CN106582567A - 有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用 - Google Patents

有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其采用反相乳液‑悬浮聚合的方法，将功能单体与磁性微粒超声分散制成反相乳液，在聚合前用功能单体对磁性微粒进行包裹，将此反相乳液作为悬浮聚合的分散相，对模板分子进行印迹，使聚合物包裹于磁性微粒表面，解决了高粘度功能单体在悬浮聚合过程中难以分散成球的问题，同时也解决了磁性微粒与油性单体和聚合物相容性的问题。所得有机胂类磁性分子印迹聚合物对目标分子有很高的吸附性和选择性，在外部磁场的作用下，分离迅速，操作简单，实现了复杂基质中有机胂类药物的选择性分离，提高了分离效率和样品前处理的回收率。能够更好地对饲料和动物性食品中有机胂类兽药的残留进行监测。

Description

有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体的说是一种有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备及其在动物性食品中有机胂类兽药残留分析时样品前处理方面的应用。
背景技术
有机胂类饲料添加剂在国内外被广泛用于畜禽生产，不仅可以提高饲料转化率，降低养殖成本，还可以杀死肠道致病菌，促进营养物质吸收与转化。美国食品药品监督管理局最早于1964年允许胂制剂应用于鸡饲料，1983年正式批准用作猪和鸡的促生长剂。我国于1993年批准该药用鸡和猪饲料的使用，1996年批准了洛克沙胂的使用。由于其具有抗菌和促生长作用，被美国、日本和中国等多个国家所使用。
由于有机胂类在动物体内吸收较少，排出较快，蓄积量少，被认为基本是无毒的。但大剂量的添加有机胂类药物对动物仍有一定的毒副作用。如在饲料中添加正常使用量10倍量的有机胂类药物，3-6周后猪即出现肌肉震颤，共济失调等中毒症状，以至继发死亡。大量使用有机胂类制剂，不仅可导致其在畜产品内残留，还可转化为无机砷污染环境。据估测，一个万头猪场使用阿散酸饲料5-8年即可向周围环境排放1吨砷。由上可见，滥用有机胂类饲料会导致周围土壤和水源的砷含量超标，砷元素会在环境中日积月累，造成生态环境严重破坏，并可通过食物链对人体健康造成危害。根据我国农业部235号公告，阿散酸和洛克沙胂作为饲料添加剂药物，在肉、蛋和肝、肾中的残留量不得超过0.5mg/kg和2mg/kg。
目前，对于动物源食品中有机胂类残留的检测方法主要有紫外分光光度法、微生物法、液相色谱法和液相色谱-质谱联用法等方法。上述方法，虽然灵敏度高，检测能力强，但如果样品的前处理做的不好的话，将对检测结果产生较大影响，也就是说：样品的前处理是影响分析结果准确性的关键因素。固相萃取法是常用的样品分离和纯化的前处理方法，其主要依靠非特异性作用力吸附目标物，吸附性和选择性较差，而磁性分子印迹聚合物（Magnetic Molecularly Imprinted Polymers，MMIPs）对目标分子有很高的吸附性和选择性，在外部磁性作用下，分离迅速，操作简单。
近年来，以磁性微粒为载体的表面分子印迹技术逐渐发展起来，磁性微粒具有超顺磁性和较高的比表面积，在靶向给药，免疫分析和固定化酶等领域应用广泛。将分子印迹技术与磁性微粒相结合，在磁性微粒表面进行分子印迹，合成MMIPs，具有超顺磁性、模板分子易洗脱、结合容量高和识别效果好等两者共同的优点。MMIPs常用于从复杂基质中选择性识别、分离和富集目标化合物，是分子印迹技术发展的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的是：通过反相乳液-悬浮聚合的方法，将聚合物包裹在磁性微粒表面，制备一种有机胂类磁性分子印迹聚合物，来更好地对饲料和动物性食品中有机胂类兽药的残留进行监测。
为了实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，制备步骤如下：
