CN112964765B - 一种用于检测cea的电化学免疫传感器及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于电化学技术领域，具体公开了一种用于检测CEA的电化学免疫传感器及其制备与应用。本发明首次合成了rGO‑TEPA/HNMs/AuPtRu纳米复合材料，并基于rGO‑TEPA/HNMs/AuPtRu纳米复合材料构建了一种新型直接法电化学免疫传感器，用于人血清中癌胚抗原CEA的高灵敏检测。本发明将AuPtRu三金属用于修饰中空纳米金属有机骨架(HNMs)，用于信号放大，同时结合rGO‑TEPA比表面积大且具有大量氨基的优势，用作基底材料可捕获更多的蛋白质；还采用了生物素‑链霉亲和素蛋白系统，进一步实现免疫传感器信号放大。本发明所构建的电化学免疫传感器待测物与电化学信号成反比关系，具有灵敏度高(最低检测限为36.44fg·mL‑1)、重现性与稳定性好、特异性强以及检测范围宽(0.1fg·mL‑1至1μg·mL‑1)等特点。

Description

一种用于检测CEA的电化学免疫传感器及其制备与应用
技术领域
本发明涉及电化学技术领域，特别是涉及一种用于检测CEA的电化学免疫传感器及其制备与应用。
背景技术
癌症，又称恶性肿瘤，严重危害人类健康。重要的是，由于饮食结构的改变、工作压力的增加以及各种病原体的感染，癌症的发生趋于年轻化。大多数早期癌症没有明显的症状，很容易被忽视。因此，有效的早期检测对患者非常重要。癌症生物标志物是一种很有前途的癌症诊断和预后工具，癌胚抗原(CEA)是应用最广泛的癌症生物标志物之一。一般来说，当CEA在人血清中的水平超过5ng/mL时，与许多类型的癌症相关。目前，CEA的检测方法主要有酶联免疫法、化学发光免疫法、放射分析法等。但这些方法通常耗时且昂贵，前处理放大复杂且需要使用复杂的仪器。与这些方法相比，电化学免疫传感器因其操作简单、成本低、价格实惠等优点，在癌胚抗原检测中受到广泛关注，其也被广泛应用于药物筛选、食品检测、环境监测和临床诊断领域。
电化学免疫传感器是通过生物特异性识别反应来确定靶抗原浓度，并将生物信号转化为电信号的分析方法。然而，抗原和抗体特异性结合在电极表面形成复合物会阻碍电子转移。因此，对免疫传感器的敏感检测仍然具有很大的挑战性。目前，构建高效、灵敏的免疫传感器的方法主要有以下几个方面：(1)设计新的生物相容性和导电性的基质材料，增加抗体的负载量，加速电极表面的电子转移；(2)使用新的信号放大标记材料，有效提高传感器的性能。
现有的电化学免疫传感器对CEA的检测灵敏度不够，尚待改进。因此，开发具有高灵敏度和特异性的CEA检测方法对临床尚癌症实时监测和早期诊断至关重要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测CEA的电化学免疫传感器及其制备与应用，本发明首次在CEA电化学免疫传感器上合成并应用了新型中空纳米盒三金属复合材料，将其结合rGO-TEPA同时实现了基底修饰和信号放大信号材料，实现癌胚抗原(CEA)的超灵敏定量测定。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料，由氨基化还原氧化石墨烯TEPA(rGO-TEPA)与封装在Ni-Co层状双氢氧化物(Ni-Co LDH)中空纳米盒表面的金铂钌三金属纳米催化材料(AuPtRu TNPs)通过Au-NH2和Pt-NH2键结合获得。
本发明第二方面提供一种如第一方面所述复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒均匀分散于水中，再加入NaBH4乙醇溶液，搅拌反应，反应结束后，滴加RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液，进行反应，反应结束后，再滴加NaBH4乙醇溶液，进行反应，反应结束后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到产物，即Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒/金铂钌材料(hollow nanobox-MOFs/AuPtRu)；
(2)将氨基化还原氧化石墨烯TEPA均匀分散在水中，加入步骤(1)所得的产物，进行反应，反应结束后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到所述用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料。
进一步，所述步骤(1)中，Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒的用量为10-12mg，RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液的用量均为5-6mL，RuCl3乙醇溶液的浓度为18-22mmol/L，H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液的浓度为1.0-1.2wt％。
进一步，所述步骤(1)中，NaBH4乙醇溶液的浓度为0.02-0.1mol·L-1，优选为0.04-0.06mol·L-1，更优选为0.05mol·L-1。
进一步，所述步骤(1)中，滴加RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液前，NaBH4乙醇溶液的加入量为10-12mL；滴加RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液前，NaBH4乙醇溶液的滴加量为2-4mL。
进一步，所述步骤(2)中，氨基化还原氧化石墨烯TEPA与步骤(1)所得的产物的质量比1.0-1.2:2.0-2.5，优选为1.0:2.0。
