CN112525962A - 一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪 - Google Patents

一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪。所述电化学核酸适配体传感器的制备方法，包括：将三水氯金酸溶液和六水氯铂酸溶液混合，得到混合液；以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，玻碳电极为工作电极搭建沉积三电极体系，将所述沉积三电极体系置于所述混合溶液中通过电化学工作站进行电化学沉积，得到表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极；在所述表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极表面滴加核酸适配体进行孵育，制备得到所述电化学核酸适配体传感器。本发明所述电化学核酸适配体传感器具有高灵敏度、高特异性、成本低廉、检测速度快等优点。

Description

一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、 制备方法、测试方法、检测仪
技术领域
本发明涉及传感技术领域，尤其涉及一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪。
背景技术
目前对于阿尔茨海默症生物标志物的检测方法有很多，如放射免疫分析法、电化学发光法、比色法等等，但多数检测方法繁琐、操作复杂、设备及费用昂贵、检测限高，因此建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪，旨在解决现有阿尔茨海默症生物标志物检测传感器检测限高的问题。
一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，包括：
将三水氯金酸溶液和六水氯铂酸溶液混合，得到混合液；
以玻碳电极为工作电极，将所述工作电极与参比电极、辅助电极搭建沉积三电极体系，利用电化学工作站使所述沉积三电极体系在所述混合溶液中进行电化学沉积，得到表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极；
在所述表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极上滴加核酸适配体进行孵育，制备得到所述电化学核酸适配体传感器。
所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，所述玻碳电极为预处理后的玻碳电极；
所述预处理后的玻碳电极通过如下步骤制备得到：
将玻碳电极采用抛光绒布进行研磨，其中，抛光绒布上分布有氧化铝粉末；
以玻碳电极为工作电极，将所述工作电极与参比电极、辅助电极搭建清洗三电极体系，将所述清洗三电极体系置于硫酸溶液中，利用电化学工作站循环伏安法对玻碳电极进行清洗，得到预处理后的玻碳电极。
所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，所述三水氯金酸溶液的浓度为10mmol/L，所述六水氯铂酸溶液的浓度为10mmol/L。
所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，所述核酸适配体的序列为：
CAGCACCGTCAACTGAATGGGTTGGCCGGGCAGCGGGGGGTAGGCTTGGTGATGCGATGGAGATGT。
所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，在所述电化学沉积过程中，电化学工作站采用时间-电流程序，电压设置为-0.2V～-0.6V。
所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述辅助电极为铂电极。
一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器，其中，包括：玻碳电极、包覆在所述玻碳电极上的金铂纳米结构层、结合在所述金铂纳米结构层上的适配体。
一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的电流响应测试方法，其中，包括：
在如上所述电化学核酸适配体传感器上滴加疾病标志物溶液，得到捕获疾病标志物的电化学核酸适配体传感器；
使用电化学工作站，以所述捕获疾病标志物的电化学核酸适配体传感器为工作电极，将所述工作电极与参比电极、辅助电极搭建测试三电极体系，在二茂铁甲醇溶液中用示差脉冲法检测电流响应值。
所述检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的电流响应测试方法，其中，所述疾病标志物溶液为T-tau蛋白溶液。
一种检测阿尔茨海默症标志物的检测仪，其中，包括如上所述检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器。