（1）取可溶性铁盐溶解于100mL的超纯水中，在通入氮气保护下，采用超声波对溶液进行混匀，制得同摩尔浓度Fe3+和Fe2+溶液，且均为0.05-0.2mol/L的混合溶液，然后向混合溶液中依次加入的氨水和油酸，每100mL超纯水添加氨水和油酸的量分别为8-15mL和0.5-3.0mL，将所得混合溶液于90℃条件下进行加热反应1-2h，反应结束后，过滤，对所得滤渣先用去离子水冲洗至中性，再用无水乙醇清洗2-4次，清洗后将滤渣置于温度为50-80℃的真空干燥箱内干燥至恒重，得磁性微粒，备用；
（2）取步骤（1）制得的1.0g磁性微粒和功能单体10-15mol，溶解于10-30mL水中，超声处理15min混匀，得到混合溶液A，然后，按照每100mL甲醇1-1.5g的添加比例，取乳化剂溶解于甲醇中，得到混合溶液B，之后，按照混合溶液A和混合溶液B体积比为10:1-3的比例，将混合溶液A加入到混合溶液B中，超声处理10min混匀，得到混配溶液，之后，按照混配溶液中每100mL甲醇0.1-0.4g的添加比例，向混配溶液中加入过硫酸铵，将所得混合溶液在氮气保护下，以200-400r/min的速度在室温下进行搅拌2h，得到反相乳液A，备用；
（3）取0.2g引发剂溶解于1-5mL甲醇中，向其中加入1.0mol的交联剂和1.0-5.0mol的功能单体，搅拌均匀后，进行超声震荡10min，向所得的混合溶液中加入步骤（2）中制得的反相乳液A，超声处理10min后，得到反相乳液B，备用；
（4）取1mol的模板分子和2-6mol的功能单体，溶解于100mL甲醇中，超声处理10min混匀后，放入4℃冰箱内进行预聚合8-12h，得到预聚合体系；
（5）按照反相乳液B与预聚合体系体积比为10:1的比例，取步骤（3）制得的反相乳液B加入到步骤（4）制得的预聚合体系中，充分混合后，通入氮气10min，置于60-80℃条件下进行反应12-15h，制得聚合物颗粒，备用；
（6）分别采用丙酮、乙醇和水对步骤（5）制得的聚合物颗粒进行反复洗涤，然后，采用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液进行索氏抽提，期间定时对新流出的提取液进行取样，并采用高效液相色谱分析取样得到的提取液中模板分子的含量，直至提取液中无模板分子时停止索氏提取，然后，将聚合物颗粒置于70℃温度条件下烘干至恒重，即得对有机胂类具有识别能力的磁性分子印迹聚合物。
在步骤（1）中，所述的可溶性铁盐为FeCl3和 FeSO4的水合物，或FeCl3和FeCl2的水合物，或Fe2(SO4)3和FeSO4的水合物。
在步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中，所述的功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N-1-苯乙基丙烯酰胺、N-烯丙基-2-羟基苯甲酰胺、1-苯基-3-甲基-1H-吡唑-5-基-丙烯酸酯、9-乙烯基腺嘌呤、1-苯基-3-甲基-4-甲基丙烯酰基-5-吡唑酮、3-氨基苯硼酸、吡咯、邻苯二胺、对氨基苯硫酚、N，O-双异丁烯酰乙醇胺、N，O-双异丁烯酰丝氨醇、N，O-双甲基丙烯酰-L-天冬氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-谷氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-组氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-亮氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-赖氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-缬氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-色氨酸以及其他的N，O-双甲基丙烯酰氨基酸衍生物中的一种或几种。
在步骤（2）中，所述的搅拌速度为300r/min。
在步骤（3）中，所述的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、马来松香丙烯酸乙二醇酯和四乙基氧硅烷中的至少一种。
在步骤（4）中，所用的模板分子为阿散酸、洛克沙砷、卡巴胂和硝苯砷酸中的一种。
有机胂类磁性分子印迹聚合物在动物性食品中有机胂类兽药残留的分析和应用方法，具体步骤为：