进一步，所述步骤(1)和(2)中，通过超声处理的方式使Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒、氨基化还原氧化石墨烯TEPA均匀分散于水中，进行的反应在超声条件下进行。
进一步，所述步骤(1)中，所述Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒的合成方法为将钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体分散到乙醇中，再加入含有Ni(NO3)2的乙醇溶液，搅拌混合均匀后，在超声条件下进行反应，反应结束后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到产物，即Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒。
可选地，合成Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒时，钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体与Ni(NO3)2的质量比为3:5。
可选地，合成Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒时，加入含有Ni(NO3)2的乙醇溶液，搅拌混合均匀后，在超声条件下反应80-120分钟后，再将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到产物，即Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒。
可选地，所述钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体的合成方法为：将Co(NO3)2·6H2O溶于含有CTAB的水溶液中，得到混合液，然后将混合液迅速注入含有2-甲基咪唑的水溶液中，并在室温下进行搅拌反应，反应结束后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到所述钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体。
可选地，合成钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体时，Co(NO3)2·6H2O与CTAB、2-甲基咪唑的质量比为55-60:2-5:900-910，优选为58:3:908。
可选地，合成钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体时，将混合液迅速注入含有2-甲基咪唑的水溶液中后，在室温下进行搅拌反应20-30分钟，再将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到所述钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体。
进一步，上述制备方法及合成方法中所用的水为超纯水和/或去离子水。
本发明第三方面提供一种用于检测癌胚抗原CEA的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极由基底电极修饰如第一方面所述的复合纳米材料和/或如第二方面所述的制备方法制得复合纳米材料获得。
进一步，所述基底电极上还修饰有链霉亲和素。
进一步，所述基底电极为玻碳电极。
本发明第四方面提供如第三方面所述的电化学免疫传感器中工作电极的制备方法，包括如下步骤：
(a)将第一方面所述的用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料滴加至基底电极表面，并在空气中干燥，得到修饰电极，备用；
(b)将链霉亲和素涂覆至步骤(a)制得的修饰电极表面，孵育，通过Au-NH2和Pt-NH2键将链霉亲和素结合到修饰电极上；然后将生物素修饰的抗体滴加至电极表面，孵育，通过链霉亲和素-生物素之间的亲和力将生物素修饰的抗体固定在电极上；接着用BSA溶液封闭电极，得到所述工作电极。
进一步，所述步骤(a)中，用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料浓度为0.5-3.0mg·mL-1，优选为1.5-3.0mg·mL-1，更优选为2.0mg·mL-1。
进一步，所述步骤(b)中，链霉亲和素浓度为浓度为0.5-2.0μg·mL-1，优选为1.0-2.0μg·mL-1，更优选为1.0μg·mL-1。
进一步，所述步骤(b)中，生物素修饰的抗体浓度为2-6μg·mL-1，优选为4-6μg·mL-1，更优选为4μg·mL-1。
进一步，所述步骤(a)和(b)中，用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料、链霉亲和素、生物素修饰的抗体的体积用量为8-10μL。
进一步，所述步骤(b)中，链霉亲和素涂覆至步骤(a)制得的修饰电极表面上后，孵育温度为4℃，孵育时间为12-16h。
进一步，所述步骤(b)中，将生物素修饰的抗体滴加至电极表面上后，孵育温度为37℃，孵育时间为1-1.5h。
进一步，所述步骤(b)中，用BSA溶液封闭电极的方式为：用5-8μL的1％，w/v的BSA溶液在37℃下孵育30-60分钟，以阻断非特异性结合。
本发明第五方面提供如第一方面所述的复合纳米材料和/或如第二方面所述的制备方法制得的复合纳米材料和/或如第三方面所述的电化学免疫传感器和/或如第四方面所述的制备方法制得的电化学免疫传感器在检测癌胚抗原CEA上的应用。
本发明第六方面提供一种检测癌胚抗原CEA的方法，采用如第三方面所述的电化学免疫传感器和/或如第四方面所述的制备方法制得的电化学免疫传感器。
进一步，所述方法包括如下步骤：将不同浓度的CEA标准溶液滴加到工作电极上，孵育后用PBS缓冲液洗去未结合的CEA，将工作电极浸入工作缓冲溶液中，进行电化学测量，记录电流响应信号随着CEA浓度的变化，并建立电流响应信号与CEA浓度对数之间的拟合线性回归方程；将人血清样品稀释后滴加至工作电极上，进行电化学检测，然后根据拟合线性回归方程得到人血清中的CEA。
可选地，孵育温度为37℃，孵育时间为20-100min，优选为40-100min，更优选为60-80min，最优选为60min。
可选地，所述工作缓冲溶液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH值为6.4-7.2，优选为6.6-7.0，更优选为6.7-6.9，最优选为6.8。
如上所述，本发明的用于检测CEA的电化学免疫传感器及其制备与应用，具有以下有益效果：
本发明开发了一种新型直接法电化学免疫传感器，用于超灵敏定量测定CEA。本发明首次在CEA电化学免疫传感器上合成并应用了新型中空纳米盒三金属复合材料，将其结合氨基化还原氧化石墨烯TEPA(rGO-TEPA)同时实现了基底修饰和信号放大信号材料。本发明将rGO-TEPA结合封装在中空纳米盒MOFs表面的金铂钌三金属(AuPtRu TNPs)，以制备rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu TNPs纳米复合材料作为基底材料，由于该纳米复合材料具有较高的电导率，催化H2O2的能力强，比表面积大，修饰了大量氨基，可被用作固定链霉亲和素的理想载体平台，因此，它们被进一步用于固定更多的生物素修饰抗体(Bio-Ab)，可增强抗体-抗原特异识别后的电化学信号的区别。
本发明所构建的电化学免疫传感器待测物与电化学信号成反比关系，具有灵敏度高、重现性与稳定性好、特异性强以及检测范围宽(0.1fg·mL-1至1μg·mL-1)等特点。在最佳条件下，本免疫传感器对CEA的检测灵敏度达到了最低检测限36.44fg·mL-1(以3σ为基准)。
综上所述，本发明提出的电化学免疫传感器为临床早期肿瘤诊断中CEA的测定提供了新的思路。
附图说明
图1显示为本发明实施例中rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu复合纳米材料的合成路径图(A)及用于检测CEA的电化学免疫传感器的构建过程图(B)。
图2显示为本发明实施例中纳米材料ZIF-67、HNMs、HNMs/AuPtRu、rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu的FE-SEM、TEM图。
图3显示为本发明实施例中纳米材料ZIF-67、HNMs的EDS图。
图4显示为本发明实施例中纳米材料HNMs/AuPtRu、rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu的EDS图。
图5显示为本发明实施例中电极的CV(A)和EIS(B)测量曲线图。
图6显示为本发明实施例中分别以四种基底纳米材料(Ⅰ)Ni-Co LDH中空纳米盒(HNMs)、(Ⅱ)HNMs/AuPt NPs、(Ⅲ)HNMs/AuPtRu TNPs和(Ⅳ)rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu TNPs修饰的电化学免疫传感器的电催化活性和电导率变化图。
图7显示为本发明实施例中电化学免疫传感器的电化学信号随着rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu浓度(A)、SA(链霉亲和素)浓度(B)、Bio-Ab浓度(C)、CEA的孵育时间(D)及pH值(E)变化的变化曲线图。
图8显示为本发明实施例中最优实验条件下电化学免疫传感器随着CEA浓度变化的电流响应变化图(A)及电化学电流响应信号与CEA浓度的线性关系图(B)。
图9显示为本发明实施例中电化学免疫传感器的特异性(A)、重复性(B)和稳定性(C)分析结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明将rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu纳米复合材料作为基底电活性材料(简称为基底材料)和信号放大标签，开发了一种直接型电化学免疫传感器。首先，基底材料直接滴涂在玻碳电极表面，产生电化学信号。为进一步提高免疫传感器的灵敏度，本发明采用了生物素-链霉亲和素系统，先通过Au-NH2和Pt-NH2的键合亲和力来锚定链霉亲和素；接着，通过链霉亲和素和生物素之间的高亲和力，捕获修饰了生物素的CEA抗体(Bio-Ab)；用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性位点后，通过抗原抗体反应，待测CEA结合在免疫传感器上。最后，所构建的生物传感器通过还原过氧化氢来放大电化学信号，获得了良好的电化学信号响应。本发明所构建的新型直接法电化学免疫传感器对CEA的定量检测具有较高的灵敏度，在临床诊断CEA检测中具有相当的潜力。
金属有机骨架(MOFs)是由一类有机配体和金属中心的自组装形成的多孔材料，它具有大的比表面积，均匀的孔径和形状，多样化和可调节的孔表面。中空纳米材料被广泛用于信号放大和电化学免疫传感器灵敏度的提高。Ni-Co层状双氢氧化物(Ni-Co LDH)中空纳米盒是一种新型的主体基质，具有较高的化学反应性和较大的表面积/体积比。与双金属和单金属纳米催化材料相比，三金属纳米催化材料具有更好的性能，如化学稳定性、高表面积和快速电子转移能力，并且具有表面积大、粒径均匀、导电性好的特点。三金属纳米催化材料的优势在于能保留各组分的功能特性，并可能通过协作相互作用提供协同效应，增加表面积，增强电催化活性，改善生物相容性，促进电子转移，产生有效的电信号放大。本发明采用的三金属纳米催化材料为AuPtRu TNPs，其中，钌(Ru)非常稳定，可用作优异的催化剂；Ru是一种有效的铂硬化剂，可用于提高铂的稳定性和催化性能。与传统的纳米材料如Pt纳米粒子和AuPt双金属纳米粒子相比，AuPtRu TNPs具有更强的催化过氧化氢分解的能力。
rGO-TEPA是一种理想的电化学纳米材料，生物相容性好，比表面积大并且具有大量氨基。基于这些优势，它与其他传统还原性石墨烯材料相比，可改善电导率并增加可装载的蛋白质其他生物活性物质的量。但其分散性差，单独用于电化学传感器构建时，不易均匀修饰在电极上。本发明创新性地将rGO-TEPA、Ni-Co LDH空心纳米盒与AuPtRu三金属纳米催化材料结合，制备成rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu TNPs纳米复合材料，用作基底材料。该复合纳米材料电催化能力强、具有良好的分散性，不仅结合了上述三种纳米材料的优势，并且改善了原组分材料rGO-TEPA不易分散均匀的性质。最后，该纳米复合材料能够通过Au-NH2键、Pt-NH2键大量固定生物分子，同时还能通过AuPtRu TNPs催化H2O2分解，极大地扩增信号，进一步提高传感器检测的灵敏度，降低检测限。
下面通过具体的实施内容来对本发明的内容进行进一步说明。
1、实验方法
1.1化学试剂
纯化人癌胚抗原(CEA)、人免疫球蛋白G(HIgG)、人血清白蛋白(HSA)和前列腺特异性抗原(PSA)均购自上海领潮生物科技有限公司(中国上海，http://www.linc-bio.com)。链霉亲和素蛋白(SA)、生物素标记的癌胚抗原单克隆抗体(Anti-CEA/Biotin)购自北京博奥森生物技术有限公司(中国北京，http://www.bioss.com.cn)。人绒毛膜促性腺激素(HCG)、牛血清白蛋白(BSA)、硼氢化钠(NaBH4)购于Sigma-Aldrich Chemical(美国圣路易斯，http://www.sigmaaldrich.com)。氯金酸(HAuCl4·4H2O)、氯铂酸(H2PtCl6·6H2O)购自上海麦克林生化科技有限公司(中国上海，http://www.macklin.cn)。Nanoinnova氨基化石墨烯TEPA(rGO-TEPA)购自江苏先丰纳米材料科技有限公司(中国南京，https://www.xfnano.com)。无水三氯化钌(RuCl3)、2-甲基咪唑、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、六水合硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)、六水合硝酸镍(Ni(NO3)2·6H2O)均购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海，www.aladdin-e.com)。H2O2购自重庆川东化工集团有限公司(中国重庆)。
使用含有0.1M Na2HPO4、0.1M KH2PO4和0.1M KCl的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)作为工作缓冲液；使用0.01M的PBS(由8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、136mM NaCl、2.6mM KCl组成)作为CEA、SA、Anti-CEA/Biotin的稀释液。所有其他试剂都是分析纯，不经进一步纯化即可使用；所有水溶液均使用超纯水(≥18.2MΩ·cm)制备。
1.2分析仪器
本实验的所有电化学测量，包括循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱(EIS)和计时电流分析法(i-t)都在三电极系统的AUTOLAB PGSTAT302 N电化学工作站上进行。其中铂柱电极作为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE，含3M KCl)为参比电极，经过修饰的3mm直径的玻碳电极(GCE)作为工作电极；所有电极均购自Gaossunin Technology Co.，Ltd(中国南京)。使用Hitachi S4800(Hitachi Limited，Japan)获得场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)图像；使用JEM-2100F显微镜(日本)获得透射电子显微镜(TEM)图像；通过使用BRUKER XFlash 6130获得能量衍射光电子能谱(EDS)。超声波清洁机为SB25-12DTN(600W)购自宁波科学院生物科技有限公司(中国浙江)。所有电化学测量均在室温(25±1℃)条件下进行
1.3ZIF-67纳米立方体和Ni-Co LDH中空纳米盒的合成
钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体和Ni-Co层状双氢氧化物(Ni-Co LDH)中空纳米盒是通过表面活性剂介导的方法合成的。
合成钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体的方法如下：
将58mg Co(NO3)2·6H2O溶于2mL含有3mg CTAB的超纯水中。然后，将该溶液迅速注入14mL含有908mg 2-甲基咪唑的超纯水溶液中，溶液的颜色立即从无色变为紫色，并在室温下搅拌20分钟。通过离心收集产物，并用无水乙醇以10000rpm的转速洗涤10分钟，重复洗涤六次后，在70℃下干燥。
合成Ni-Co LDH中空纳米盒(Hollow nanobox-MOFs,简称HNMs)的方法如下：将30mg ZIF-67纳米立方体分散到20mL乙醇中，然后，加入5mL含有50mg Ni(NO3)2的乙醇溶液。然后搅拌混合物1分钟。随后，将反应容器置于超声波浴中(超声波清洗机的功率为600W)90分钟。最后，将产物以8000rpm离心5分钟，用10mL超纯水洗涤6次以除去未反应的化学物质，然后在70℃下干燥，得到Ni-Co LDH中空纳米盒。
1.4hollow nanobox-MOFs/AuPt、hollow nanobox-MOFs/AuPtRu的合成
为了合成中空结构的hollow nanobox-MOFs/AuPtRu(HNMs/AuPtRu)，将10mg Ni-Co LDH中空纳米盒HNMs分散到10mL超纯水中，超声处理1小时以获得均匀溶液。然后加入10mL的NaBH4乙醇溶液(0.05mol·L-1)，搅拌20分钟后，向溶液中缓慢滴加5mL20mmol/L的RuCl3乙醇溶液、5mL的1％H2PtCl6乙醇溶液和5mL的1％HAuCl4乙醇溶液，超声处理30分钟。然后，将2mL的NaBH4乙醇溶液(0.05mol·L-1)缓慢滴加到该溶液中，并将该溶液超声处理30分钟。最后，将产物以8000rpm离心5分钟，并用超纯水洗涤三次，并在70℃下干燥，得到HNMs/AuPtRu。
除了使用2.5mL的1％HAuCl4乙醇溶液与2.5mL的1％H2PtCl6乙醇溶液替代5mL的RuCl3乙醇溶液之外，hollow nanobox-MOFs/AuPt(HNMs/AuPt)的合成与HNMs/AuPtRu的合成方法相同。
1.5rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu复合纳米材料的合成
合成rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu的方法如下：将10mg rGO-TEPA分散在10mL超纯水中并进行超声处理以获得均匀分散溶液。接下来，将溶液与20mL浓度为1mg·mL-1的Hollow nanobox-MOFs/AuPtRu混合，超声处理均匀后，避光条件下搅拌过夜。rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu通过Au-NH2和Pt-NH2键结合获得。随后，将混合物以10000rpm离心5分钟，用超纯水重复洗涤3次，将制备的产物在70℃下干燥。
图1A显示了rGO-TEPA/hollow nanobox-MOFs/AuPtRu复合纳米材料的合成路径。1.6电化学免疫传感器的构建
图1B显示了CEA电化学免疫传感器的构建过程，具体过程如下：
在电极修饰纳米材料之前，依次使用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料将裸露的玻碳电极(GCE)重复抛光成镜面状。然后，将GCE依次用超纯水、无水乙醇和超纯水进行超声洗涤各5分钟。在室温下，用氮气中干燥GCE后，将8μL 2mg·mL-1的rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu复合纳米材料滴加到GCE表面上，并在空气中干燥。然后，将10μL浓度为1μg·mL-1的链霉亲和素(SA)滴加到修饰电极表面上，并通过Au-NH2和Pt-NH2键将SA结合到修饰后的电极上。将电极储存在4℃下孵育12h，以使SA蛋白更有效地与rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu结合。接下来，将10μL浓度为4μg·mL-1生物素修饰的抗体(Bio-Ab)滴加到制备的电极表面，并在37℃下孵育60分钟，使其通过链霉亲和素-生物素之间的亲和力将Bio-Ab固定在电极上。接着用6μL BSA溶液(1％，w/v)在37℃下孵育40分钟以阻断非特异性结合。在每个修饰步骤后，用PBS溶液洗涤电极以除去未结合的SA、Bio-Ab、BSA。
1.7电化学免疫传感器的检测过程
将10μL不同浓度(范围从0.1pg·mL-1至1μg·mL-1之间)的CEA标准溶液滴加到修饰电极上，37℃条件下孵育60分钟。用PBS洗涤至少三次以冲洗未结合的CEA，用作电化学测量的工作电极，进行电化学测量。
所有电化学测试均在含有常规三电极系统的电化学工作站中进行。CV和EIS测量均在含0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中进行。CV测量是在扫描速率为0.1V·s-1和电压范围为-0.2V至+0.6V的条件下进行的；EIS测量在10mV幅度和从0.1至105Hz的频率进行扫描。计时电流法(i-t)是将修饰后的工作电极浸入用作工作缓冲溶液的磷酸盐缓冲溶液中。在室温且电压为-0.4V条件下，待背景电流稳定后，向10mL工作缓冲溶液(pH＝6.8)中加入10μL 3.3mol·L-1的H2O2，记录i-t曲线中电化学信号的变化差值。
2.结果与讨论
2.1各种纳米材料的表征
采用FE-SEM、TEM和EDS对合成的各种纳米材料的形貌和结构进行表征，结果如图2、图3和图4所示。
如图2和图3所示，FE-SEM图像上ZIF-67纳米立方体表面光滑，均匀，平均直径约200nm。其TEM图像同时验证了ZIF-67纳米立方体的立方体形状。EDS谱图上的特征元素Co证实了ZIF-67纳米立方体的形成。在25℃下与适量的Ni(NO3)2反应90分钟后，ZIF-67纳米立方体被转化为Ni-Co LDH纳米中空立方盒(HNMs)。其FE-SEM图像表明，HNMs仍然保留了前体ZIF-67纳米立方体的固体形态和尺寸，但表面变得粗糙。TEM图像清晰地表明纳米立方盒表面是由厚度约为15nm的纳米片组装的。其EDS谱图与ZIF-67相比，显示了HNMs含有大量Ni元素，表明纳米盒的形成。
