CN101387617B - 丝网印刷电极及其合成氯霉素分子印迹膜的方法 - Google Patents

Abstract

一种高分子技术领域的丝网印刷电极及其合成氯霉素分子印迹膜的方法，本发明中将聚合液在一次性丝网印刷电极表面直接原位聚合过程中嵌埋模板分子，然后将模板分子洗脱，使分子印迹膜内部形成具有固定大小和形状的“空穴”及具有确定排列的功能基团，其对模板分子的立体结构具有记忆性，待测样品中的氯霉素分子能够与这种“空穴”特异性的结合，从而改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大，过膜电流增加。通过将覆盖有氯霉素分子印迹膜的丝网印刷电极与电流型传感器相连接，可以快速、灵敏的检测氯霉素的浓度。用此分子印迹膜检测氯霉素，样品前处理简单，检测时间短，抗干扰能力强，易于产业化生产。

Description

丝网印刷电极及其合成氯霉素分子印迹膜的方法

技术领域

本发明涉及的是一种高分子技术领域的电极及其合成的方法，具体涉及一种丝网印刷电极及其合成氯霉素分子印迹膜的方法。

背景技术

氯霉素作为一种常见的高效广谱抗菌药在畜牧业和水产养殖业中违法应用的情况仍然存在，如应用氯霉素作为抗菌药实现对伤寒杆菌及其他沙门氏菌感染的控制。随着人们生活水平的提高，人们对健康环保意识的逐渐增强，广大消费者对食品品质的要求提高，更加看重食品的营养和安全，所以食品安全问题在我国日益受到重视，国内外研究表明，氯霉素残留抑制骨髓的造血机能，其表现症状为可逆性的血细胞减少和不可逆的再生障碍性贫血。此外，长期微量摄入氯霉素，不仅可使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，还会引起机体正常菌群的失调，使人们易患各种疾病。因而建立一种快速有效的检测氯霉素的方法，对于加强食品安全，维护人体健康有着重要意义。

当前测定氯霉素残留的主要方法有微生物法、仪器分析法、免疫分析法以及分子印迹技术为基础的传感器法。当前国内外涉及氯霉素残留检测的确证方法主要为仪器分析法(气相色谱法、液相色谱法、色谱质谱联用技术)，但是这些方法样品前处理过程繁琐、需要大型精密仪器、检测费用较昂贵，不适于现场快速检测。筛选方法主要包括酶联免疫分析法、胶体金试纸法、蛋白芯片技术及微生物法，但由于前三个方法中所用的抗体开发周期长，且容易出现假阴性及假阳性结果而使其在实际检测中的应用受到很大限制。微生物方法由于其特异性较差而未能推广应用。已有文献表明，采用分子印迹技术方法测定氯霉素残留，具有样品前处理简单、响应时间短、检测成本低、易于产业化生产等优点，成为当前研究氯霉素残留检测的一个重要方向。

经对现有技术文献的检索发现，专利申请号为200610023904.1的中国专利，名称为“一种氯霉素分子印迹固相萃取小柱的制备方法”，该专利中提出将模板分子氯霉素、功能单体甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯按一定比例混合后，通过悬浮聚合而成氯霉素分子印迹聚合物微球并将其填充于聚丙烯固相萃取小柱内，制得氯霉素分子印迹固相萃取小柱，主要用于选择性纯化、富集样品溶液中的氯霉素残留。该方法的缺陷在于结合于萃取柱内分子印迹微粒上的模板分子很难用常规的化学方法进行洗脱，因而经该萃取柱所得的被检物质的浓度过低而使检测的灵敏度受到很大的限制，不能代替现有高效液相色谱分析仪器中所用的固相富集、分离装置。该萃取小柱成本高、制备时间长，且很难与自动型检测设备相连接而使其在实际应用中的价值较小。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出了一种丝网印刷电极及在其上合成氯霉素分子印迹膜的方法，将聚合液在一次性丝网印刷电极表面直接原位聚合过程中嵌埋模板分子，然后将模板分子洗脱，使分子印迹膜内部形成具有固定大小和形状的“空穴”及具有确定排列的功能基团，其对模板分子的立体结构具有记忆性，待测样品中的氯霉素分子能够与这种“空穴”特异性的结合，从而改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大，过膜电流增加。通过将覆盖有氯霉素分子印迹膜的丝网印刷电极与电流型传感器相连接，可以快速、灵敏的检测氯霉素的浓度。用此分子印迹膜检测氯霉素，样品前处理简单，检测时间短，抗干扰能力强，易于产业化生产，在氯霉素残留的现场快速检测领域将有很好的应用前景。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明涉及一种丝网印刷电极，包括：电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层、分子印迹膜片，在电极基片上，印制上接线端子、电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子、电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，两条电极连线相互平行，电极连线在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层PVC(聚氯乙烯)绝缘体，接线端子是裸露的导电材料薄膜，工作电极的形状为圆形块状，对电极的形状为与工作电极同心相离的半圆环形块状，工作电极与对电极表面设有由分子印迹技术紫外聚合制备的分子印迹膜片。

所述电极基片，其材料为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、基乙烯四种聚合物的其中之一，其中优先选择聚氯乙烯，上述聚合物为片材或卷材。

所述分子印迹膜片，为直径5mm-6mm，厚80μm-100μm。

本发明还涉及一种如上述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，包括如下步骤：

步骤一，氯霉素分子印记膜片的制备：称取氯霉素模板分子与功能单体溶于有机溶剂，超声波震荡混合均匀后加入交联剂，再超声波震荡混合均匀后加入粘合剂水性聚氨酯，再经超声波震荡混合均匀，然后加入引发剂，超声波震荡混合均匀，通氮气除氧，将上述操作所制备的溶液滴加到丝网印刷电极中工作电极与对电极的表面，盖玻片压盖，1000W紫外光聚合，形成内含印迹分子的分子印迹膜；

步骤二，氯霉素分子印迹膜内部氯霉素分子的去除：将步骤一所得的氯霉素分子印迹膜用体积比为9：1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，于双蒸水中保存备用。

所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯酰胺中的一种，优选甲基丙烯酸。

所述溶剂为四氢呋喃、二甲亚砜、无水乙醇或甲苯中的一种，优选四氢呋喃，溶剂体积为350μl-400μl。

所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸、3，5-二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种，优选乙二醇二甲基丙烯酸。

所述引发剂为偶氮二异丁氰。

所述超声波震荡，其时间为5分钟-15分钟。

所述通氮气除氧，其时间为5分钟-10分钟。

所述将溶液滴加到丝网印刷电极中工作电极与对电极的表面，溶液的滴加量为8μl-15μl。

所述紫外光聚合，其时间为15分钟-30分钟。

所述氯霉素模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1：5：20。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)所用的四氢呋喃、乙二醇二甲基丙烯酸等亲水性溶剂作反应溶剂和制孔剂，所制备的聚合物可直接应用于含水溶剂，降低了分子印迹膜制备过程及使用过程对条件的要求，扩大了材料的应用范围；

(2)反应过程中加入了粘合剂水性聚氨酯，增加了分子印迹膜的柔韧性，防止了在聚合过程中分子印迹膜出现裂痕的现象，并使所制备的分子印迹膜空穴分布均匀，十分有利于检测效果的提高；

(3)本发明的方法获得的分子印迹膜片可应用于制备电流型生物传感器，本发明加工方法简便、成本低，用该丝网印刷电极制成的电流型传感器检测氯霉素操作方便，对于不同样品，只需替换附有氯霉素分子印迹膜的丝网印刷电极即可，且具有响应时间快、使用寿命长、重现性良好和特异性识别能力强等优点。

