CN111999363B - 一种用于kim-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本方案公开了蛋白的检测技术领域中的一种用于KIM‑1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，包括：上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti3C2TX MXene分散液结合制成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，在所述PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合有标记抗体；下层复合物：所述下层复合物为修饰后的电极，所述修饰后的电极为利用CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰的电极，在所述修饰后的电极上结合有捕获抗体；检测体系：所述检测体系为含有H2O2的PBS溶液。本方案实现了蛋白的无酶检测，解决了现有技术中检测成本高，操作复杂，灵敏度低，特异性差等问题。

Description

一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和 使用方法
技术领域
本发明属于蛋白的检测技术领域，特别涉及一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统及其制备和使用方法。
背景技术
急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一种治疗成本高、死亡率高的临床住院疾病。目前，AKI的标准诊断工具是监测尿量和血清肌酐(sCr)。然而，两者都是肾功能的标志物，而不是肾脏损伤的标志物。此外，因为尿量和sCr容易受到肌肉质量、年龄、性别和饮食等因素的影响，从而限制了尿量和sCr在诊断AKI方面的应用。最近的证据表明，尿肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,KIM-1)蛋白是AKI的一个潜在标志物，可快速、无创地反映肾脏损伤和恢复过程。因此，开发可靠、灵敏度高的KIM-1蛋白检测方法对临床诊断和治疗具有重要意义。酶联免疫吸附试验(ELISA)是用于检测KIM-1蛋白的主要方法，还有一些其他基于小众技术平台的检测方法，包括表面等离子体共振成像(SPRi)和Luminex。然而，这些技术在实践中仍面临许多挑战，例如需要复杂、昂贵的仪器，检测灵敏度低，使用昂贵的生物酶等。传统的电化学免疫检测系统大多需要生物酶作为催化剂，其存在不稳定、易失活的缺点，很难在保证生物酶活性的同时实现信号级联放大。
因此，发展一种灵敏度高、特异性好、重复性好、检测成本低的无酶电化学免疫检测方法，可以有效扩大KIM-1在临床检验诊断中的应用范围，对AKI的早期诊断和治疗具有较大意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，用于解决现有技术中检测成本高，操作复杂，灵敏度低，特异性差等问题。
本方案中的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，包括：
上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti3C2TX MXene分散液结合制成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，所述PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合有标记抗体；
下层复合物：所述下层复合物为修饰后的电极，所述修饰后的电极为利用CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰的电极，所述修饰后的电极上结合有捕获抗体；
检测体系：所述检测体系为含有H2O2的PBS溶液。
进一步，所述含有H2O2的PBS溶液中H2O2的浓度为4mmol/L。
制备一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的方法，包括以下步骤：
步骤一、上层复合物的制备：
(1)合成PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液：称取120mg的双十八烷基二甲基氯化铵在40mL去离子水中充分溶解得到悬液；然后，将浓度为0.337mol/L的NH4F溶液4mL、浓度为0.101mol/L的H3BO3溶液4mL、浓度为10mmol/L的H2PdCl4溶液2.56mL、浓度为10mmol/L的H2PtCl6溶液0.64mL加入到上述悬液中；混匀后于30℃孵育5分钟，加入1.6mL NH3·H2O溶液(10wt.％)混匀；再加入0.034mol/L的NaH2PO2·H2O溶液4mL，将混合物从30℃加热到95℃，并在95℃下保持20分钟，同时搅拌；最后，加入0.1mol/L新鲜制备的二甲胺基硼烷4mL，搅拌至混合物由白色完全变为深褐色后，在95℃的温度下保持30分钟后冷却至室温；离心收集深色产物，用体积比为1:1的乙醇/水洗涤3次，将产物分散在4mL去离子水中；