如图2和图4所示，从HNMs/AuPtRu纳米复合材料的FE-SEM和TEM图像上可以看出，当AuPtRu金属纳米粒子形成在纳米盒的表面时，纳米盒被大量球形颗粒所包裹。其EDS谱图同时显示了Au、Pt、Ru、Co、Ni等特征元素，进一步证明了AuPtRu合金成功修饰到纳米盒上。rGO-TEPA呈连续光滑的表面和稍褶皱的状态，具有很大的表面积。在rGO-TEPA与HNMs/AuPtRu搅拌后，其FE-SEM清晰地显示了纳米盒结构附着在结构明显地附着在如rGO-TEPA片层结构上。其EDS图像可以观察到Au、Pt、Ru特征元素，证实rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu TNPs的合成。
2.2逐步修饰电极的电化学表征
为了表征实验中电化学免疫传感器的构建过程，在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，通过CV和EIS在每个孵育步骤后测量修饰电极的传感界面性质。
在0.1V·s-1的扫描速率下，从-0.2V到+0.6V测量不同修饰电极的CV。如图5A所示，在裸玻碳电极的CV扫描中，曲线a表现出明显的可逆氧化还原峰。在曲线b中，显示了rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu修饰电极的结果，氧化还原峰电流显著增加，表明了该纳米复合材料具有优异的导电性，促进了电子转移。接下来，在改性后的电极表面孵育SA(链霉亲和素)后，由于非电活性蛋白质SA阻碍电极上的电子转移，峰值电流显著下降(曲线c)。然后，Bio-Ab与SA结合，非电活性物质Bio-Ab进一步增加了电极表面的电阻，氧化还原峰电流进一步下降(曲线d)。类似地，当用BSA封闭Bio-Ab/SA/rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu/GCE的非特异性位点时，峰值电流又一次降低(曲线e)。随后，由于抗原—抗体反应产生高电阻，抗原蛋白作为惰性电子和传质阻挡层，CEA与Bio-Ab结合后峰值电流降低到最小值(曲线f)。这些结果说明免疫传感器制造过程中每一步依次构建成功。
此外，EIS用于进一步验证电极在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的逐步修饰过程。在奎斯特图中的弧形直径反映电子转移的电阻大小，低频曲线的线性反映电子转移扩散的过程。如图5B所示，EIS结果与CV结果一致，所有结果均表明免疫传感器被成功构建。
2.3rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu纳米复合材料信号放大效应对比
在所构建免疫传感器中，纳米复合材料的电催化活性和电导率是免疫传感器灵敏度的关键因素。为了研究这种免疫传感器中基底材料的信号放大策略，我们比较了用四种均为10μL浓度为2mg·mL-1的纳米材料修饰的电化学免疫传感器。四种基底纳米材料包括(Ⅰ)Ni-Co LDH中空纳米盒(HNMs)、(Ⅱ)HNMs/AuPt NPs、(Ⅲ)HNMs/AuPtRu TNPs和(Ⅳ)rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu TNPs。图6A中，曲线a是HNMs，曲线b是HNMs/AuPt，图6B中曲线a是HNMs/AuPt，曲线b是HNMs/AuPtRu，曲线c是rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu。
如图6A所示，与只有中空纳米盒作为基底的生物传感器相比，由于HNMs/AuPt NPs具有催化还原过氧化氢的能力，所以HNMs/AuPt NPs显示出显著的电化学信号增加。如图6B所示，当免疫传感器中HNMs/AuPtRu TNPs作为基底信号材料时，其比HNMs/AuPt NPs表现出更大的电催化电流响应。这表明三金属纳米催化材料比双金属纳米催化材料具有更高的H2O2催化性，导致电化学信号增加。进一步地，由图6B可知，使用rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu纳米复合材料作为信号放大免疫传感基底显著提高了检测灵敏度。
2.4实验条件的优化
电化学免疫传感器的电化学信号易受许多实验参数影响，为了获得电化学免疫传感器的最佳检测性能，我们优化了几个重要实验参数：
2.4.1rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu浓度
rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu的浓度是影响电极的表面积和传感器导电性的重要因素。如图7A所示，电化学信号随着rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu浓度的增加而增加(从0.5mg·mL-1至2.0mg·mL-1)，随后一直保持稳定。因此，选择2.0mg·mL-1作为最佳浓度。
2.4.2SA浓度
SA(链霉亲和素)浓度是固定Bio-Ab和影响免疫传感器性能的关键因素。SA浓度在0至2μg·mL-1范围内进行检测。图7B显示，随着SA浓度的增加，电化学信号变化减小，在1μg·mL-1处电化学信号趋于平稳，表明SA的量在免疫传感器表面上达到最大值。因此，选择1μg·mL-1作为SA的最佳浓度。
2.4.3Bio-Ab浓度
为了使更多的Bio-Ab固定在电极上，Bio-Ab的浓度也是影响传感器性能的重要参数。图7C显示了Bio-Ab浓度对免疫传感器响应的影响。当Bio-Ab浓度从2μg·mL-1变为4μg·mL-1时电流显著下降，随后达到平台。这表明Bio-Ab的量通过与SA的结合而达到免疫传感器表面上的最大值。因此，选择4μg·mL-1作为Bio-Ab的最佳浓度。