有益效果：本发明所述电化学核酸适配体传感器是基于电信号强弱确定标志物浓度的一类检测装置，结合了高特异性免疫分析技术和高灵敏、反应时间短的电化学分析技术的优势，兼具了高灵敏度、高特异性、易于修饰和功能化、成本低廉、检测速度快等优点。
附图说明
图1为本发明制备的金铂纳米结构的扫描电镜图。
图2为本发明实施例制备的电化学核酸适配体传感器的检测性能分析图。
具体实施方式
本发明提供一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器、制备方法、测试方法、检测仪，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其中，包括：
S100、将三水氯金酸溶液和六水氯铂酸溶液混合，得到混合液；
S200、以玻碳电极为工作电极与参比电极、辅助电极搭建沉积三电极体系，利用电化学工作站使所述沉积三电极体系在所述混合溶液中进行电化学沉积，得到表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极；
S300、在所述表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极上滴加核酸适配体进行孵育，制备得到所述电化学核酸适配体传感器。
本发明构建的电化学核酸适配体传感器是基于电信号强弱确定标志物浓度的一类检测装置，具有以下优点：其一是采用的金铂纳米结构修饰电极表面，减少检测过程中的非特异性吸附；其二是利用价格低廉、易合成的核酸适配体捕获目标物，降低成本。
(1)本发明制备的金铂纳米结构，大大增加了基底材料的比表面积，保持强大的电子传输能力，同时有良好的生物相容性，能有效与核酸适配体结合，实现捕获适配体的固载；而且，大表面积的所述金铂纳米结构，能够减少非特异性吸附，对于提高传感器的灵敏度具有重要意义。
(2)检测适配体无需标签，目标物浓度的大小变化能直接改变电极的电阻，能直接通过电流大小反映出来。
(3)本发明制备的电化学核酸适配体传感器对阿尔茨海默症标志物t-tau的检测范围为0.1pg/mL-100ng/mL。
所述S100是制备一种用于在S200进行电化学沉积的混合液，所述混合液中含有金离子和铂离子。在本发明的一个实施方式中，所述三水氯金酸溶液的浓度为10mmol/L，所述六水氯铂酸溶液的浓度为10mmol/L，能够获得稳定的混合液，并有利于沉积得到金铂纳米结构。
本发明实施例在将所述玻碳电极作为工作电极进行电化学沉积之前，还包括去除电极表面的杂质，得到干净光滑的电极表面。也即是，所述玻碳电极为预处理后的玻碳电极。
在本发明的一个实施方式中，所述玻碳电极为预处理后的玻碳电极；
预处理后的玻碳电极通过如下步骤制备得到，包括：
S201、将玻碳电极采用抛光绒布进行研磨，其中，抛光绒布分布有氧化铝粉末；
S202、以玻碳电极为工作电极与参比电极、辅助电极搭建清洗三电极体系，将所述清洗三电极体系置于的硫酸溶液中，利用电化学工作站的循环伏安法清洗玻碳电极，得到预处理后的玻碳电极。
所述S201中具体包括：在抛光绒布上撒适量0.3micron(0.3μm)和0.05micron的氧化铝粉末，再加适量水，分别得到撒有0.3micron氧化铝粉末的抛光绒布和撒有0.05micron氧化铝粉末的抛光绒布；
将玻碳电极置于撒有0.3micron氧化铝粉末的抛光绒布上进行研磨(摩擦)，接着用撒有0.05micron的氧化铝粉末进行研磨，用超声波清洗仪清洗5min，超声清洗2遍。
所述S202具体包括：使用电化学工作站以三电极体系清洗，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，玻碳电极为工作电极，将三电极体系置于0.5mmol/L的H2SO4中，利用电化学工作站的循环伏安法，电压为0～1.6V清洗电极直至扫描曲线几乎重合。
所述S201中，先通过颗粒(粒径大小)0.3μm的氧化铝粉末粗抛，去除电极表面的杂质；再用颗粒更小的0.05μm氧化铝粉末研磨玻碳电极，进行细抛，去除杂质的同时使电极表面变得平整光滑。
所述S202中是去除上述S201中操作过程中存留下来的可能杂质，并检验电极是否已经被打磨好。
所述S200中，使用电化学工作站，采用以玻碳电极为工作电极与参比电极、辅助电极搭建沉积三电极体系，将三电极体系置于Au Pt混合溶液中进行沉积，使玻碳电极表面沉积AuPt纳米结构，得到表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极。
如图1所示，所述金铂纳米结构是一种混合金属的纳米结构，所述混合金属的纳米结构可以在维持传感器生物相容性的同时，能降低生物标志物测量过程中非特异性物质的吸附。
在本发明的一个实施方式中，在所述电化学沉积过程中，电化学工作站的电压设置为-0.2V～-0.6V，沉积时间：300s～600s。上述参数能让玻碳电极表面形成的混合金属纳米结构的抗非特异性吸附能力更佳。
所述S300是在金铂纳米结构上结合核酸适配体。通过在表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极上滴加核酸适配体溶液，37℃孵育1h，可以得到电化学核酸适配体传感器。
具体地，所述S300包括：
S301、将已沉积纳米结构的玻碳电极用超纯水冲洗后作为工作电极搭建三电极体系，置于电化学工作站中，采用循环伏安法(CV)，在5mmol/L铁氰化钾中，在-0.2V～0.6V的电压范围内，扫描三个循环，用超纯水冲洗工作电极，晾干；