(2)准备聚多巴胺/Ti3C2TX MXene分散液：对Ti3C2TX MXene分散液进行1.5小时的超声处理，2000rpm离心5分钟，收集上清液0.5mL；将取得的上清液分散于5mL去离子水中，然后调至pH 8.0～9.0，缓慢加入1.0mg盐酸多巴胺，用磁力搅拌24小时，离心取沉淀，再用去离子水洗涤三次，得到聚多巴胺功能化的二维Ti3C2TX MXene纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到均相溶液；
(3)将1mL上述步骤一(1)中合成的PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液滴入上述步骤一(2)中的均相溶液中，磁力搅拌10～14h后，5000rpm离心5分钟，沉积物即为PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物均相溶液，并于4℃保存备用；
(4)、在PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合标记抗体：
取步骤一(3)合成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物均相溶液1mL，与1mL浓度为10μmol/L的标记抗体混合，在4℃下搅拌10～14h；离心丢弃未结合的标记抗体后，加入牛血清白蛋白阻断非特异性位点，然后进行离心取沉淀，在4℃条件下分散在1mL PBS溶液中即得上层复合物，备用；
步骤二、下层复合物的制备：
(1)准备电极、CuCl2纳米线溶液和1.0wt％的HAuCl4溶液，将CuCl2纳米线溶液滴在电极上，37℃烘干，然后置于1.0wt％HAuCl4溶液中，在-0.2V恒电势下作用30s，电沉积金后，采用去离子水清洗并室温干燥得到修饰后的电极；
其中，CuCl2纳米线溶液的制备是：将CuCl2 0.05g、硫脲0.05g和乙醇40mL加入到体积为50mL的瓶中，封瓶后，混合均匀，在室温下超声搅拌5分钟；离心收集白色产物为CuCl2纳米线，用水冲洗2次；称取CuCl2纳米线，然后将其溶解在30mL去离子水中既得CuCl2纳米线溶液；
(2)在步骤二(1)所述修饰后的电极表面滴加10μL浓度为10μg/mL的捕获抗体，37℃孵育1小时；然后用10μL浓度为10mg/mL的BSA溶液在37℃下封闭1小时；最后，用pH为7.4，浓度为0.01mmol/L PBS溶液冲洗即得所述下层复合物，并保存于4℃备用。
进一步，一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的制备方法，步骤二(1)中，在将CuCl2纳米线溶液滴在电极之前，先用铝粉对电极抛光10分钟，然后经去离子水超声波清洗后，用氮气冲洗，最后干燥。
一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法，包括以下步骤：
步骤一、取8μL不同浓度的KIM-1蛋白溶液滴于所述下层复合物的表面，在37℃孵育1小时后用0.01mmol/L的PBS冲洗，得到捕获了KIM-1蛋白的下层复合物；
步骤二、取所述上层复合物在37℃下滴于捕获了KIM-1蛋白的下层复合物表面，孵育1小时后用0.01mmol/L的PBS冲洗；然后于含有4mmol/L的H2O2的PBS溶液中使用电化学输出方法进行信号的输出。
进一步，一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法中，步骤二所述电化学输出方法为差分脉冲伏安法或方波伏安法或电流时间法。
介孔纳米粒子(Mesoporous nanoparticles,MNPs)比其本体纳米粒子表现出更好的催化性能，因为它们具有更大的表面积和可接近的介孔。此外，合金化贵金属可以改变表面电子态，从而大大提高催化性能。钯(Pd)是一种过渡金属，在还原和氧化反应中表现出较高的催化活性。同时，硼(B)、磷(P)等非金属元素对电化学氧还原反应(ORR)动力学的加速作用是众所周知的，因为B和P的多价电子会影响Pd的电子结构。Pd-铂(Pt)纳米分枝颗粒显著提高了对ORR和析氢反应(HER)的催化作用。此外，将PdPt与不同元素掺杂可能是实现更高ORR催化性能的有效策略。因此，得益于其独特的纳米结构和协同组成效应，本方案合成的四元金属/非金属PdPtBP合金MNPs在催化过氧化氢(H2O2)方面表现出了高效的性能。
