CN104407039B - 一种用于检测mc‑lr型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测MC‑LR型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法。所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极上修饰多壁碳纳米管‑壳聚糖电沉积薄膜,并在多壁碳纳米管‑壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC‑LR型微囊藻毒素抗体。本发明传感器分析速度快,样品用量少,易于发展手持设备,便于实现定点和实时测试,而且成本远低于大型的分析检测仪器,因此可以进行推广普及满足家庭测量需求。
Description
技术领域
本发明属于电化学分析和纳米材料技术领域,特别涉及一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法和应用。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystin,简称MC)是蓝藻产生的多肽毒素,为环状结构,有多种变型,含量较多、毒性较大的主要是MC-LR、MC-RR、MC-YR这三种微囊藻毒素(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸),本发明主要针对MC-LR型微囊藻毒素进行检测。微囊藻毒素会使水体中其他生物中毒,而且也会对人类的健康产生很多潜在的危害。人们在皮肤接触含有微囊藻毒素的水体时会引起如眼睛等敏感部位过敏,少量喝入可引起急性肠胃炎,而且微囊藻毒素是一种肝毒素,是肝癌的强烈促癌剂,长期饮用则可能引发肝癌,因此对微囊藻毒素的研究已经成为水体环境科学研究的重要内容,快速、准确的检测微囊藻毒素具有重要的现实应用意义,能够实现对水体的检测预警,及时采取预防措施。
目前微囊藻毒素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)等。现有常用的检测方法都表现出了一些局限性,如HPLC法毒素需要进行预处理,灵敏度较低,检测设备比较昂贵而且需要专业人员操作;ELISA法操作步骤繁琐、成本较高等。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷,本发明的第一个目的是提供一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器;本发明的第二个目的是提供一种制备该生物电极传感器的方法;本发明的第三个目的是提供一种利用该生物电极传感器检测MC-LR型微囊藻毒素的方法。
本发明采用如下技术方案:
一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器,所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极上修饰多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜,并在多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC-LR型微囊藻毒素抗体。
在上述方案的基础上,所述丝网印刷电极是标准三电极,PET基底,工作电极是碳(直径3mm),对电极是碳,参比电极是银/氯化银。
一种制备如上所述的用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器的方法,具体制备步骤如下:
(1)将壳聚糖(CS)溶于0.5%的稀盐酸溶液中,室温条件下磁力搅拌40min,再进行抽滤得到1.0wt%的壳聚糖溶液;
(2)将多壁碳纳米管(MWCNTs)加入到步骤(1)中所得的壳聚糖溶液中,室温条件下磁力搅拌3h,初步得到多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液,其中多壁碳纳米管的浓度为0.5mg/mL;
(3)将步骤(2)中所得的多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液超声10min,进一步得到均匀分散的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液,用1.0wt%的氢氧化钠溶液调节此混合溶液的pH值为4.0~6.0;
(4)将丝网印刷电极(SP)浸入到步骤(3)中所得的多壁碳纳米管-壳聚糖混合溶液中,进行电沉积,电沉积电压为-1.5~-3.0V,沉积时间为20~300s,形成多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜,再用超纯水洗涤得到初步修饰电极(CS-MWCNTs/SP);
(5)将步骤(4)中制得的CS-MWCNTs/SP电极浸入到1.0wt%的戊二醛溶液中0.5~1h;
(6)将步骤(5)中所得修饰后的CS-MWCNTs/SP电极用超纯水洗涤,在其工作电极上滴加5~25μL MC-LR型微囊藻毒素抗体溶液(anti-MC-LR),室温条件下静置交联0.5~3h,得到目标检测(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)电极;
一种检测MC-LR型微囊藻毒素的方法,具体步骤如下:
(1)制备标准HRP酶标微囊藻毒素溶液:将不同浓度的微囊藻毒素溶液(MC-LR)分别与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)以等体积混合,得到一系列标准HRP酶标微囊藻毒素混合溶液(MC-LR+HRP-MC-LR),其混合液中MC-LR的浓度是0.0、0.3、0.8、1.0、2.0ppb;
(2)将生物电极传感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP用超纯水洗涤,在其工作电极上分别滴加5~25μL步骤(1)中所制备的MC-LR+HRP-MC-LR溶液,在室温条件下孵育0.5~3h,得到具有不同浓度MC-LR的修饰电极:MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP;
(3)分别测试步骤(2)中孵育后的MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP电极的电流值Ip;
(4)绘制MC-LR浓度与Ip的标准曲线;
(5)将待测的微囊藻毒素溶液(MC-LR)与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)以等体积混合,取5~25μL混合液滴加到超纯水洗涤过的生物电极传感器上(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP),室温条件下孵育0.5~3h,测试孵育后电极的电流值Ip;结合步骤(4)绘制的标准曲线即可得到待测样品溶液中微囊藻毒素的浓度。
在上述方案的基础上,步骤(3)中测试电流值Ip的方法为:测试工作液为含有2mM对苯二酚(HQ)、1mM双氧水(H2O2)的0.05M PBS(pH=7.0)缓冲液,电化学检测方法为微分脉冲伏安法。
本发明的有益效果是:
本发明通过生物电极传感器实现微囊藻毒素的检测,生物电极传感器将生物样品固定在修饰过的电极表面,将生物分子间的相互作用转化为电信号从而达到检测生物反应活动的目的,电信号输出比ELISA法的光信号更加稳定、灵敏。生物电极传感器可由选择性好的生物材料如特异性抗体构成目标分子的识别元件,可以实现与特定的底物分子发生反应,更具有专一性。生物电极传感器相应的检测系统比较简单,分析速度快,样品用量少,易于发展手持设备,便于实现定点和实时测试,而且成本远低于大型的分析检测仪器,因此可以进行推广普及满足家庭测量需求。
本发明采用活性的海洋多糖壳聚糖为生物电极传感器的载体,壳聚糖是来自于海洋的生物活性多糖,具有好的成膜特性、生物相容性,可以作为电极传感器的修饰材料,用于进一步固定生物活性物质如抗体,显著提高电极负载抗体后的稳定性。本发明引入了多壁碳纳米管,其具有大的比表面积、良好的导电性,可以促进电极检测过程中电子的传递,进一步增强壳聚糖膜的导电性,从而提高响应速度,具有更高的检测灵敏度。
本发明通过实验可以得到壳聚糖、多壁碳纳米管的混合溶液,通过电沉积的方法实现丝网印刷电极的修饰,即采用电信号进行电极修饰,不同于一般的滴涂法,相应的电沉积电压、电沉积时间更容易控制,得到的修饰电极重现性更好,为进一步固定微囊藻毒素抗体奠定良好基础。另外此生物电极传感器的检测过程将生物分子间的相互作用转化为电信号进行检测,即以电信号形式输出,不同于传统的检测微囊藻毒素的光信号输出,电信号灵敏度更高,信号更稳定,且易于操作,进而实现快速准确的检测微囊藻毒素的目的。
附图说明
图1一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器(a)未加入HRP酶标物溶液孵育的电极和(b)加入HRP酶标物溶液孵育的电极的微分脉冲伏安曲线图。
图2一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器检测微囊藻毒素的标准曲线图(内插图是此生物电极传感器检测微囊藻毒素的微分脉冲伏安曲线图)。
具体实施方式
下面通过具体实施例,结合附图对本发明作进一步说明。
本实施例所用到的主要设备:CHI1040C型电化学工作站、SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机、Master-E plus UF超纯水机、84-1A磁力搅拌器、SHZ-DⅢ循环水真空泵。
实施例
1、用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器的制备方法,具体为:
(1)将0.5g壳聚糖溶于50mL 0.5%的稀盐酸溶液中,室温条件下磁力搅拌40min,再进行抽滤得到1.0wt%的壳聚糖溶液;
(2)称取5.0mg多壁碳纳米管加入10.0mL步骤(1)中所得的壳聚糖溶液中,室温条件下磁力搅拌3h,初步得到多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液,其中多壁碳纳米管的浓度为0.5mg/mL;
(3)将步骤(2)中所得的多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液超声10min,进一步得到均匀分散的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液,用1.0wt%的氢氧化钠溶液调节此混合溶液的pH值为5.0;
