | |
| CN106483281A (zh) | 用于sCD40L检测的可再生电化学免疫传感器制备方法 | |
| Jiang et al. | A simple paper-based dual-analyte electrochemical nanobiosensor for mycotoxins using phosphorene-gold nanocomposites | |
| Li et al. | Label-free detection of glypican-3 using reduced graphene oxide/polyetherimide/gold nanoparticles enhanced aptamer specific sensing interface on light-addressable potentiometric sensor | |
| Huang et al. | MXene-incorporated C60NPs and Au@ Pt with dual-electric signal outputs for accurate detection of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 antigen | |
| Beiki et al. | Design of a novel electrochemical aptasensor based on molybdenum disulfide nanosheets for lysozyme detection | |
| CN107621492B (zh) | 用于α2,3唾液酸化聚糖检测的生物传感器制备方法 | |
| KR20110002293A (ko) | 보론산이 수식된 전극을 이용한 당화단백질의 전기화학적 측정방법 | |
| Li et al. | A dual-signal output electrochemical aptasensor for glypican-3 ultrasensitive detection based on reduced graphene oxide-cuprous oxide nanozyme catalytic amplification strategy | |
| Sun | Sensitive electrochemical immunoassay with signal enhancement based on nanogold-encapsulated poly (amidoamine) dendrimer-stimulated hydrogen evolution reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221229 Address after: No. 7-03, Zhenghang Science Park, No. 7, South University Road, Changjiang Road Street, Erqi District, Zhengzhou City, Henan Province, 450,000 Patentee after: Zhengzhou Senwang Smart Catering Management Co.,Ltd. Address before: 450005 No. 94 Hanghai Middle Road, Erqi District, Zhengzhou City, Henan Province Patentee before: HUANGHE S & T College |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210615 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |