CN105111370B - 一种氯霉素分子印迹聚合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氯霉素分子印迹聚合物及其制备方法，以氯霉素为模板分子，以甲基丙烯酸为功能单体，形成主客体配合物，加入交联剂EDMA发生自由基共聚，最后用溶剂甲醇/乙酸混合液将聚合物从溶剂中沉淀出来，得到氯霉素分子印迹聚合物。其中CAP与甲基丙烯酸与EDMA的摩尔比为1:0.5:20。本发明方法生产出具有非常高的选择性和特异性的氯霉素分子印迹聚合物，有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境能力。本发明成本低廉、操作简单、反应条件容易控制。
Description
技术领域
本发明属于分子印迹聚合物制备技术领域，具体设计一种氯霉素分子印迹聚合物及其制备方法。
背景技术
近年来，世界各国越来越关注和重视食品安全卫生，动物源食品中的兽药残留问题在食品安全问题在食品安全卫生方面占有重要地位。兽药的污染事件一般涉及面广，社会影响大，经济损失严重。在国际贸易中已经成为发达国家对第三世界国家实施技术壁垒的重要手段。为保护人民的生命安全与健康，打破欧美等发达国家的技术壁垒，除了加强兽药使用管理和动物养殖方式外，研究先进的兽药残留检测技术是必由之路。
氯霉素（chloramphenicol，CAP）是由委内瑞拉链丝菌产生的一种抗生素。它的化学结构中含有对硝基苯基、丙二醇与二氯乙酰胺三个部分，分子中还含有氯。它是一种白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦。在甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇中易溶。在干燥时稳定，在弱酸性和中性溶液中较安定，煮沸也不见分解，但遇碱类易失效。CAP作为一种光谱抗菌药应用到今天已经有五十多年了，它也是国际是第一个被禁止用于食用性动物饲料的抗生素，它能导致人体产生严重的再生障碍性贫血和致命的“灰婴综合症”，因此，国际上规定CAP在动物源性食品中的最大允许残留量为0。TAP和FF作为CAPs抗生素，国外已经开始部分代替CAP应用于养殖业。CAP，TAP和FF的化学性质都很稳定，在曾经用药的食用性动物组织中很容易产生药物残留。但是目前各国对动物源性食品中CAP的检测低限在0.1-0.3μg/kg，已经达到仪器的检测极限，而对于TAP和FF的检测的灵敏度业不够高，加上生物样品基质复杂，所需提取净化步骤多，对CAPs的测定不但昂贵，而且特别繁琐费时。因此，目前的检测方法并不能完全达到对CAP实行严格快速监控的需要。TAP和FF作为CAP的替代兽药，对其加快开发灵敏度高，检测限低的确证方法也迫在眉睫。
目前生物制品或动物源性食品的前处理基本都采用非特异性固相萃取柱，由于其选择性较低，样品提取液的成分依然十分复杂，不但对后续检测仪器的要求较高，而且对色谱柱和检测器的损耗都较大。而如果采用能够选择性地从复杂样品中吸附烙印分子或同烙印分子结构结构相近的某一族化合物的MIPs作为吸附材料，则可以分离复杂生物样品中痕量的检测物，降低检测低限，提高分析方法的精密度和灵敏度。在大型精密仪器难以和发达国家相比的情况下，提高样品前处理的水平，减少杂质干扰，不失为提高检测方法灵敏度的一条有效途径，但是目前对于这方面的研究国内报道极少。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种对氯霉素高选择性吸附的氯霉素分子印迹聚合物及其制备方法。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明氯霉素分子印迹聚合物，以氯霉素为模板分子，以甲基丙烯酸为功能单体，形成主客体配合物，加入交联剂EDMA发生自由基共聚，最后用溶剂甲醇/乙酸混合液将聚合物从溶剂中沉淀出来，得到氯霉素分子印迹聚合物。
本发明所述的氯霉素分子印迹聚合物具体通过以下方法制备：