(4)将丝网印刷(SP)电极(标准三电极,PET基底,工作电极是碳-直径3mm,对电极是碳,参比电极是银/氯化银)浸入到步骤(3)中所得的溶液中,进行电沉积(沉积电压:-1.8V,沉积时间:30s),形成多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜,再用超纯水洗涤得到初步修饰电极(CS-MWCNTs/SP);
(5)将步骤(4)中制得的CS-MWCNTs/SP电极浸入到1.0wt%的戊二醛溶液中0.5h;
(6)将步骤(5)中所得修饰后的CS-MWCNTs/SP电极用超纯水洗涤,在其工作电极上滴加20μL微囊藻毒素抗体溶液(anti-MC-LR),静置交联2h,得到目标检测(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)电极;
2、利用上述制备的生物电极传感器检测MC-LR型微囊藻毒素的方法,具体步骤如下:
(1)制备标准HRP酶标微囊藻毒素溶液:将不同浓度的微囊藻毒素溶液(MC-LR)分别与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)等体积混合,得到一系列标准HRP酶标微囊藻毒素混合液(MC-LR+HRP-MC-LR),混合液中相应微囊藻毒素的浓度为0.0、0.3、0.8、1.0、2.0ppb;
(2)将所得anti-MC-LR/CS-WWCNTs/SP电极用超纯水洗涤,再分别滴加20μL步骤(1)中所制备的系列MC-LR+HRP-MC-LR溶液,在室温条件下孵育2.5h;
(3)在含有2mM HQ、1mM H2O2的0.05M PBS(pH=7.0)缓冲液中分别测试步骤(2)中孵育后电极的电流值Ip,测试方法:微分脉冲伏安法,具体测试扫描条件:起始电压0.12V,终止电压-0.3V,扫描幅度0.05V,记录在-0.12V附近产生的特征峰的电流值Ip;
(4)绘制MC-LR浓度与电流值Ip的标准曲线;
(5)将待测的微囊藻毒素溶液(MC-LR)与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)以等体积混合,取20μL混合液滴加到超纯水洗涤过的生物电极传感器上(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP),室温条件下孵育2.5h,测试孵育后电极的电流值Ip;结合步骤(4)绘制的标准曲线即可得到待测微囊藻毒素的浓度。
性能表征:
1、电化学催化性能
配制两种微囊藻毒素溶液,一种添加HRP酶标物,一种不添加,使用本发明实施1制备的生物电极传感器(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)进行检测,检测结果如图1所示。在所得孵育电极中没有HRP酶标物时未出现特征电流峰(图1a),有HRP酶标物时得到明显的特征电流峰(图1b),由此可知:本发明所制备的anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP生物电极传感器对HRP酶标微囊藻毒素具有良好的催化性能,可用于测定微囊藻毒素的浓度。
2、标准曲线
为了得到目标检测电极(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)对于检测微囊藻毒素具有较好的响应范围以及检测限,我们主要采用微分脉冲伏安法针对不同浓度的微囊藻毒素溶液进行了电化学分析测试。HRP酶标藻毒素混合溶液中微囊藻毒素HRP酶标物和微囊藻毒素与电极上固定化的有限的抗体活性位点发生竞争性结合,微囊藻毒素浓度越大相应与固定化抗体发生免疫反应的HRP酶标物越少,则微分脉冲伏安法测定的峰电流信号会随着待测溶液中微囊藻毒素浓度的增大而呈下降的趋势。
本发明所制备的目标检测电极(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)对检测微囊藻毒素的电化学分析测试实验结果如图2所示,由内插图可知相应峰电流Ip随着微囊藻毒素浓度的增大而逐渐减小,符合竞争免疫反应的预期结果,并且微囊藻毒素浓度在0.0ppb~2.0ppb范围内微分脉冲伏安法测定的峰电流信号随溶液中微囊藻毒素浓度的增大并不是简单的线性变化,较好的符合拟合模型(其中x为MC-LR的浓度,单位为ppb;f(x)为Ip值,单位为A。)的变化趋势,拟合方程是:相关系数是0.9997,检测限为0.02ng/mL。结果表明本发明所述方法制备的生物电极传感器对MC-LR型微囊藻毒素具有较好的响应范围及较低的检测限。
3、微囊藻毒素样品溶液的检测
配制浓度为1.5ppb的MC-LR型微囊藻毒素溶液,用本发明所制备的生物电极传感器进行测试。
将所配制的1.5ppb的微囊藻毒素溶液(MC-LR)与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)以等体积混合,取20μL混合液滴加到超纯水洗涤过的生物电极传感器上(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP),室温条件下孵育2.5h,测试孵育后电极的电流值Ip为1.201×10-7A,代入标准曲线拟合公式中,计算得到待测微囊藻毒素溶液的浓度为1.46ppb,相对误差为-2.7%。
本发明采用活性的海洋多糖壳聚糖为生物电极传感器的载体,首先利用电沉积方法制备CS-MWCNTs/SP电极,再以戊二醛交联微囊藻毒素抗体(anti-MC-LR),得到用于检测微囊藻毒素的anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP电极。在进行测试时进一步再修饰微囊藻毒素和微囊藻毒素HRP酶标物(MC-LR+HRP-MC-LR)混合液,得到了MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/MWCNTs/SP电极。