附图说明

图1为本发明的丝网印刷电极的平面结构示意图；

图2为本发明的丝网印刷电极的侧视图；

图3为本发明中使用丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜的进行检测的原理示意图；

图4为本发明丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜的吸附动力学曲线图；

图5为本发明丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜检测氯霉素标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1和2所示，本实施例涉及一种丝网印刷电极，包括：电极基片1、接线端子2、电极连线3、工作电极4、对电极5、绝缘层6、分子印迹膜片7，在电极基片1上，印制上接线端子2、电极连线3与工作电极4连成一体的一条电极基体和接线端子2、电极连线3与对电极5连成一体的另一条电极基体，两条电极连线3相互平行，电极连线3在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层PVC(聚氯乙烯)绝缘体6，接线端子2是裸露的导电材料薄膜，工作电极4的形状为圆形块状，对电极5的形状为与工作电极4同心相离的半圆环形块状，工作电极4与对电极5表面设有由分子印迹技术紫外聚合制备的分子印迹膜片7。

所述电极基片1，其长度为35mm-38mm、宽9mm-10mm、厚0.4mm-0.45mm；

所述接线端子2，其长度为9mm-10mm、宽为1mm-1.2mm；

所述电极连线3，其长度为20mm-25mm、宽为0.8mm-1mm；

所述工作电极4，为直径1mm的实心块状；

所述对电极5，其外直径为4mm、内直径为2mm；

所述两条平行电极连线3，其之间的间距为2.8mm-3mm；

所述电极基片1，其材料为聚氯乙烯，聚氯乙烯为片材或卷材。

所述分子印迹膜片7，为直径5mm-6mm，厚80μm-100μm。

本实施例还涉及一种丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜的方法，包括如下步骤：

步骤一，氯霉素分子印记膜片的制备：称取氯霉素模板分子与功能单体溶于有机溶剂，超声波震荡混合均匀后加入交联剂，再超声波震荡混合均匀后加入粘合剂水性聚氨酯，再经超声波震荡混合均匀，然后加入引发剂，超声波震荡混合均匀，通氮气除氧，将上述操作所制备的溶液滴加到丝网印刷电极中工作电极与对电极的表面，盖玻片压盖，1000W紫外光聚合，形成内含印迹分子的分子印迹膜；

步骤二，氯霉素分子印迹膜内部氯霉素分子的去除：将步骤一所得的氯霉素分子印迹膜用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，于双蒸水中保存备用。

采用丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜，可作为电流型传感器的传感元件以快速、灵敏、准确的检测氯霉素残留。如图3所示，为使用本实施例中丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜进行检测的工作原理图，丝网印刷电极上的分子印迹膜上的特异性空穴选择性的与氯霉素分子结合，造成分子印迹膜电化学性质变化，导致恒电位激励下的电流变化，电流信号经电流-电压转换器转化为电压信号并放大，再经模数转换器转化为数字信号，经单片机分析处理后，数据在存储器中保存记录并可随时提取，同时氯霉素浓度直接从液晶显示电路读出，数据可通过USB接口传输到计算机作长期储存。

如图4所示，为丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜的吸附动力学曲线图，分子印记膜对氯霉素分子在40分钟内可达到吸附平衡。

实施例1

采用丝网印刷技术将导电银浆在电极基片1上印刷两条电极连线3和接线端子2的基体，电极连线3表面涂覆一层PVC绝缘体，下端的工作电极4和对电极5采用溅射石墨法涂覆一层导电石墨。用50％硝酸浸泡处理，再用蒸馏水冲洗3次。晾干，4℃保存备用。

称取0.05g氯霉素和70μl甲基丙烯酸功能单体溶于380μl四氢呋喃溶剂中，超声混合10分钟后加入乙二醇二甲基丙烯酸交联剂，超声混合10分钟，再往反应体系中加入70μl水性聚氨酯粘合剂，超声混合10分钟后加入0.02g的引发剂偶氮异丁氰，超声混合20分钟后，通氮气5分钟，将制好的混合液滴加10μl到丝网印刷电极的工作电极和对电极区域，盖上盖玻片，1000W紫外光距离18cm照射15分钟，重复两次，得到内含氯霉素的分子印迹膜。