2.4.4CEA的孵育时间
目标待测物CEA的特异性识别和固定是整个传感器构建过程中的关键步骤。如图7D所示。随着孵育时间的增加，电流迅速下降并在60分钟后保持稳定，表明此时获得了CEA的最大固定化。因此，选择60分钟作为CEA的最佳孵育时间。
2.4.5pH值
工作缓冲溶液PBS缓冲液的pH值主要影响免疫传感器中的生物蛋白的活性和基底材料的催化能力。如图7E所示，免疫传感器的电流响应随着检测溶液的pH从6.4增加到6.8而持续增加，并且在pH值为6.8时达到最大值。在pH值大于6.8时，电流响应显著下降。这是由于在高酸性或碱性环境下基底材料的催化能力减弱，导致电化学信号降低。因此，选择检测溶液的pH值为6.8，作为实验中优化的最佳检测条件。
2.5电化学免疫传感器的性能分析
在最优实验条件下，电压为-0.4V，用计时电流法i-t曲线在10mL PBS(pH 6.8)中记录不同浓度的CEA对催化能力的影响。图8A显示了电化学信号与目标CEA在0.1pg·mL-1-1μg·mL-1浓度范围内的关系，电流响应随着CEA浓度的增加而逐渐降低。如图8B所示，电化学电流响应信号与CEA浓度对数之间呈现良好的线性关系，拟合线性回归方程为Y＝-17.783*logCCEA+256.64(pg·mL-1)，回归系数R2＝0.9998。另外，通过计算可得最低检测限(LOD)为36.44fg·mL-1(基于3σ)。
上述结果表明，本发明所提出的电化学免疫传感器可用于定量检测CEA。
2.6免疫生物传感器的特异性、重复性和稳定性
电化学免疫传感器的特异性、重复性和稳定性是研究其性能的重要参数。为了评估该电化学免疫传感器的特异性，选择4种蛋白作为干扰物，包括人免疫球蛋白G(HIgG)、人血清白蛋白(HSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)。
在最优实验条件下，将10ng·mL-1的CEA和100倍浓度的1μg·mL-1干扰抗原、上述所有蛋白质的混合物(Mix)以及空白样品(Blank)，分别采用所构建的电化学免疫传感器进行检测。每种类型的当前响应记录在图9A中。由图9A可知，当加入100倍浓度的HIgG、HSA、PSA、HCG时，电流反应值与空白样品没有显著差异；加入1μg·mL-1混合的干扰物后，与仅含10ng·mL-1的CEA相比，混合电流响应仍然没有显示出显著的变化。这些结果表明，这些外源蛋白质对电化学免疫传感器上的CEA测定的影响可忽略。
使用内部测定法和测定间测定法评价电化学免疫传感器的重复性，结果如图9B所示。由图9B可知，在相同实验条件下，用不同批次的电化学免疫传感器检测浓度为100pg·mL-1的CEA，批内和批间的相对标准偏差值(RSD)分别为1.19％和1.01％。这些结果显示，本发明所构建的免疫传感器展现出可接受的重复性。
为了评估免疫传感器的稳定性，在测定前将制备的电化学免疫传感器储存在4℃条件下。如图9C所示，在储存一周后，电流响应没有明显差异，仅比初始电流值低2.9％；贮存20天后，该免疫传感器保留了其初始电流响应的87.3％，这表明本发明所设计的电化学免疫传感器具有良好的稳定性。
2.7实际血清样本分析
为了评价所设计的免疫传感器在实际应用中的精确度和准确性，将不同浓度的CEA加入100倍稀释的人血清样品(来自重庆医科大学附属大学城医院)中，通过i-t曲线计算其回收率。如表1所示，所有样品的回收率在96.16％至102.29％之间，相对标准偏差为0.47％至0.93％。结果表明，本发明所设计的电化学免疫传感器检测CEA是可行的，可用于检测人血清中的CEA。
Table 1.Determination of CEA in human serum(n＝3)with the proposedimmunosensor
Figure BDA0002936476420000111
3结论
综上所述，本发明基于链霉亲和素-生物素系统以及rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu纳米复合材料同时作为基底修饰材料和信号放大分子，成功构建了一种高灵敏、的新型电化学免疫传感器，可用于人血清中检测CEA。本发明首次成功合成了rGO-TEPA/HNMs/AuPtRu纳米复合材料，由于其结构优势和增强的导电性，表现出对H2O2突出的电催化活性。同时，本发明使用生物素-链霉亲和素蛋白系统来提高免疫传感器的灵敏度，增加了电化学信号的信号差值。由于这些优点，本发明所提出的电化学免疫传感器具有高特异性、良好的稳定性和重复性，很宽的线性范围，检测限为36.44fg·mL-1，满足了对低含量CEA在人血清中的检测。本发明为临床早期肿瘤诊断应用中测定CEA提供了一种新的方法。在将来，本发明所设计的方法极有可能用于临床上早期癌症标志物的检测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料，其特征在于，由氨基化还原氧化石墨烯rGO-TEPA与封装在Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒表面的金铂钌三金属纳米催化材料通过Au-NH2和Pt-NH2键结合获得；
所述Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒的合成方法为将钴基沸石咪唑骨架ZIF-67纳米立方体分散到乙醇中，再加入含有Ni(NO3)2的乙醇溶液，搅拌混合均匀后，在超声条件下进行反应80-120分钟后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到产物，即Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒；其中，钴基沸石咪唑骨架ZIF-67纳米立方体与Ni(NO3)2的质量比为3:5；