Ti3C2TX MXene是一种新型的二维(2D)层状过渡金属碳化物/氮化物，具有高比表面积和高效的电子转移能力。然而，易氧化的特性限制了Ti3C2TX MXene在电化学生物传感器开发中的广泛应用。而聚多巴胺(Polydopamine,PDA)可能显著降低Ti3C2TX MXene分散液的易氧化性。更有趣的是，PDA可以提供有利于锚定纳米颗粒的胺基。
综上，本方案中首次利用PdPtBP介孔合金纳米颗粒和Ti3C2TX MXene分散液合成了高稳定性的纳米复合物——PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物(以下称：PdPtBPMNPs/MXene纳米复合物)，PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物对H2O2具有较强的催化活性，从而显著增强了本申请所设计的电化学免疫检测系统的电流信号。此外，PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物也可以在电化学免疫分析中偶联检测抗体。
进一步提高电化学传感器灵敏度的最重要方法之一是利用高导电性的纳米材料修饰电极。CuCl2纳米线(Nanowires,NWs)是一种新型的一维(1D)纳米材料，具有高化学稳定性和合成简单的特点。更重要的是，在本发明中发现，CuCl2纳米线作为电极改良剂具有良好的导电性。此外，众所周知，金纳米粒子(Gold nanoparticles,AuNPs)由于其良好的导电性和生物相容性已被用于制备各种生物传感器。所以在本新型电化学免疫检测系统中，首次结合CuCl2纳米线和AuNPs对电极进行修饰，在连接捕获抗体的同时保持很好的电极电流信号，获得满意的检测灵敏度。
综上，本研究以PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物作为上层复合物，提高信号检测灵敏度，CuCl2纳米线修饰电极，通过电极捕获的KIM-1蛋白后，还与本发明中的PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物结合，形成一种类似三明治型的电化学免疫检测系统，可以用于尿液KIM-1蛋白的检测。本方案将合成的四元金属/非金属PdPtBP合金MNPs加载在氨基功能化的Ti3C2TX MXene分散液表面，形成PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物，该纳米复合物能固定化标记抗体Ab2形成Ab2/PdPtBP MNPs/MXene(即在PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合标记抗体)，Ab2/PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物能够识别和附着抗原，高效催化H2O2使得检测环境具有较好的电信号传送性能，检测环境稳定性好。此外，本申请将CuCl2纳米线溶液滴在电极上，烘干后置于1.0wt％HAuCl4溶液中进行镀金，CuCl2纳米线的电导性强，而金纳米颗粒的不仅进一步提高了CuCl2纳米线的电导率，而且还使电极上能够固定捕获抗体Ab1。当KIM-1蛋白存在时，Ab2/PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物可以组装在修饰后的电极表面，将电化学信号放大输出，提高检测灵敏性。
综上所述，本发明所提供的电化学免疫检测系统，以CuCl2纳米线和金纳米颗粒(CuCl2NWs/AuNPs)为下层复合物，PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物为上层复合物，用于KIM-1蛋白的定量检测。使用PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物作为信号放大标记，显示出对H2O2还原的高催化能力，从而有效放大电流信号。而CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰电极，可以显著提高电极的电子转移效率。最后，所研制的电化学免疫检测系统具有良好的灵敏度、选择性、重复性和稳定性，也可作为检测其他蛋白标志物的无酶通用检测平台。
附图说明
图1为本发明一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的制备流程及检测原理示意图；
图2为验证本发明的实验中PdPtBP MNPs和PdPtBP/MXene的结构和组成分析；
图2中：(A)PdPtBP MNPs的TEM和粒径分布直方图；(B)PdPtBP MNPs的HRTEM图；(C)PdPtBP MNPs的HAADF-STEM图；(D)PdPtBP/MXene的HRTEM图；(E)PdPtBP/MXene的HAADF-STEM图。
图3为PdPtBP/MXene的EDS元素映射图；
图4(A)CuCl2 NWs的TEM图像和(B)EDS元素分析；