（1）将浓度为1000μmol/L的有机胂类药物标准溶液分别加入到三份均质后的样品中，使三份样品中有机胂类药物的浓度分别为250μg/kg、500μg/kg和1000μg/kg；
（2）分别对三份样品进行匀浆处理，从三份匀浆后的样品中各取5g作为试样，将三份试样分别放入装有25mL甲醇的离心管中，并对离心管中的混合物进行超声破碎和涡旋混合各10min，离心15min，并取上清液，然后，向离心后取过上清液的剩余物料中再次加入25mL甲醇，并对所得混合物进行超声破碎和涡旋混合各10min，离心15min，再次取上清液，然后，合并两次所得上清液，并向合并后的溶液中加入4mL质量浓度为2%的高氯酸溶液，涡旋混合均匀后过滤，对所得滤液进行减压旋转蒸干，得固体残渣，用5mL甲醇对固体残渣进行溶解，得到样品溶液，备用；
（3）取30mg有机胂类磁性分子印迹聚合物加入到样品溶液中，将所得混合物置于振荡器中进行振荡15min，利用磁铁对振荡后的混合物进行磁性分离，除去磁性分离后所得混合物中的上清液，剩余下层底物，采用体积比为8:2的甲醇-水混合溶液对下层底物进行淋洗，采用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液对下层底物进行洗脱，并采用孔径为0.22μm的有机微孔滤膜对所得洗脱液进行过滤，得滤液，采用高效液相色谱仪对所得滤液中的有机胂类药物含量进行检测，即完成有机胂类药物从带有有机胂类药物的样品溶液中的分离和测定。
有益效果
1、本发明采用反相乳液-悬浮聚合的方法，将功能单体与磁性微粒超声分散制成反相乳液，在聚合前用功能单体对磁性微粒进行包裹，将此反相乳液作为悬浮聚合的分散相，对模板分子进行印迹，使聚合物包裹于磁性微粒表面，解决了高粘度功能单体在悬浮聚合过程中难以分散成球的问题，同时也解决了磁性微粒与油性单体和聚合物相容性的问题。该方法的反应速率快，体系的稳定性好，传热容易控制，反应条件温和，可以使模板分子印迹于磁性微粒的表面，进而提高印迹效应和吸附分离效率。所得有机胂类磁性分子印迹聚合物对目标分子有很高的吸附性和选择性，在外部磁场的作用下，分离迅速，操作简单，实现了复杂基质中有机胂类药物的选择性分离，提高了分离效率和样品前处理的回收率。
2、本发明在制备步骤的反应原理上，应用一系列新型生物源性功能单体，如N，O-双甲基丙烯酰氨基酸衍生物，高仿真地模拟生物大分子的结构和特异性识别作用，使模板分子与单体之间形成了一个新的有机的聚合体系，这个体系的形成是一个复杂的过程，具有独特的化学和物理组成形式，体系中的每种物质，都是体系的必备元素之一。由于微球的比表面积较无定形颗粒大，其吸附的速率较快，特异性吸附的容量也较大，这就使得基于微球的分子印迹固相萃取小柱具有更高的分离效率和更好的分离效果。且所得固相萃取柱固定相的大孔结构可以保证较快的传质速率和较低的柱压，制得的萃取小柱对样品中杂质的净化效果好，检测结果的精密度高，专一性强，回收率高且稳定性好。对极端环境耐受力强，较适合基层单位检验或现场处理样品时使用。
3、分子印迹聚合物的识别作用是依靠多种非共价键的相互作用进行的。非共价键的种类越多，结合力越强，所制备的聚合物的识别能力和特异性就越强。为了使聚合物的印迹因子最高，除了需要模板分子本身的酸碱属性与功能单体能够相互配合，产生一定的分子间作用力外，还要综合考虑反应物间的结合力。与传统的分子印迹聚合物相比，本发明基于自制的多种新型功能单体，特别是一系列生物源性功能单体，通过优化反应条件，使模板分子与功能单体形成了静电作用力、氢键、疏水作用力、范德华力等多种形式的相互作用，进而构建了一种有机的复合体，实现了复杂基质中目标化合物的选择性识别、分离和富集，具有更强的结构预定性和操作可行性。同时，基于新型表面印迹法所制得的MMIPs，还具有模板分子易洗脱，结合容量高，识别能力强，稳定性良好，具有较长保存期等优点。
4、本发明需要有合适的反应条件作保障，尤其是对于新型功能单体的合成工艺、预聚合中模板分子、功能单体和交联剂的比例、反相乳液中各物质的构成比例以及印迹聚合的反应条件，只有这些物料比和聚合反应保持最佳反应条件，才有望发挥各反应因素的协同效果。本发明所选用的聚合物制备体系是通过反复的实验探索而优化出来的，不可随意增减或改变物料配比和试剂选择，否则会严重影响乃至无法实现其技术效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物的等温吸附曲线图；