S302、在电极表面滴加20μL核酸适配体，37℃孵育1h；
S303、将已结合核酸适配体的玻碳电极用用磷酸缓冲盐溶液(PBS，phosphatebuffer saline)冲洗后作为工作电极搭建三电极体系，置于电化学工作站中，采用循环伏安法(CV)，5mmol/Lol铁氰化钾中，在-0.2V～0.6V的电压范围内，扫描三个循环，用纯水冲洗，晾干。
其中，所述铁氰化钾溶液用于在一定的电压范围内，产生氧化电流和还原电流。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸适配体的序列为：CAGCACCGTCAACTGAATGGGTTGGCCGGGCAGCGGGGGGTAGGCTTGGTGATGCGATGGAGATGT。
本发明实施例所述核酸适配体与传统的适配体不同。本发明所述核酸适配体通过-SH在金铂纳米结构表面自组装固定DNA，该纳米结构的高生物亲和性有利于Au-S键的形成。
具体地，Au-S键的形成过程发生的反应：
R-SH+Au→R-S·-Au+e-+H+
可见，所述Au-S键的形成过程实现了将适配体固定在玻碳电极表面。
本发明所述核酸适配体通过金硫键与电极表面的金铂纳米结构结合，从而使适配体固定于电极表面。在本发明的一个实施方式中，所述孵育的温度为37℃。
在本发明的一个实施方式中，所述参比电极为Ag/AgCl电极(银/氯化银电极)，所述辅助电极为铂电极。所述银/氯化银电极具有较高的精确度并且耐用的特点。所述辅助电极的作用是与研究电极组成极化回路，使研究电极有电流通过。所述铂电极本身的电阻小，并且不容易发生极化。
本发明还提供一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器，其中，包括：玻碳电极、包覆在所述玻碳电极上的金铂纳米结构层、结合在所述金铂纳米结构层上的适配体。
本发明所述电化学核酸适配体传感器可以通过本发明所述电化学核酸适配体传感器的制备方法制备得到的。所述电化学核酸适配体传感器中，所述核酸适配体通过金硫键与电极表面的金铂纳米结构结合，从而使适配体固定于玻碳电极表面。
本发明提供一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的电流响应测试方法，其中，包括：
S400、在如上所述电化学核酸适配体传感器上滴加疾病标志物溶液，得到捕获疾病标志物的电化学核酸适配体传感器；
S500、使用电化学工作站，采用以所述捕获疾病标志物的电化学核酸适配体传感器为工作电极与参比电极、辅助电极搭建测试三电极体系，在二茂铁甲醇溶液中用示差脉冲法检测电流响应值。
利用所述电流响应测试方法可以获得电化学核酸适配体传感器的电流响应值，检测标准曲线，以及电化学核酸适配体传感器的校准。
所述S400中具体是，在所述电化学核酸适配体传感器的表面滴加疾病标志物蛋白，静置(孵育)1h，使蛋白能够被适配体捕获。
在本发明的一个实施方式中，所述疾病标志物溶液为T-tau蛋白溶液。
所述S500中，捕获了疾病标志物蛋白的传感器会将疾病标志物蛋白的浓度大小通过电流信号表现出来，从而达到检测疾病标志物浓度的目的。其中，所述参比电极为Ag/AgCl，所述辅助电极为铂丝电极。
在本发明的一个实施方式中，所述二茂铁甲醇溶液的浓度为1mmol/L。
在本发明的一个实施方式中，所述用示差脉冲法检测电流响应值的过程中，参数设置初始电压为0V，最终电压为0.4V。
本发明提供一种检测阿尔茨海默症标志物的检测仪，其中，包括如上所述检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器。
具体地，所述检测阿尔茨海默症标志物的检测仪包括：二茂铁甲醇溶液、位于二茂铁甲醇溶液中三电极体系、与所述三电极体系连接的电化学工作站；其中，所述三电极体系包括参比电极、辅助电极和作为工作电极的电化学核酸适配体传感器。
本发明构建的电化学核酸适配体传感器是基于电信号强弱确定标志物浓度的一类检测装置，结合了高特异性免疫分析技术和高灵敏、反应时间短的电化学分析技术的优势，兼具了高灵敏度、高特异性、易于修饰和功能化、成本低廉、检测速度快等优点。因此，所述电化学核酸适配体传感器在化学、生物医学、食品安全等领域具有重要的应用价值。
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。
实施例1
1.将10mmol/L三水氯金酸溶液和10mmol/L六水氯铂酸溶液以一定比例混合，形成金铂的混合液，备用；
2.玻碳电极的预处理：
在抛光绒布上撒适量0.3micron的氧化铝粉末，再加适量水，将玻碳电极置于撒有0.3micron的氧化铝上研磨，接着用撒有0.05micron的氧化铝的抛光绒布上进行研磨，用超声波清洗仪清洗5min，清洗2遍。
使用电化学工作站以三电极体系清洗，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，玻碳电极为工作电极，将三电极体系置于0.5mmol/L的H2SO4中，利用电化学工作站的循环伏安法，0～1.6V清洗电极直至扫描曲线几乎重合。