图5EIS(A)和CV(B)表征裸GCE(a),CuCl2 NWs/GCE(b),AuNPs/CuCl2 NWs/CCE(c),Ab1/AuNPs CuCl2 NWs/GCE(d),BSA/Ab1/AuNPs/CuCl2 NWs/GCE(e)、Ag/BSA/Ab1/AuNPsCuCl2NWs/GCE(f)；EIS测量频率范围为0.02Hz-100kHz，振幅为5mV，CV测量的扫描范围是-0.2V-0.6V vs.Ag/AgCl参比电极，扫描速率的0.15V/S。
图6新型电化学分析传感器的可行性分析；
图7新型电化学免疫检测系统的条件优化；
图8电化学免疫检测系统的线性和特异性；
图9电化学免疫检测系统的重复性和稳定性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
本申请中的英文缩写分别对应的中文是：
PdPtBP：钯铂硼磷；
PdPtBP MNPs：PdPtBP介孔纳米颗粒；
Ti3C2TX MXene：碳化钛稀层；
Ti3C2TX MXene-NH2：氨基功能化的Ti3C2TX MXene；
Ti3C2TX MXene分散液：碳化钛稀层分散液；
CuCl2 NWs：氯化铜纳米线；
PdPtBP MNPs/MXene：PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物；
AuNPs/CuCl2 NWs/GCE：CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰的电极；
Ab1：捕获抗体；
Ab2：标记抗体；
捕获抗体Ab1和标记抗体Ab2是两种单克隆抗体，均能够识别待测抗原并与之结合，区别在于：1.两种抗体针对的抗原决定簇不同；2.捕获抗体Ab1包被于下层电极上，用于捕获待测样本中的蛋白抗原；2.标记抗体Ab2包被于上层材料上，用于结合被捕获抗体捕获的抗原，如本申请中，标记抗体Ab2属于上层复合物的一部分，结合了PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物。
GCE：玻碳电极
Ab2/PdPtBP MNPs/MXene：上层复合物；
Ab1/AuNPs/CuCl2 NWs/GCE：下层复合物；
BSA：牛血清白蛋白；
PBS溶液：磷酸缓冲盐溶液；
HAADF-STEM：透射电镜；
EDS：能谱分析；
EIS：电化学阻抗谱；
CV：循环伏安法。
1、材料与方法
1.1材料
KIM-1蛋白抗原(Ag)购自Okaybio(南京，中国)，抗KIM-1抗体(Ab1、Ab2)购自MedixBiochemica(埃斯波，芬兰)。牛血清白蛋白(BSA，纯度≥98％)购自碧云天生物技术(上海，中国)。硼烷二甲胺络合物(DMAB)购自Acros Organics(赫尔，比利时)。双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)和四氯金酸(HAuCl4)购自的Alfa Aesar(沃德希尔，美国)。氯铂酸(H2PtCl6，8wt％H2O)购自Sigma-Aldrich(美国圣路易斯)。硼酸(H3BO3)购自生工生物(上海，中国)。氟化铵(NH4F)购自Greagent(上海，中国)。Ti3C2TX MXene纳米材料购自11科技有限公司(吉林，中国)。氯化钯(II)(PdCl2)、无水氯化铜(CuCl2)、次磷酸盐(NaH2PO2·H2O)、盐酸多巴胺、硫脲购自Adamas-beta(上海，中国)。氨水(NH3·H2O)、盐酸(HCl)和无水乙醇购置重庆川东化工有限公司。整个研究工作均使用分析纯试剂和超纯水(≥18MΩcm-1)。
1.2检测仪器
CHI 660E电化学工作站(上海,中国)，三电极体系：修饰的GCE作为工作电极，Ag/AgCl电极(饱和氯化钾溶液)作为参考电极和铂丝电极作为对电极。采用高分辨率透射电子显微镜(HRTEM，Talos F200X，美国)对纳米材料进行表征。
一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，包括：
上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与Ti3C2TX MXene分散液结合制成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，所述PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合有标记抗体；
下层复合物：所述下层复合物为修饰后的电极，所述修饰后的电极为利用CuCl2纳米线和金纳米颗粒修饰的电极，在所述修饰后的电极上结合有捕获抗体；
检测体系：所述检测体系为PBS溶液，且PBS溶液中含有浓度为4mmol/L的H2O2。
一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的制备方法，结合图1A和图1B所示，包括以下步骤：
步骤一、上层复合物：Ab2/PdPtBP MNPs/MXene的制备：