1）准确称取CAP于适量的致孔剂中，充分振荡使其溶解，然后加入功能单体甲基丙烯酸（MAA），于振荡器中充分振荡使其完全反应；
2）继续加入交联剂EDMA和引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），充分混匀后移入安培瓶中，使用超声波处理5 min，使不存在可见固体颗粒存在，然后充氮10~15分钟；
3）在酒精喷灯高温下把安培瓶拉丝密封，置于恒温水浴锅中在恒定的温度下热聚合反应完全后，制得块状聚合物；
4）将制得的块状聚合物用甲醇洗去未反应的试剂，放置晾干，研钵磨碎，置于甲醇/乙酸混合液中，超声洗脱，得到氯霉素分子印迹聚合物。
进一步，所述的致孔剂为四氢呋喃，所述的CAP与甲基丙烯酸的摩尔比为1:0.5。
进一步，所述的交联剂的加入量为CAP与交联剂的摩尔比为1:20。
进一步，所述的恒温水浴锅的温度为60℃。
进一步，所述的甲醇/乙酸混合液中甲醇和乙酸的体积比为9:1。
本发明的有益效果为：本发明是以甲基丙烯酸为功能单体，以EDMA为交联剂、四氢呋喃为致孔剂、偶氮二异丁腈为引发剂，并按照特定比例及生产条件等，生产出具有非常高的选择性和特异性的氯霉素分子印迹聚合物，有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境能力。本发明成本低廉、操作简单、反应条件容易控制。
附图说明
图1是索氏抽提法抽提时间与CAP总量的关系；
图2是超声波提取法提取时间对抽提总量的影响；
图3是密闭微波抽提法时间对抽提总量的影响；
图4是致孔剂对MIPs的结合能力的影响；
图5是烙印分子与功能单体的摩尔比对MIPs的结合能力的影响作用；
图6是烙印分子与交联剂的摩尔比对MIPs的结合能力的影响作用；
图7是聚合温度对MIPs的结合能力的影响作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本发明提供了一种氯霉素分子印迹聚合物，以氯霉素为模板分子，以甲基丙烯酸为功能单体，形成主客体配合物，加入交联剂EDMA发生自由基共聚，最后用溶剂甲醇/乙酸混合液将聚合物从溶剂中沉淀出来，得到氯霉素分子印迹聚合物。其中CAP与甲基丙烯酸与EDMA的摩尔比为1:0.5:20。
具体通过以下方法制备：
准确称取一定量的CAP于适量的致孔剂中，充分振荡使其溶解，然后按照特定的摩尔比例加如功能单体甲基丙烯酸（MAA），于振荡器中充分振荡使其完全反应，再按适宜的摩尔比加入交联剂EDMA和引发剂偶氮二异丁腈（AIBN），充分混匀后移入安培瓶中，使用超声波处理5 min，使不存在可见固体颗粒存在，然后充氮10~15分钟，尽可能完全赶去空气（氧气）。在酒精喷灯高温下把安培瓶拉丝密封，然后置于恒温水浴锅中在恒定的温度下热聚合反应完全后，制得块状聚合物。讲制得的块状聚合物用甲醇洗去为反应的试剂，放置晾干，研钵磨碎，。
称取相同量的聚合物粉末放入具塞锥形瓶中，加入一定量甲醇/乙酸（9:1），放入超声波中震荡，得到氯霉素分子印迹聚合物。
实施例1 氯霉素分子印迹聚合物中氯霉素的去除方法的研究
1）索氏抽提法
将以甲基丙烯酸(MAA)为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，采用热聚合方式制备的CAP含量为1.296 g的MIPs放入索氏抽提器的抽提室中，加入150 mL甲醇，调节恒温水浴槽的温度，使得抽提室中的甲醇每45 min抽空一次，每隔4小时取50 uL抽提液，测定其中CAP的含量，并计算CAP的总提取量。
另将同样方法制备的相同重量的MIPs放入另一索氏抽提器中，以乙腈作为抽提液，同样方法测定其中CAP的含量和计算CAP的总提取量。
表1 抽提时间与CAP总量的关系
| 时间（h） | CAP总抽提量（甲醇） | CAP总抽提量（乙腈） |
| 8 | 87.6 | 155.8 |
| 12 | 131.1 | 249.7 |
| 16 | 203.6 | 375.4 |
| 20 | 298.3 | 472.2 |
| 24 | 380.2 | 578.5 |