图2是本发明实施例1中中制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物的Scatchard分析结果图；
图3是本发明实施例2中制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物的等温吸附曲线图；
图4是本发明实施例2中中制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物的Scatchard分析结果图；
图5是本发明实施例3中制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物的等温吸附曲线图；
图6是本发明实施例3中中制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物的Scatchard分析结果图。
具体实施方式
以下实施例可使本专业技术人员全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备及应用，具体步骤如下：
一、有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备
（1）取可溶性铁盐溶解于超纯水中，通入氮气，并用超声混匀，依次加入氨水和油酸加热1-2h。反应结束后，将磁性微粒用去离子水洗到中性，再用无水乙醇洗2-4次，放入真空干燥箱50-80℃干燥过夜；
（2）将功能单体和磁性微粒溶于水中，超声震荡15min，将乳化剂溶于甲醇，然后混合以上两种溶液，超声震荡10min，加入过硫酸铵，通氮气，以200 -400r/min搅拌室温下搅拌2h，得到反相乳液A；
（3）将引发剂溶于甲醇中，加入交联剂和功能单体后，搅拌均匀，超声振荡10min，加入反相乳液A，超声10min，得到反相乳液B；
（4）向溶剂中加入模板分子和功能单体，超声震荡10-15min，4℃冷藏过夜，得到预聚合体系，向预聚合体系中加入反相乳液B，通氮气10min，60-80℃反应12-15h。得到聚合物颗粒；
（5）将制得的聚合物颗粒用丙酮、乙醇和水反复洗涤，然后以甲醇-乙酸混合溶液（9:1，v/v）为洗脱液，利用索氏抽提法进行模板分子的洗脱，直到无模板分子检出为止，最后将其置于70℃下干燥至恒重，即得对有机胂类具有识别能力的磁性分子印迹聚合物。
为了更好地表征有机胂类磁性分子印迹聚合物的性能，本发明还制备了磁性空白分子印迹聚合物（Magnetic Non-molecularly Imprinted Polymers，MNIPs），MNIPs的制备方法除不加模板分子之外，其余步骤均相同。
二、有机胂类磁性分子印迹聚合物吸附性能的表征
（1）准确配置浓度为0.5-35.0μg/mL的一系列有机胂类甲醇标准工作液。分别称取20mg的MMIPs和MNIPs放入离心管中（其中，称取的MMIPs的份数和MNIPs的份数均与上述一系列有机胂类甲醇标准工作液的份数相同）。向每个离心管中均加入3.0mL上述一系列浓度的有机胂标准溶液，密封后，在25℃、160r/min的恒温摇床中振荡8h后进行离心，取上清液，用针头过滤器进行过滤，然后用高效液相色谱法（High-performance Liquid Chromatography，HPLC）检测。绘制等温吸附曲线。
（2）对实际样品进行处理并测定回收率。
实施例1
一、有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备
（1）将1.35g FeCl3·6H2O和1.39g FeSO4·7H2O溶解于100mL超纯水中，通入氮气除氧，并用超声混匀超声溶解。依次加入10.0mL氨水和1.0mL油酸在90℃中加热1.5h，全程通氮气除氧。反应结束后，将收集到的微粒用去离子水洗到中性，再用无水乙醇洗4次，放入真空干燥箱60℃干燥至恒重。