(1)合成PdPtBP MNPs溶液：称取120mg的双十八烷基二甲基氯化铵在40mL去离子水中充分溶解得到悬液；然后，将0.337mol/L的NH4F溶液4mL、0.101mol/L的H3BO3溶液4mL、浓度为10mmol/L的H2PdCl4溶液2.56mL、浓度为10mmol/L的H2PtCl6溶液0.64mL加入到上述悬液中；混匀后于30℃孵育5分钟后，加入1.6mL NH3·H2O溶液(10wt.％)；注入0.034mol/L的NaH2PO2·H2O溶液4mL，将混合物在油浴或者烤箱中从30℃加热到95℃，并在95℃下保持20分钟，同时搅拌；最后，加入0.1mol/L新鲜制备的硼烷二甲胺络合物4mL，搅拌至混合物由白色完全变为深褐色后，在95℃的温度下保持30分钟后冷却至室温；离心收集深色产物，用体积比为1:1的乙醇/水洗涤3次，将产物分散在4mL去离子水中；
(2)制备聚多巴胺/Ti3C2TX MXene分散液，采用低温(10～20℃)超声处理方法，对Ti3C2TX MXene分散液进行1.5小时的超声处理，2000rpm离心5分钟，收集上清液0.5mL；将取得的上清液分散于5mL去离子水中，然后调至pH 8.0～9.0后，缓慢加入1.0mg盐酸多巴胺，用磁力搅拌24小时，离心取沉淀，再用去离子水洗涤三次，得到聚多巴胺功能化的二维Ti3C2TX MXene纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到均相溶液；
(3)将1mL上述步骤一(1)中合成的PdPtBP MNPs溶液滴入上述步骤一(2)中的均相溶液中，磁力搅拌10～14h后，5000rpm离心5分钟，沉积物即为PdPtBP MNPs/MXene，将其溶解于1.5mL去离子水中得到PdPtBP MNPs/MXene均相溶液，并于4℃保存备用；
(4)、在PdPtBP MNPs/MXene上结合标记抗体：
取步骤一(3)合成的PdPtBP MNPs/MXene均相溶液1mL，与1mL浓度为10μmol/L的Ab2混合，在4℃下搅拌10～14h；离心丢弃未结合的Ab2后，加入BSA阻断非特异性位点，然后进行离心，在4℃条件下分散在1mL PBS溶液中即得上层复合物，备用；
步骤二、下层复合物：Ab1/AuNPs/CuCl2 NWs/GCE的制备：
(1)准备GCE、CuCl2纳米线溶液和1.0wt％的HAuCl4溶液，将CuCl2纳米线溶液滴在GCE上，37℃烘干，然后置于1.0wt％HAuCl4溶液中，在-0.2V恒电势下作用30s，电沉积金后，采用去离子水清洗并室温干燥得到修饰后的电极；
其中，CuCl2纳米线溶液的制备是：将CuCl2(0.05g)、硫脲(0.05g)和乙醇(40mL)加入到一瓶(体积为50mL)中，封瓶后，混合均匀，在室温下超声搅拌5分钟；离心收集白色产物为CuCl2 NWs，用水冲洗2次；称取CuCl2 NWs，然后将其溶解在30mL去离子水中既得CuCl2纳米线溶液；
(2)在步骤二(1)所述修饰后的GCE表面滴加10μL浓度为10μg/mL的Ab1，37℃孵育1小时；然后用10μL浓度为10mg/mL的BSA溶液在37℃下封闭1小时；最后，用pH为7.4，浓度为0.01mmol/L的PBS溶液洗即得所述Ab1/AuNPs/CuCl2 NWs/GCE，并保存于4℃备用。
若GCE表面有氧化物，在步骤二(1)中，在将CuCl2纳米线溶液滴在电极之前，先用铝粉对电极抛光10分钟，然后经去离子水超声波清洗后，用氮气冲洗干燥，达到净化的目的。
用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法，结合图1C所示，包括以下步骤：
步骤一、取8μL不同浓度的KIM-1蛋白溶液(标准溶液或尿液样本)滴于Ab1/AuNPs/CuCl2NWs/GCE表面，在37℃孵育1小时后用0.01mmol/L PBS冲洗Ab1/AuNPs/CuCl2 NWs/GCE的表面，得到捕获了KIM-1蛋白的下层复合物；
步骤二、取所述上层复合物在37℃下滴于捕获了KIM-1蛋白的下层复合物表面，孵育1小时后用0.01mmol/L PBS冲洗；然后于含有4mmol/L的H2O2的PBS溶液中使用差分脉冲伏安法进行信号的输出，所述差分脉冲伏安法的测量在0.15～0.85V的电位扫描下进行。
验证：
表征PdPtBP MNPs/MXene和CuCl2 NWs
高分辨率透射电镜(HRTEM)、STEM-EDS和高角度环形暗场(HAADF)-STEM表征确认PdPtBP MNPs/MXene的成功制备。如图2A所示，合成的PdPtBP MNPs为单分散球，平均尺寸约为44nm。HRTEM图像显示，PdPtBP MNPs形成了类似羊毛球分子结构的分形网络(图2B)。HAADF-STEM显示PdPtBP MNPs/MXene的形态(图2C)。通过在氨基功能化Ti3C2TX MXene表面构建稳定的Pd-N和Pt-N键，将准单分散PdPtBP MNPs加载到Ti3C2TX MXene-NH2上，PdPtBPMNPs/MXene上的PdPtBP MNPs也呈现典型的介孔形貌(图2D，E)。为了进一步显示PdPtBPMNPs/MXene杂合物的化学组成，我们进行了EDS元素映射分析。如图3所示，PdPtBP MNPs的元素组成为Pd、Pt、B和P，说明成功合成了四元金属/非金属PdPtBP MNPs。