| 28 | 415.7 | 623.8 |
| 32 | 503.9 | 728.1 |
| 40 | 623.5 | 807.4 |
| 48 | 704.3 | 931.1 |
| 56 | 827.5 | 1001.7 |
| 64 | 937.1 | 1098.6 |
| 72 | 1013.7 | 1156.2 |
| 80 | 1078.6 | 1156.8 |
| 88 | 1132.5 | 1156.8 |
| 96 | 1149.3 | 1156.8 |
| 104 | 1154.2 | 1156.8 |
从图1可见，以乙腈和甲醇两种有机溶剂分别作为抽提液时，抽提效果不同。以乙腈作为抽提液时，CAP的提取速度较快，72小时左右，基本可达到CAP抽提完全；而以甲醇作为抽提液时，CAP的提取速度相对较慢，104小时左右才可达到CAP抽提完全的目的。因此在MIPs的制备中，对于烙印分子的提取，应根据烙印分子、功能单体及聚合条件的不同，采用合适的溶剂作为索氏抽提液，以缩短抽提时间，获得较好的抽提效果。
2）超声波提取法
称取1.000 gMIPs颗粒于150 mL具塞三角瓶中，加入50 mL甲醇/乙酸（9:1，v／v），在超声波作用下连续萃取10次，每30 min更换一次萃取液。萃取液置于50 mL容量瓶中，用甲醇/乙酸定容至刻度，精确量取0.5 mL于10 mL容量瓶中并定容，测得溶液中CAP的含量，并算出总的CAP的量。
表2时间对抽提总量的影响
| 超声时间（min） | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 |
| CAP提取总量（mg） | 71.93 | 79.216 | 80.063 | 80.469 | 80.469 |
由图2可知，在超声波作用下，聚合物中的模板分子CAP很快的就被洗脱出来，在60min左右基本上就可以完全抽提出来，大大减少了抽提时间，较索氏抽提法更省时省力，有效的节省了实验试剂，算是可取的一种有效的抽提方法。
3）密闭微波抽提法
将收集到得聚合物粉末称取1.0355 g小烧杯中，用甲醇/乙酸（v/v，9:1）作为溶剂，取溶剂25 mL于小烧杯中将其溶解，转入反应罐中，密闭微波的压强设置为0.9 Mpa.时间为5 min，待冷却后离心过滤，将萃取液置于25 mL容量瓶中，用甲醇/乙酸定容至刻度，精确量取0.5 mL于10 mL容量瓶中并定容，测定其CAP的含量。并计算CAP的总提取量。
表3时间对抽提总量的影响
| 时间（min） | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| CAP总提取量（mg） | 47.673 | 58.83 | 61.522 | 62.278 | 62.437 | 62.439 |
由图3可知，在0~15 min内，CAP提取总量随着时间增长而增加，当微波波处理时间超过15 min后，随着时间的延长，CAP的提取总量不再有多大变化，这表明，随着时间的延长，CAP已经基本抽提完。因此选择15 min为最佳处理时间。
比较以上3种抽提方法的抽提时间与抽提总量的关系可以发现，索氏抽取法抽取时间太长，而且工序比较麻烦，需要每隔4 h抽取并测量一次；而超声波抽提法抽提时间适中，抽提效率良好，试剂使用量也不是太多，是一种简便实际的抽提方法；密闭微波时间是最短的，效率最高，试剂使用量少，但是冷却时间远比反应时间长，而且仪器比较昂贵，操作要求高。所以，本着利用最简便，最合适的实验条件来完成实验，在以下的MIPs的制备中，对于烙印分子CAP的提取，可采用超声波抽提法。
实施例2 甲基丙烯酸为功能单体的制备条件的优化
1）致孔剂的影响
致孔剂决定了模板分子与功能单体之间的结合程度，还会影响分子烙印聚合物的空穴结构，从而影响其与目标分子在空间结构上的匹配，为了考察致孔剂的影响，分别取161.55 mg CAP溶于2.5 mL甲醇、乙腈、丙酮和四氢呋喃，分别加入0.17 mL MAA作为功能单体，充分反应后各加入1.888 mL EDMA和23.16 mg AIBN，充分混合均匀后移入安培瓶中，超声、充氮脱氧、密封，置于60℃恒温水浴中反应24小时，制得聚合物。将CAP充分提取后，分别测定聚合物对CAP的结合能力(B)。结果如表4所示。