将所制得的承载分子印迹膜的丝网印刷电极用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，得到具有氯霉素空间结构空穴的分子印迹膜。通过电镜扫描分析、紫外分光光度法以及Scatchard方程分析来观察分子印记膜的特异性吸附效果。电镜扫描显示，该方法制备的印迹膜表面存在大量可以特异性识别模板分子印迹微孔，直径介于0.2-0.5μm之间。紫外分光广度分析及Scatchard方程分析结果显示：分子印迹膜无最大吸附量可达到13.66μmol/g，平衡离解常数为3.75mmol/L，分子印迹膜对氯霉素分子的选择性吸附作用在40min内基本达到平衡。

本实施例中采用1000W紫外光照射15分钟，重复两次聚合成膜，印迹键合的效果达到最佳。

检测样品——本实施例中以检测牛奶样品中氯霉素残留量为例：

制作标准曲线：利用高氯酸(2M)为支持液，加入氯霉素标准液，配制成含氯霉素分别为20μg/L；40μg/L；60μg/L；80μg/L；100μg/L；120μg/L五个不同梯度浓度，然后将与电流型传感器相连接的分子印迹丝网印刷电极插入到待检液中，使分子印迹膜片完全浸入到检测液中，检测时针对每一浓度梯度的氯霉素溶液，首先磁力搅拌器搅拌10min，之后通过电流型传感器进行检测，记录结果并分析，检测结束后，更换带有分子印迹膜片的丝网印刷电极条，重复检测五次，然后根据五次做出的实验结果，建立氯霉素检测的标准曲线，如图5所示。

样品处理：取经高效液相色谱—质谱联用技术确证不含有氯霉素残留的牛奶样品5个，用10ml移液器准确移取分别样品5ml放至10ml离心管中，加入1ml含有60μg/L的氯霉素标准液，振荡混匀15min，再用6ml乙酸乙酯进行萃取，收集含氯霉素的有机相，40℃、240mbar条件下蒸发去除有机溶剂，最后加入5ml乙腈-2M高氯酸水溶液，体积比为3：2，搅拌20s，振荡混合均匀作为待测溶液。

取10微升处理的样品滴加到上述方法制成的丝网印刷电极的分子印迹膜上，然后将其插入电流型传感器，测定并记录读数，并计算出氯霉素残留量。针对同一样品，更换丝网印刷电极条，连续检测5次，以所得的平均值作为检测值。在本实施例中，所检测的牛奶样品中氯霉素的标加回收率为95％，相对标准差为2.6％，所检样品中氯霉素的平均含量为58ng/g。该方法在牛奶样品中的检测限为1.6μg/kg，线性范围介于12μg/kg-22.40mg/kg之间，线性方程为：Y＝2.216+0.162X，R＝0.987。将制备好的10个丝网印刷电极上原位合成的氯霉素分子印迹膜在-4℃条件下保存于双蒸水中，经过两个月之后重新检测相同浓度的氯霉素标准溶液，检测的结果表明两次检测结果的相对标准误差值小于3.7％，因此本实施例丝网印刷电极上原位合成氯霉素分子印迹膜具有良好的重复性和稳定性。

实施例2

在氯霉素分子印迹膜的制备过程中，紫外聚合时间为连续照射30分钟，其他条件不变。在检测过程中，标准曲线的制备同实施例1，检测样品采用猪肉。

样品处理：取经高效液相色谱—质谱联用技术确证不含有氯霉素残留的猪肉样品5个，取1克肉样，放入组织匀浆机的样品杯中，加入10毫升0.1M pH为7.2的磷酸盐缓冲液，搅碎并均质化，将其转移到15ml离心管中，加入1ml含有40μg/L的氯霉素标准液，再用6ml乙酸乙酯进行萃取，振荡混匀15min，收集含氯霉素的有机相，40℃、240mbar条件下蒸发去除有机溶剂，最后加入乙腈-2M高氯酸水溶液，体积比为3：2，搅拌20s，振荡混合均匀作为待测溶液。在本实施例中，所检测市售猪肉中氯霉素的回收率为96.5％，所检样品中氯霉素的平均含量为38ng/g。用不同浓度的氯霉素标准品进行标加试，并重复三次，所得的检测值经统计分析，得出该方法检测肉品中氯霉素的检测限为2.8μg/kg，线性范围介于20μg/kg-13.60mg/kg之间，线性方程为：Y＝4.178+0.269X，R＝0.969。稳定性及重复性试验同实施例1。