（2）新型功能单体的制备：将3.8mL乙醇胺和20.6mL三乙胺溶于200mL二氯甲烷中，通氮气保护下冰浴15min，同时以400r/min的速度进行搅拌，然后向混合溶液中逐滴缓慢加入14.4mL甲基丙烯酰氯，通氮气20min，60℃水浴反应24h。反应结束后，对所得产物进行抽滤，滤液依次用5mol/L的碳酸氢钠和柠檬酸钠溶液各进行洗涤3次，得到淡黄色液体，再加入10.0g无水硫酸钠进行脱水，过滤后，滤液进行旋转蒸发，除去溶液中的有机溶剂，得到黄色油状物。用硅胶柱层Fe2(SO4)3提纯，用乙酸乙酯-正己烷混合溶液（1:1，v/v）洗脱产物中的杂质，乙酸乙酯洗脱出目标产物，最后进行旋转蒸发，得到淡黄色油状物即为N，O-双异丁烯酰乙醇胺。
（3）将10.0mol步骤（2）制得的功能单体和1.0g步骤（1）制得的磁性微粒溶于10.0mL水中，超声震荡15min，然后将1.0g乳化剂Span 80溶于100mL甲醇，将以上两种溶液混合，超声震荡10min，加入0.1g过硫酸铵，通氮气除氧，以200r/min室温下搅拌2h，得到反相乳液A。
（4）将0.2g的引发剂偶氮二异丁腈溶于5.0mL甲醇中，加入1.0mol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和1.0mol的功能单体，搅拌均匀后，超声振荡10min，加入反相乳液A，超声10min，得反相乳液B。
（5）向100mL甲醇中加入1.0mmol的阿散酸和2.0mmol的功能单体，超声15min，4℃冷藏8h。得到预聚合体系。按照反相乳液B与预聚合体系体积比为10:1的比例，将预聚合体系中加入反相乳液B，充分混合后，通氮气除氧10min，75℃反应12h。将制得的聚合物用丙酮、乙醇和水反复洗涤，然后用以甲醇-乙酸混合溶液（9:1，v/v）为洗脱液，利用索氏抽提法进行洗脱，直到无模板分子检出为止。最后将所得MMIPs于70℃条件下干燥至恒重，即得对有机胂类具有识别能力的磁性分子印迹聚合物。
在本实施例中作为对照的MNIPs的制备，除在操作过程中不加模板分子之外，其余步骤同上。
二、有机胂类磁性分子印迹聚合物吸附性能的研究
配制浓度为1000μmol/L的有机胂类甲醇标准溶液，分别称取20mg的MMIPs和MNIPs各12份，放入离心管中。向各个离心管中加入3mL上述浓度的有机胂类标准溶液，密封后，以室温25℃、160r/min置于恒温摇床中，振荡8h后进行离心，取上清液用针头过滤器进行过滤，然后用HPLC检测。根据吸附前后标准溶液的浓度改变，计算不同浓度水平下MMIPs和MNIPs的结合量。以有机胂类标准溶液的初始浓度C为横坐标，以单位质量MMIPs和MNIPs对有机胂的结合量Q为纵坐标，绘制等温吸附曲线。
MMIPs和MNIPs的等温吸附曲线如图1所示，可以观察到，随着有机胂类标准溶液初始浓度的增大，MMIPs和MNIPs对有机胂类的吸附量逐渐增多。其中，MMIPs对有机胂类的吸附量明显高于MNIPs，这是因为 MMIPs的表面存在特定形状的立体孔穴，能与有机胂类分子的结构相匹配，对有机胂类分子的吸附属于特异性吸附，而MNIPs对有机胂类的吸附为非特异性吸附。
图2为Scatchard分析图。采用Origin软件对MMIPs进行拟合得到两个方程，分别为Q/C=0.354－1.595Q（r=0.9276）和Q/C=0.187－0.324Q（r=0.9595），这表明该MMIPs中存在两类结合位点。根据线性拟合方程的斜率和截距，可求得MMIPs中高亲和位点与低亲和位点的平衡离解常数Kd和最大表观结合量Qmax，其中Kd1=0.627μg/mL，Qmax1=0.222μg/mg；Kd2=3.086μg/mL，Qmax2=0.577 μg/mg。对MNIPs进行拟合得到仅得到一条直线，方程为Q/C=0.104－0.368Q（r= 0.9511），表明仅存在一类低特异性吸附位点，所得平衡离解常数Kd=2.717μg/mL，最大表观结合量Qmax=0.282μg/mg。
三、有机胂类磁性分子印迹聚合物在实际样品检测中的回收率
（1）将浓度为1000μmol/L的有机胂类药物标准溶液分别加入到三份均质后的样品中，使三份样品中有机胂类药物的浓度分别为250μg/kg、500μg/kg和1000μg/kg；
（2）分别对步骤（1）提取净化后的三份样品进行匀浆处理，从三份匀浆后的样品中各取5g作为试样，将三份试样分别放入装有25mL甲醇的50mL离心管中，超声破碎、涡旋混合各10min后，离心15min后取上清液，重复一次，合并甲醇上清液，向合并液中加入4mL 2%高氯酸溶液，涡旋混合均匀后过滤，滤液减压旋转蒸干，将样品残渣用5mL甲醇进行溶解，得到样品溶液，备用；