3.纳米结构的制备：使用电化学工作站，采用三电极体系，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，已处理过的玻碳电极为工作电极，将三电极体系置于Au Pt混合溶液中，采用电化学工作站中的时间-电流程序，使玻碳电极表面沉积金铂纳米结构。其中，沉积过程的参数设置：电压：-0.2V～-0.6V；沉积时间：400s。
4.电化学核酸适配体传感器的制备：已沉积纳米结构的玻碳电极用超纯水冲洗后，置于电化学工作站中，采用循环伏安法(CV)，搭建三电极体系置于5mmol/L铁氰化钾中，在-0.2V～0.6V的电压范围内，扫描三个循环，用超纯水冲洗工作电极，晾干。在电极表面滴加20μL适配体，37℃孵育1h，用PBS冲洗后搭建三电极体系置于电化学工作站中，搭建三电极体系置于5mmol/L铁氰化钾，在-0.2V～0.6V的电压范围内，扫描三个循环，用纯水冲洗，晾干，即完成核酸适配体的修饰。
5.滴加10μL 0.1～100000pg/mL(如，400pg/mL)的疾病标志物T-tau蛋白溶液，37℃孵育1h，用PBS冲洗电极表面，晾干，制得一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器。
6.检测：
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20mL、1mmol/L的二茂铁甲醇溶液中用示差脉冲法(DPV)检测电流响应值进行检测；参数设置初始电压为0V，最终电压为0.4V。
图2为本发明实施例制备的电化学核酸适配体传感器的检测性能分析图(标准曲线图)。本发明所述电化学核酸适配体传感器具有高灵敏度、高特异性的特点，能够用于检测阿尔茨海默症生物标志物。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括：
将三水氯金酸溶液和六水氯铂酸溶液混合，得到混合液；
以玻碳电极为工作电极，将所述工作电极与参比电极、辅助电极搭建沉积三电极体系，利用电化学工作站使所述沉积三电极体系在所述混合溶液中进行电化学沉积，得到表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极；
在所述表面沉积金铂纳米结构的玻碳电极上滴加核酸适配体进行孵育，制备得到所述电化学核酸适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述玻碳电极为预处理后的玻碳电极；
所述预处理后的玻碳电极通过如下步骤制备得到：
将玻碳电极采用抛光绒布进行研磨，其中，抛光绒布上分布有氧化铝粉末；
以玻碳电极为工作电极，将所述工作电极与参比电极、辅助电极搭建清洗三电极体系，将所述清洗三电极体系置于硫酸溶液中，利用电化学工作站循环伏安法对玻碳电极进行清洗，得到预处理后的玻碳电极。
3.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述三水氯金酸溶液的浓度为10mmol/L，所述六水氯铂酸溶液的浓度为10mmol/L。
4.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述核酸适配体的序列为：
CAGCACCGTCAACTGAATGGGTTGGCCGGGCAGCGGGGGGTAGGCTTGGTGATGCGATGGAGATGT。
5.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，在所述电化学沉积过程中，电化学工作站采用时间-电流程序，电压设置为-0.2V～-0.6V。
6.根据权利要求1所述的检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述辅助电极为铂电极。
7.一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器，其特征在于，包括：玻碳电极、包覆在所述玻碳电极上的金铂纳米结构层、结合在所述金铂纳米结构层上的适配体。
8.一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的电流响应测试方法，其特征在于，包括：
在如权利要求7所述电化学核酸适配体传感器上滴加疾病标志物溶液，得到捕获疾病标志物的电化学核酸适配体传感器；
使用电化学工作站，以所述捕获疾病标志物的电化学核酸适配体传感器为工作电极，将所述工作电极与参比电极、辅助电极搭建测试三电极体系，在二茂铁甲醇溶液中用示差脉冲法检测电流响应值。
9.根据权利要求8所述检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器的电流响应测试方法，其特征在于，所述疾病标志物溶液为T-tau蛋白溶液。
10.一种检测阿尔茨海默症标志物的检测仪，其特征在于，包括如权利要求7所述检测阿尔茨海默症标志物的电化学核酸适配体传感器。
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杨绍明等: "以聚硫堇为电化学探针的非标记型核酸适配体传感器", 《高等学校化学学报》 *

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