采用HAADF-STEM和EDS元素分析对制备的CuCl2 NWs进行了表征。图4A为CuCl2 NWs的TEM图像，显示了长度不均匀(200～1700nm)、直径均匀(约38nm)的典型纳米线。此外，如图4B所示，元素峰表明纳米线的元素组成为Cu和Cl。
逐步修饰电极的电化学表征。
使用电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安法(CV)表征修饰电极的逐步制备过程，测量均在含有0.1M KCl、5mM K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]的溶液中进行。
EIS用于验证所提出的生物传感器的修饰过程和传感界面特性，半圆的直径代表电子转移电阻(Ret)。如图5A所示，未经过修饰的GCE的EIS呈现出一个相对较小的半圆(曲线a)。当GCE表面被CuCl2 NWs修饰时，阻抗值显著下降(曲线b)，这是由于CuCl2NWs具有显著的导电性。此外，在CuCl2 NWs修饰电极表面电沉积AuNPs后，电阻进一步下降(曲线c)，表明AuNPs膜也具有良好的导电性能。随后，Ab1组装在改性的GCE上，电子转移受限(曲线d)。经过BSA封闭(曲线e)和Ag结合(曲线f)后，阻抗值进一步显著增加。
利用CV进一步验证了逐步修饰电极氧化还原峰值电流的变化。如图5B所示,由于CuCl2NWs加速电子传递,修饰CuCl2 NWs电极的氧化还原峰与裸GCE相比显著增加(曲线a和曲线b)。电镀AuNPs后，进一步增强峰值电流(曲线c)。随后,由于蛋白质(Ab1和BSA)孵化在修饰电极上的孵育，氧化还原峰电流逐渐开始减少(曲线d和e)。最后，因为Ab1与KIM-1的结合，测量的峰值电流进一步下降(曲线f)。
综上，CV结果与EIS一致，证明该KIM-1电化学免疫检测系统制备成功。
新型电化学免疫检测系统的可行性分析
该电化学免疫检测系统采用差分脉冲伏安法(DPV)作为信号输出策略。如图6所示,当基于PdPtBP/MXene开发的电化学免疫检测系统与10ng/mL KIM-1孵育时，还原峰的DPV(曲线b)显著增加，明显高于0ng/mL KIM-1系统孵育时的DPV(曲线a)。这一结果表明,电化学免疫检测系统成功地检测到KIM-1蛋白质。
为了验证PdPtBP MNPs/MXene纳米复合物对在H2O2体系中的电化学优势，我们在该新型电化学免疫检测系统中比较了不同纳米材料(PdBP MNPs、PdPtBP MNPs和PdPtBPMNPs/MXene)作为信号标签后的信号输出。具体来说，制备的电极(BSA/Ab1/AuNPs/CuCl2NWs/GCE)先分别与相同浓度的KIM-1蛋白(10ng/mL)孵育，在与三种不同的与Ab2结合的纳米材料孵育。从图6中可以看出，PdBP MNPs电化学免疫检测系统产生了一个相对温和的电流信号(曲线c)，说明PdBP MNPs对H2O2具有适当的催化作用。此外，基于PdPtBP MNPs电化学免疫检测系统获得了相对较高的电流信号(曲线d)。最高的DPV信号出现于基于PdPtBPMNPs/MXene的电化学免疫检测系统(曲线b)。
新型电化学免疫检测系统的条件优化
如图7A所示，从PdPtBP MNPs/MXene两倍稀释开始，DPV电流值随着稀释倍数的增大逐渐减小。因此，以两倍稀释倍数作为电化学免疫检测系统的最佳反应稀释倍数。图7B显示，在8倍稀释时氧化还原电流峰值均达到最大值，因此，选择CuCl2 NWs的8倍稀释倍数作为最佳浓度。图7C所示，在孵育时间为60min时得到最佳电流值。因此，选择60分钟作为制备的电化学免疫检测系统的最佳KIM-1蛋白孵育时间。如图7D所示，DPV输出信号在H2O2为5mM时最大。因此H2O2的最佳优化浓度为5mM。
新型电化学免疫检测系统的检测性能
在优化的实验条件下，制备的电化学免疫检测系统以DPV曲线作为信号输出，检测不同浓度的KIM-1蛋白。图8A显示电化学免疫检测系统的DPV信号值随着KIM-1浓度在0.5ng/mL到10ng/mL之间发生相应的变化。图8B显示DPV电流与浓度对数之间良好的线性关系(R2＝0.9914)。拟合的线性回归方程为I＝-46.11-29.30lgC，经计算，其检测限(LOD)为0.083ng/mL。结果表明，所制备的电化学免疫检测系统对KIM-1蛋白具有良好的定量分析性能。
为了评估特异性，我们在BSA、甲胎蛋白(AFP)、胱抑素C(CysC)、前列腺特异性抗原(PSA)和含KIM-1的混合物中进行了交叉反应实验。如图8C所示，传感器对其他干扰蛋白无响应，相应的，在KIM-1蛋白的存在下，电流值显著增加。因此，所研制的电化学免疫检测系统对KIM-1检测具有良好的特异性和选择性。