（3）将30mg的MMIPs加入上述样品溶液中，室温震荡15min，磁性分离，除去上清液，用甲醇-水混合液（8:2，v/v）淋洗，除去表面杂质，再用甲醇-乙酸混合液（9:1，v/v）洗脱聚合物上的有机胂类药物，洗脱液经0.22μm有机滤膜过滤，用HPLC检测，计算其回收率。同时采用目前常用的市售商品化C18固相萃取小柱进行样品处理，并与MMIPs进行比对，结果见表1。
表1 有机胂类药物在不同样品基质中的回收率
实施例2
一、有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备
（1）取5.41g FeCl3·6H2O 和3.975g FeCl2·4H2O溶解于100mL超纯水中，通入氮气除氧，并用超声混匀超声溶解。依次加入 8.0mL氨水和 0.5mL油酸在90℃中加热2h，全程通氮气除氧。反应结束后，将收集到的微粒用去离子水洗到中性，再用无水乙醇洗2次，放入真空干燥箱80℃干燥至恒重。
（2）新型功能单体的制备：将2.1g丝氨醇溶于150mL四氢呋喃-二氯甲烷混合溶液（1:1，v/v）中，通氮气10min，冰浴冷却至0℃，加入3.3mL的三乙胺，再逐滴加入甲基丙稀酰氯4.2mL，升温至50℃，300r/min机械搅拌24h。反应结束后，进行抽滤，得到的滤液用0.5mol/L的碳酸氢钠溶液洗3次，0.5mol/L的柠檬酸钠洗3次，加入无水硫酸钠脱水干燥，然后减压旋转蒸。最后用硅胶层析柱对产物进行提纯，用正己烷-乙酸乙酯混合溶液（1:1，v/v）淋洗除去杂质，乙酸乙酯洗脱目标产物，收集产物减压旋转蒸发得到N，O-双异丁烯酰丝氨醇。
（3）将15.0mol步骤（2）制得的功能单体和1.0g步骤（1）制得的磁性微粒溶于30.0mL水中，超声震荡15min，然后将1.2g乳化剂Span 80溶于100mL甲醇，将以上两种溶液混合，超声震荡10min，加入0.2g过硫酸铵，通氮气除氧，以300r/min室温下搅拌2h，得到反相乳液A。
（4）将0.2g的引发剂偶氮二异丁腈溶于1.0mL甲醇中，加入1.0mol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和5.0mol的功能单体，搅拌均匀后，超声振荡10min，加入反相乳液A，超声10min，得反相乳液B。
（5）向100mL甲醇中加入1.0mmol的洛克沙胂和6.0mmol的功能单体N，O-双异丁烯酰丝氨醇，超声10min，4℃冷藏12h。得到预聚合体系。按照反相乳液B与预聚合体系体积比为10:1的比例，将预聚合体系中加入反相乳液B，充分混合后，通氮气除氧10min，60℃反应14h。将制得的聚合物用丙酮、乙醇和水反复洗涤，然后用以甲醇-乙酸混合溶液（9:1，v/v）为洗脱液，利用索氏抽提法进行洗脱，直到无模板分子检出为止。最后将所得MMIPs于70℃条件下干燥至恒重，即得对有机胂类具有识别能力的磁性分子印迹聚合物。
在本实施例中作为对照的MNIPs的制备，除在操作过程中不加模板分子之外，其余步骤同上。
二、有机胂类磁性分子印迹聚合物吸附性能的研究
表征方法同实施例1，等温吸附曲线见图3，Scatchard分析结果见图4，结果表明，在MMIP上存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点，方程分别为Q/C=0.863－3.072Q（r=0.9894）和Q/C=0.121－0.255Q（r=0.9709），Kd1=0.326μg/mL，Qmax1=0.281μg/mg；Kd2=3.918μg/mL，Qmax2=0.474 μg/mg。对MNIPs进行拟合得到仅得到一条直线，方程为Q/C=0.170－0.169Q（r= 0.9904），表明仅存在一类低特异性吸附位点，所得平衡离解常数Kd=5.919μg/mL，最大表观结合量Qmax=1.007μg/mg。
三、有机胂类磁性分子印迹聚合物在实际样品检测中的回收率
样品的采集和处理的基本方法同实施例1。所用MMIP为50mg，室温震荡20min，对洗脱液进行HPLC检测，计算其回收率。同时采用目前常用的市售商品化C18固相萃取小柱进行样品处理，并与MMIPs进行比对，结果见表2。