实施例3

在氯霉素分子印迹膜的制备过程中，丝网印刷电极接线端子、电极连线、工作电极和对电极均用导电银浆印制，其他与实施例1同。在检测过程中，标准曲线的制备同实施例1，检测样品采用鸡蛋。

样品处理：取经高效液相色谱—质谱联用技术确证不含有氯霉素残留的鸡蛋样品5个，取5ml放至10ml离心管中，振荡混匀15min，加入1ml含有20μg/L的氯霉素标准液，再用3ml乙酸乙酯进行萃取，收集含氯霉素的有机相，40℃、240mbar条件下蒸发去除有机溶剂，最后加入5ml乙腈-2M高氯酸水溶液，体积比为3：2，搅拌20s，振荡混合均匀作为待测溶液。在本实施例中，所检测鸡蛋中氯霉素的回收率为92.7％，所检样品中氯霉素的平均含量为17ng/g。用不同浓度的氯霉素标准品进行标加试，并重复三次，所得的检测值经统计分析，得出该方法检测肉品中氯霉素的检测限为2.8μg/kg，线性范围介于10μg/kg-8.60mg/kg之间，线性方程为：Y＝7.312+0.197X，R＝0.993。稳定性及重复性试验同实施例1。

Claims (9)

1.一种丝网印刷电极，包括：电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、绝缘层、分子印迹膜片，在电极基片上，印制上接线端子、电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子、电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，两条电极连线相互平行，电极连线在电极基体的中间部分，其表面涂覆一层PVC绝缘体，其特征在于，工作电极的形状为圆形块状，对电极的形状为与工作电极同心相离的半圆环形块状，工作电极与对电极表面设有由分子印迹技术紫外聚合制备的分子印迹膜片。

2.根据权利要求1所述的丝网印刷电极，其特征是，所述电极基片，其材料为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯三种聚合物的其中之一，上述聚合物为片材或卷材。

3.根据权利要求1所述的丝网印刷电极，其特征是，所述分子印迹膜片，其直径为5mm～6mm，厚度为80μm～100μm。

4.一种如权利要求1所述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，氯霉素分子印迹膜片的制备：称取氯霉素模板分子与功能单体甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯酰胺中的一种溶于有机溶剂，超声波震荡混合均匀后加入交联剂，再超声波震荡混合均匀后加入粘合剂水性聚氨酯，再经超声波震荡混合均匀，然后加入引发剂，超声波震荡混合均匀，通氮气除氧，将上述操作所制备的溶液滴加到丝网印刷电极中工作电极与对电极的表面，盖玻片压盖，1000W紫外光聚合，形成内含印迹分子的分子印迹膜；

步骤二，氯霉素分子印迹膜内部氯霉素分子的去除：将步骤一所得的氯霉素分子印迹膜用体积比为9∶1的甲醇-乙酸混合溶液经索式提取器中反复洗脱氯霉素分子，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，于双蒸水中保存备用。

5.根据权利要求4所述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，其特征是，所述溶剂为四氢呋喃、二甲亚砜、无水乙醇或甲苯中的一种，溶剂体积为350μl～400μl。

6.根据权利要求4所述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，其特征是，所述将溶液滴加到丝网印刷电极中工作电极与对电极的表面，溶液的滴加量为8μl～15μl。

7.根据权利要求4所述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，其特征是，所述氯霉素模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1∶5∶20。

8.根据权利要求4所述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，其特征是，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸、3，5-二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种。

9.根据权利要求4所述的丝网印刷电极的合成氯霉素分子印迹膜的方法，其特征是，所述引发剂为偶氮二异丁氰。

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