我们还验证了传感器的重复性和稳定性。首先，在最佳条件下，连续测定10次不同浓度的KIM-1蛋白(1.0、5.0和10ng/mL)。图9A显示，在一个测量圈内，结果差异不大(RSD＝1.94％，1.61％，1.97％)，说明免疫分析仪的重现性良好。其次，用相同浓度(5ng/ml)的KIM-1评价所研制的电化学免疫检测系统的长期稳定性。从图9B可以看出，电化学免疫检测系统的电流信号在长时间保存后仍然良好，在4℃保存10天后，电流信号逐渐下降，保留了93.06％。以上结果表明免疫分析仪的稳定性符合预期。
新型电化学免疫检测系统在真实尿液样本中的应用
为了估计电化学免疫检测系统在真实样本中的回收效率，开发的电化学免疫检测系统被用于定量尿液中的KIM-1蛋白。我们检测了尿液样本中已知梯度浓度的KIM-1(1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL)。所研制的电化学免疫检测系统回收率为98.44％～102.07％，RSD为3.25％～4.78％(n＝3)。结果表明，该电化学平台具有应用于实际临床样品的潜力。

Claims (6)

1.一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，其特征在于：包括：
上层复合物：所述上层复合物为PdPtBP介孔合金纳米颗粒与聚多巴胺功能化的Ti3C2TXMXene分散液结合制成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，所述PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合有标记抗体；
下层复合物：所述下层复合物为修饰后的电极，所述修饰后的电极为先将CuCl2纳米线溶液滴在电极上，烘干后置于1.0wt％HAuCl4溶液中镀金得到的电极，所述修饰后的电极上结合有捕获抗体；
检测体系：所述检测体系为含有H2O2的PBS溶液。
2.根据权利要求1所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统，其特征在于：所述含有H2O2的PBS溶液中H2O2的浓度为4mmol/L。
3.制备如权利要求2所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、上层复合物的制备：
(1)合成PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液：称取120mg的双十八烷基二甲基氯化铵在40mL去离子水中充分溶解得到悬液；然后，将浓度为0.337mol/L的NH4F溶液4mL、浓度为0.101mol/L的H3BO3溶液4mL、浓度为10mmol/L的H2PdCl4溶液2.56mL、浓度为10mmol/L的H2PtCl6溶液0.64mL加入到上述悬液中；混匀后于30℃孵育5分钟，加入1.6mL 10wt.％的NH3·H2O溶液混匀；再加入0.034mol/L的NaH2PO2·H2O溶液4mL，将混合物从30℃加热到95℃，并在95℃下保持20分钟，同时搅拌；最后，加入0.1mol/L新鲜制备的二甲胺基硼烷4mL，搅拌至混合物由白色完全变为深褐色后，在95℃的温度下保持30分钟后冷却至室温；离心收集深色产物，用体积比为1:1的乙醇/水洗涤3次，将产物分散在4mL去离子水中；
(2)准备聚多巴胺/Ti3C2TX MXene分散液：对Ti3C2TX MXene分散液进行1.5小时的超声处理，2000rpm离心5分钟，收集上清液0.5mL；将取得的上清液分散于5mL去离子水中，然后调至pH 8.0～9.0，缓慢加入1.0mg盐酸多巴胺，用磁力搅拌24小时，离心取沉淀，再用去离子水洗涤三次，得到聚多巴胺功能化的二维Ti3C2TX MXene纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到均相溶液；
(3)将1mL上述步骤一(1)中合成的PdPtBP介孔合金纳米颗粒溶液滴入上述步骤一(2)中的均相溶液中，磁力搅拌10～14h后，5000rpm离心5分钟，沉积物即为PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物，将其溶解于1.5mL去离子水中得到PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物均相溶液，并于4℃保存备用；
(4)、在PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物上结合标记抗体：
取步骤一(3)合成的PdPtBP介孔纳米颗粒/迈科烯纳米复合物均相溶液1mL，与1mL浓度为10μmol/L的标记抗体混合，在4℃下搅拌10～14h；离心丢弃未结合的标记抗体后，加入牛血清白蛋白阻断非特异性位点，然后进行离心取沉淀，在4℃条件下分散在1mLPBS溶液中即得上层复合物，备用；
步骤二、下层复合物的制备：