表2 有机胂类药物在不同样品基质中的回收率
实施例3
一、有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备
（1）取5.62g Fe2(SO4)3·9H2O 和2.78g FeSO4·7H2O溶解于100mL超纯水中，通入氮气除氧，并用超声混匀超声溶解。依次加入15.0mL氨水和 3.0mL油酸在90℃中加热1h，全程通氮气除氧。反应结束后，将收集到的微粒用去离子水洗到中性，再用无水乙醇洗3次，放入真空干燥箱50℃干燥至恒重。
（2）新型功能单体的制备：先将20mg L-亮氨酸在四氢铝锂（LiAlH4）的催化下，于100mL的四氢呋喃中回流48h，制备氨基酸的醇衍生物。随后在120mg N，N'-二环己基碳二酰亚胺和140mg 4-二甲氨基吡啶的催化下，将50mg的醇衍生物与35mL的甲基丙烯酸在200mL二氯甲烷中缩合120h，制备具有交联作用的功能单体N，O-双甲基丙烯酰-L-亮氨酸。
（3）将13.0mol步骤（2）制得的功能单体和1.0g步骤（1）制得的磁性微粒溶于20.0mL水中，超声震荡15min，然后将1.5g乳化剂Span 80溶于100mL甲醇，将以上两种溶液混合，超声震荡10min，加入0.4g过硫酸铵，通氮气除氧，以400r/min室温下搅拌2h，得到反相乳液A。
（4）将0.2g的引发剂偶氮二异丁腈溶于3.0mL甲醇中，加入1.0mol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和3.0mol的功能单体，搅拌均匀后，超声振荡10min，加入反相乳液A，超声10min，得反相乳液B。
（5）向100mL甲醇中加入1.0mmol的卡巴胂和4.0mmol的功能单体，超声15min，4℃冷藏10h。得到预聚合体系。按照反相乳液B与预聚合体系体积比为10:1的比例，将预聚合体系中加入反相乳液B，充分混合后，通氮气除氧10min，80℃反应15h。将制得的聚合物用丙酮、乙醇和水反复洗涤，然后用以甲醇-乙酸混合溶液（9:1，v/v）为洗脱液，利用索氏抽提法进行洗脱，直到无模板分子检出为止。最后将所得MMIPs于70℃条件下干燥至恒重，即得对有机胂类具有识别能力的磁性分子印迹聚合物。
在本实施例中作为对照的MNIPs的制备，除在操作过程中不加模板分子之外，其余步骤同上。
二、有机胂类磁性分子印迹聚合物吸附性能的研究
表征方法同实施例1，等温吸附曲线见图5，Scatchard分析结果见图6，结果表明，在MMIP上存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点，方程分别为Q/C=0.530－2.753Q（r=0.9929）和Q/C=0.079－0.251Q（r=0.9709），Kd1=0.363μg/mL，Qmax1=0.192μg/mg；Kd2=3.979 μg/mL，Qmax2=0.313 μg/mg。对MNIPs进行拟合得到仅得到一条直线，方程为Q/C=0.024－0.170Q（r= 0.7954），表明仅存在一类低特异性吸附位点，所得平衡离解常数Kd=5.873μg/mL，最大表观结合量Qmax=0.144μg/mg。
三、有机胂类磁性分子印迹聚合物在实际样品检测中的回收率
样品的采集和处理的基本方法同实施例1。所用MMIP为40mg，室温震荡18min，对洗脱液进行HPLC检测，计算其回收率。同时采用目前常用的市售商品化C18固相萃取小柱进行样品处理，并与MMIPs进行比对，结果见表3。
表3 有机胂类药物在不同样品基质中的回收率
由上述三个实施例的具体实验数据可知：本发明制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物较于常规的固相萃取小柱，对于复杂基质中目标分子有机胂类药物的选择性分离具有更高的吸附性和选择性，其回收率提高了20%-50%，同时除杂效果更好，专一性强，回收稳定性好，检测结果的精密度高，对极端环境耐受力强，较适合基层单位检验或现场处理样品时使用。

Claims (7)

1.有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