本发明所制备的生物电极传感器利用竞争免疫反应,实现了快速检测MC-LR型微囊藻毒素的目的。该生物电极传感器具有成本低、实验方法简单、检测时间较短以及经济环保等优点,有效利用了多壁碳纳米管、壳聚糖以及HRP酶的优势,达到了对MC-LR型微囊藻毒素的电化学检测的目的。实验结果也表明了,该传感器对微囊藻毒素的电化学检测响应速度快,与传统检测方法相比具有更低的检测限,不需要大型的检测设备,操作更简单。
以上所述为本发明的较佳实施例,但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改,都落入本发明保护的范围。
Claims (4)
1.一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器,其特征在于,所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极修饰上多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜,并在多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC-LR型微囊藻毒素抗体;
所述丝网印刷电极是标准三电极,PET基底,工作电极是碳,直径3mm,对电极是碳,参比电极是银/氯化银;
制备方法具体制备步骤如下:
(1)将壳聚糖溶于0.5%的稀盐酸溶液中,室温条件下磁力搅拌40min,再进行抽滤得到1.0wt%的壳聚糖溶液;
(2)将多壁碳纳米管加入到步骤(1)中所得的壳聚糖溶液中,室温条件下磁力搅拌3h,初步得到多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液,其中多壁碳纳米管的浓度为0.5mg/mL;
(3)将步骤(2)中所得的多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液超声10min,进一步得到均匀分散的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液,用1.0wt%的氢氧化钠溶液调节此混合溶液的pH值为4.0~6.0;
(4)将丝网印刷电极浸入到步骤(3)中所得的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液中,进行电沉积,电沉积电压为-1.5~-3.0V,沉积时间为20~300s,形成多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜,再用超纯水洗涤得到初步修饰电极CS-MWCNTs/SP;
(5)将步骤(4)中制得的CS-MWCNTs/SP电极浸入到1.0wt%的戊二醛溶液中0.5~1h;
(6)将步骤(5)中所得修饰后的CS-MWCNTs/SP电极用超纯水洗涤,在其工作电极上滴加5~25μL MC-LR型微囊藻毒素抗体溶液,室温条件下静置交联0.5~3h,即得到目标检测电极传感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP。
2.一种检测MC-LR型微囊藻毒素的方法,其特征在于,使用了如权利要求1所述的生物电极传感器。
3.根据权利要求2所述的一种检测MC-LR型微囊藻毒素的方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)制备标准HRP酶标微囊藻毒素溶液:将不同浓度的微囊藻毒素溶液分别与微囊藻毒素HRP酶标物溶液以等体积混合,得到一系列标准HRP酶标微囊藻毒素混合溶液,其混合液中MC-LR的浓度是0.0、0.3、0.8、1.0、2.0ppb;
(2)将生物电极传感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP用超纯水洗涤,再分别滴加5~25μL步骤(1)中所制备的MC-LR+HRP-MC-LR溶液,在室温条件下孵育0.5~3h,得到具有不同浓度MC-LR的修饰电极:MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP;
(3)分别测试步骤(2)中孵育后的MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP电极的电流值Ip;
(4)绘制MC-LR浓度与Ip的标准曲线;
(5)将待测的微囊藻毒素溶液与微囊藻毒素HRP酶标物溶液以等体积混合,取5~25μL混合液滴加到超纯水洗涤过的生物电极传感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP上,室温条件下孵育0.5~3h,测试孵育后电极的电流值Ip;结合步骤(4)绘制的标准曲线即可得到待测样品溶液中微囊藻毒素的浓度。
4.根据权利要求3所述的一种检测MC-LR型微囊藻毒素的方法,其特征在于,步骤(3)中测试电流值Ip的方法为:测试工作液为含有2mM对苯二酚、1mM双氧水的0.05M PBS缓冲液,pH=7.0,电化学检测方法为微分脉冲伏安法。
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