(1)准备电极、CuCl2纳米线溶液和1.0wt％的HAuCl4溶液，将CuCl2纳米线溶液滴在电极上，37℃烘干，然后置于1.0wt％HAuCl4溶液中，在-0.2V恒电势下作用30s，电沉积金后，采用去离子水清洗并室温干燥得到修饰后的电极；
其中，CuCl2纳米线溶液的制备是：将CuCl2 0.05g、硫脲0.05g和乙醇40mL加入到体积为50mL的瓶中，封瓶后，混合均匀，在室温下超声搅拌5分钟；离心收集白色产物为CuCl2纳米线，用水冲洗2次；称取CuCl2纳米线，然后将其溶解在30mL去离子水中既得CuCl2纳米线溶液；
(2)在步骤二(1)所述修饰后的电极表面滴加10μL浓度为10μg/mL的捕获抗体，37℃孵育1小时；然后用10μL浓度为10mg/mL的BSA溶液在37℃下封闭1小时；最后，用pH为7.4、浓度为0.01mmol/L PBS溶液冲洗即得所述下层复合物，并保存于4℃备用。
4.根据权利要求3所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的制备方法，其特征在于：步骤二(1)中，在将CuCl2纳米线溶液滴在电极之前，先用铝粉对电极抛光10分钟，然后经去离子水超声波清洗后，用氮气冲洗，最后干燥。
5.根据权利要求2所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取8μL不同浓度的KIM-1蛋白溶液滴于所述下层复合物的表面，在37℃孵育1小时后用0.01mmol/LPBS冲洗，得到捕获了KIM-1蛋白的下层复合物；
步骤二、取所述上层复合物在37℃下滴于捕获了KIM-1蛋白的下层复合物表面，孵育1小时后用0.01mmol/LPBS冲洗；然后在含有4mmol/L的H2O2的PBS溶液中使用电化学输出方法进行信号的输出。
6.根据权利要求5所述的一种用于KIM-1蛋白的无酶电化学免疫检测系统的使用方法，其特征在于：步骤二所述电化学输出方法为差分脉冲伏安法或方波伏安法或电流时间法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112986359B (zh) * 2021-02-09 2023-04-11 天津大学 基于CuBTC@MoS2-AuNPs修饰电极及CA125检测方法
CN114235914B (zh) * 2021-11-05 2023-05-23 华南理工大学 基于Ti3C2-Pd纳米复合材料的水杨酸电化学传感器及其应用
CN118465021A (zh) * 2023-08-18 2024-08-09 常州工程职业技术学院 基于硅-铂纳米复合物的生物传感器及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8118991B2 (en) * 2001-09-04 2012-02-21 Stephen Eliot Zweig Apoenzyme reactivation electrochemical detection method and assay
WO2009039298A2 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Sensors using aigan/gan high electron mobility transistors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102725636A (zh) * 2009-12-20 2012-10-10 阿斯图特医药公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后的方法和组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Green electrochemical sensing platforms: utilizing hydroxyapatite derived from natural fish scales as a novel electrochemical material for the sensitive detection of kidney injury molecule 1 (KIM-1);Ying Zhang 等;《Analyst》;20140905;第139卷;第5362-5366页 *
Ternary Palladium−Boron−Phosphorus Alloy Mesoporous Nanospheres for Highly Efficient Electrocatalysis;Hao Lv 等;《ACS Nano》;20190912;第13卷;第12052-12061页 *
金属氮化物纳米储能材料及其柔性超级电容器;高标等;《中国材料进展》;20160731;第35卷(第07期);第552-559页 *

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