表4 致孔剂对MIPs的结合能力（B）的影响
| 致孔剂种类 | 甲醇 | 乙腈 | 丙酮 | 四氢呋喃 |
| 结合能力（µmol∕g） | 71.6 | 86.1 | 104 | 121 |
由图4可知，采用不同的有机溶剂作为致孔剂，由于它们具有不同的物理、化学性质，因而影响到最终制备的MIPs中模板分子与功能单体之间的准确匹配作用、所获得空穴的数量与立体结构以及分布。其中，甲醇的作用效果最差，四氢呋喃的作用效果相对较好，因此可采用四氢吠喃作为致孔剂。
2）烙印分子与功能单体比例的影响
取5份96.93 mg CAP，各加入1.5 mL四氢呋喃，然后按照烙印分子与功能单体比例为1:0.5，1:2，1:4，1:8，1:10分别加入MAA作为功能单体，完全反应后各加入1.133 mL EDMA和20.8 mg AIBN，充分混匀后移入安培瓶中，超声、充氮脱氧、密封，置于60℃恒温水浴中反应30小时，制得聚合物。将聚合物中的CAP充分提取后，分别测定其对CAP的结合能力(B)。结果如表5所示。
表5 烙印分子与功能单体的摩尔比对MIPs的结合能力的影响作用
| 烙印分子与功能单体的摩尔比 | 1:0.5 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:10 |
| 结合能力（µmol∕g） | 140 | 108 | 122 | 103 | 96 |
由图5可知，烙印分子与功能单体之间存在一个最佳比例。当MAA相对含量太低时，只有少部分CAP能与MAA形成多作用结合的稳定配合物，而剩余的CAP与MAA形成的配合物仅依靠单个或少量的作用力结合，甚至会有CAP处于游离状态，这会造成聚合物中记录CAP分子空间结构的空穴密度降低，或由于空穴中存在单个或少量结合作用位点，在与CAP的识别过程中结合作用力微弱，不能有效捕获烙印分子。但当加入的MAA相对于模板分子比例过高时，会使大量过剩的MAA残留在聚合物中；在识别分离过程中，游离MAA的功能键同样会以非空间特异性的形式同CAP和其它杂质分子作用，这与MIPs空穴中的MAA功能键的特异性结合作用（模板识别作用）产生竞争；大量的CAP没有进入空穴发生识别作用，而与聚合物骨架上的非特异性的MAA产生吸附作用；这种非特异性吸附作用同样存在于MAA的功能键与其它杂质分子之间，不利于随后样品处理中的净化作用。
3）烙印单体与交联剂比例的影响
取5份96.93 mg的CAP，各加入1.5 mL四氢呋喃和0.102 mL MAA，混匀后，按照烙印分子与交联剂比例为1:10，1:15，1:20，1:25，1:30分别加入EDMA，再各加入20.8 mg AIBN，充分混匀后移入安培瓶中，超声、充氮脱氧、密封，置于65℃恒温水浴中反应28小时，制得聚合物。将CAP充分提取后，分别测定其对CAP的结合能力(B)。实验结果如表6所示。
表6 烙印分子与交联剂的摩尔比对MIPs的结合能力（B）的影响作用
| 烙印分子与交联剂的摩尔比 | 1:10 | 1:15 | 1:20 | 1:25 | 1:30 |
| 结合能力（µmol∕g） | 76.8 | 91.7 | 108 | 105 | 103 |
由图6可知，烙印分子和交联剂EDMA的摩尔比要保持一个最佳水平，以保证所制备的MIPs具有足够的交联度，既可保持MIPs的烙印“记忆”空穴结构，又能达到较高的结合容量。若交联剂的用量过少，制得的MIPs不具有足够的交联度，因而不能使功能单体在聚合物内三维空间上规则排列，形成与烙印分子空间结构相匹配的空穴，从而使MIPs的结合能力下降，以其制备的固相萃取柱的柱容量较低；若交联剂的用量过大，则 MIPs固定相单位重量中功能单体的数目减少，烙印产生的“记忆”空穴数目减少。
4）聚合温度的影响