所述钴基沸石咪唑骨架ZIF-67纳米立方体的合成方法为：将Co(NO3)2·6H2O溶于含有CTAB的水溶液中，得到混合液，然后将混合液迅速注入含有2-甲基咪唑的水溶液中，并在室温下进行搅拌反应20-30分钟，再将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到所述钴基沸石咪唑骨架ZIF-67纳米立方体；其中，Co(NO3)2·6H2O与CTAB、2-甲基咪唑的质量比为55-60:2-5:900-910。
2.根据权利要求1所述的复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒均匀分散于水中，再加入NaBH4乙醇溶液，搅拌反应，反应结束后，滴加RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液，进行反应，反应结束后，再滴加NaBH4乙醇溶液，进行反应，反应结束后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到产物；
(2)将氨基化还原氧化石墨烯rGO-TEPA均匀分散在水中，加入步骤(1)所得的产物，进行反应，反应结束后，将反应液离心，洗涤沉淀物、干燥得到所述用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米盒的用量为10-12mg，RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液的用量均为5-6mL，RuCl3乙醇溶液的浓度为18-22mmol/L，H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液的浓度为1.0-1.2wt％；
和/或，所述步骤(1)中，NaBH4乙醇溶液的浓度为0.02-0.1mol·L-1；
和/或，所述步骤(1)中，滴加RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液前，NaBH4乙醇溶液的加入量为10-12mL；滴加RuCl3乙醇溶液、H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液前，NaBH4乙醇溶液的滴加量为2-4mL；
和/或，所述步骤(2)中，氨基化还原氧化石墨烯rGO-TEPA与步骤(1)所得的产物的质量比为1.0-1.2:2.0-2.5。
4.一种用于检测癌胚抗原CEA的电化学免疫传感器，其特征在于：包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极由基底电极修饰如权利要求1所述的复合纳米材料和/或如权利要求2-3任一项所述的制备方法制得复合纳米材料获得。
5.根据权利要求4所述的电化学免疫传感器，其特征在于：所述基底电极上还修饰有链霉亲和素；
和/或，所述基底电极为玻碳电极。
6.根据权利要求4-5任一项所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将权利要求1所述的用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料滴加至基底电极表面，并在空气中干燥，得到修饰电极，备用；
(b)将链霉亲和素涂覆至步骤(a)制得的修饰电极表面，孵育，通过Au-NH2和Pt-NH2键将链霉亲和素结合到修饰电极上；然后将生物素修饰的抗体滴加至电极表面，孵育，通过链霉亲和素-生物素之间的亲和力将生物素修饰的抗体固定在电极上；接着用BSA溶液封闭电极，得到所述工作电极。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料浓度为0.5-3.0mg·mL-1；
和/或，所述步骤(b)中，链霉亲和素浓度为0.5-2.0μg·mL-1；
和/或，所述步骤(b)中，生物素修饰的抗体浓度为2-6μg·mL-1；
和/或，所述步骤(a)和(b)中，用于检测癌胚抗原CEA的复合纳米材料、链霉亲和素、生物素修饰的抗体的体积为8-10μL；
和/或，所述步骤(b)中，链霉亲和素涂覆至步骤(a)制得的修饰电极表面上后，孵育温度为4℃，孵育时间为12-16h；
和/或，所述步骤(b)中，将生物素修饰的抗体滴加至电极表面上后，孵育温度为37℃，孵育时间为1-1.5h。
8.根据权利要求1所述的复合纳米材料和/或如权利要求2-3任一项所述的制备方法制得的复合纳米材料和/或如权利要求4-5任一项所述的电化学免疫传感器和/或如权利要求6-7任一项所述的制备方法制得的电化学免疫传感器在检测癌胚抗原CEA上的应用。
9.一种非疾病诊断或治疗目的的用于检测癌胚抗原CEA的方法，采用如权利要求4-5任一项所述的电化学免疫传感器和/或如权利要求6-7任一项所述的制备方法制得的电化学免疫传感器。
10.根据权利要求9所述的检测癌胚抗原CEA的方法：将不同浓度的CEA标准溶液滴加到工作电极上，孵育后用PBS缓冲液洗去未结合的CEA，将工作电极浸入工作缓冲溶液中，进行电化学测量，记录电流响应信号随着CEA浓度的变化，并建立电流响应信号与CEA浓度对数之间的拟合线性回归方程；将人血清样品稀释后滴加至工作电极上，进行电化学检测，然后根据拟合线性回归方程得到人血清中的CEA；
其中，孵育温度为37℃，孵育时间为20-100min；所述工作缓冲溶液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH值为6.4-7.2。
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