按照CAP 96.93 mg、四氢呋喃1.5 mL，MAA 0.102 mL，EDMA 1.133 mL，AIBN 20.8mg配制反应液，充分混匀后移入安培瓶中，超声、充氮脱氧、密封，然后分别置于40~80℃不同温度的恒温水浴中反应，至溶剂完全凝聚为聚合物后取出。将聚合物中的CAP充分提取出后，分别测定聚合物对CAP的结合能力(B)。实验结果如表7所示。
表7 聚合温度对MIPs的结合能力(B)的影响作用
| 聚合温度（℃） | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 |
| 聚合时间（h） | 72 | 32 | 26 | 16 | 8 |
| 结合能力（µmol∕g） | 133 | 130 | 123 | 98.9 | 94.2 |
由图7可知，聚合温度越高，聚合物生成的速度就越快，但聚合速度越快，越容易造成受热不均而导致模板分子与单体形成的聚合物越不稳定，从而使烙印空穴失真。而当聚合温度较低时，聚合物的结构比较均匀紧密，表现极好的结合能力，但反应速度过慢，聚合时间太长，不利于实际应用。
5）最佳条件的确定
结合前面的单因素试验，选择烙印分子与功能单体的比例、烙印分子与交联剂的比例、致孔剂、聚合温度为影响因素，选用L9(34)正交表进行正交实验。
正交实验条件如表8所示。
表8 正交实验因素水平表
| 试验号 | A(功能单体比例) | B(交联剂比例) | C(致孔剂) | D(聚合温度/℃) |
| 1 | 1:0.5 | 1:10 | 乙腈 | 50 |
| 2 | 1:2 | 1:15 | 丙酮 | 60 |
| 3 | 1:4 | 1:20 | 四氢呋喃 | 70 |
表9 正交实验结果与分析
由上述实验结果，对比各因素极差的大小可知：RC＞RA﹥RB﹥RD，即致孔剂在MIPs的制备过程中最为重要的。
对比各因素的K值的大小可知：聚合的最佳条件是A1B3C3D2，即烙印分子与功能单体的摩尔比例是1:0.5；烙印分子与交联剂的摩尔比例为1:20；以有机溶剂四氢呋喃为致孔剂；聚合温度为60 ℃。
重复3次最佳试验方案，即致孔剂为四氢呋喃，烙印分子与功能单体及交联剂比例为1:0.5:20，60 ℃聚合温度下制备26小时左右，通过超声波去除聚合物中的氯霉素后，用标准液去结合，测得结合能力平均达2.16×10﹣4mol/g。
综上所述，在氯霉素去除方法的研究中，分别采用了索氏抽提，超声波抽提，密闭微波抽提三种方法，经过对抽提时间，抽提效果，实际用量等因素的比较，得出超声波抽提法相对比较方便实用，抽提效果良好；在MIPs的制备中，烙印分子与功能单体及交联剂的比例、致孔剂种类、聚合温度等对MIPs对CAP的结合能力有较大影响。通过正交实验得出最佳的聚合条件：烙印分子与功能单体的摩尔比例为1:0.5；烙印分子与交联剂的摩尔比例为1:20；以有机试剂四氢呋喃作为致孔剂；聚合温度为60℃，结合能力最大达到2.16×10﹣4mol/g。
Claims (1)
1.一种氯霉素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)准确称取CAP于适量的致孔剂中，充分振荡使其溶解，然后加入功能单体甲基丙烯酸，于振荡器中充分振荡使其完全反应；
2)继续加入交联剂EDMA和引发剂偶氮二异丁腈，充分混匀后移入安培瓶中，使用超声波处理5min，使不存在可见固体颗粒存在，然后充氮10～15分钟；
3)在酒精喷灯高温下把安培瓶拉丝密封，置于恒温水浴锅中在恒定的温度下热聚合反应完全后，制得块状聚合物；
4)将制得的块状聚合物用甲醇洗去未反应的试剂，放置晾干，研钵磨碎，置于甲醇/乙酸混合液中，超声洗脱，得到氯霉素分子印迹聚合物；
所述的致孔剂为四氢呋喃，所述的CAP与甲基丙烯酸的摩尔比为1:0.5；
所述的交联剂的加入量为CAP与交联剂的摩尔比为1:20；
所述的恒温水浴锅的温度为60℃；
所述的甲醇/乙酸混合液中甲醇和乙酸的体积比为9:1。
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