（1）取可溶性铁盐溶解于超纯水中，在通入氮气保护下，采用超声波对溶液进行混匀，制得Fe3+和Fe2+摩尔浓度相同，且均为0.05-0.2mol/L的混合溶液，然后，按照每100mL超纯水中添加8-15mL氨水和0.5-3.0mL油酸的比例，向混合溶液中依次加入氨水和油酸，之后，将所得混合溶液于90℃条件下进行加热反应1-2h，反应结束后，过滤，对所得滤渣先用去离子水冲洗至中性，再用无水乙醇清洗2-4次，清洗后将滤渣置于温度为50-80℃的真空干燥箱内干燥至恒重，得磁性微粒，备用；
（2）取功能单体10-15mol以及步骤（1）制得的磁性微粒1.0g溶解于10-30mL水中，超声处理15min混匀，得到混合溶液A，然后，按照每100mL甲醇1-1.5g的添加比例，取乳化剂添加于甲醇中，得到混合溶液B，之后，按照混合溶液A和混合溶液B体积比为10:1-3的比例，将混合溶液A加入到混合溶液B中，超声处理10min混匀，得到混配溶液，之后，按照混配溶液中每100mL甲醇0.1-0.4g的添加比例，向混配溶液中加入过硫酸铵，将所得混合溶液在氮气保护下，以200-400r/min的速度在室温下进行搅拌2h，得到反相乳液A，备用；
（3）取0.2g引发剂溶解于1-5mL甲醇中，之后，向其中加入1.0mol的交联剂和1.0-5.0mol的功能单体，搅拌均匀后，进行超声震荡10min，之后，向所得的混合溶液中加入步骤（2）中制得的反相乳液A，超声处理10min后，得到反相乳液B，备用；
（4）取1mol的模板分子和2-6mol的功能单体溶解于100mL甲醇中，超声处理10min混匀后，放入4℃冰箱内进行预聚合8-12h，得到预聚合体系；
（5）按照反相乳液B与预聚合体系体积比为10:1的比例，取步骤（3）制得的反相乳液B加入到步骤（4）制得的预聚合体系中，充分混合后，通入氮气10min，之后，置于60-80℃条件下进行反应12-15h，制得聚合物颗粒，备用；
（6）分别采用丙酮、乙醇和水对步骤（5）制得的聚合物颗粒进行反复洗涤，然后，采用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液进行索氏抽提，期间定时对新流出的提取液进行取样，并采用高效液相色谱分析取样得到的提取液中模板分子的含量，直至提取液中无模板分子时停止索氏提取，然后，将聚合物颗粒置于70℃温度条件下烘干至恒重，即得对有机胂类具有识别能力的磁性分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，所述的可溶性铁盐为FeCl3和 FeSO4的水合物，或FeCl3和FeCl2的水合物，或Fe2(SO4)3和FeSO4的水合物。
3.根据权利要求1所述的有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：在步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中，所述的功能单体均为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、N-1-苯乙基丙烯酰胺、N-烯丙基-2-羟基苯甲酰胺、1-苯基-3-甲基-1H-吡唑-5-基-丙烯酸酯、9-乙烯基腺嘌呤、1-苯基-3-甲基-4-甲基丙烯酰基-5-吡唑酮、3-氨基苯硼酸、吡咯、邻苯二胺、对氨基苯硫酚、N，O-双异丁烯酰乙醇胺、N，O-双异丁烯酰丝氨醇、N，O-双甲基丙烯酰-L-天冬氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-谷氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-组氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-亮氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-赖氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-缬氨酸、N，O-双甲基丙烯酰-L-色氨酸以及其他的N，O-双甲基丙烯酰氨基酸衍生物中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述的搅拌速度为300r/min。
5.根据权利要求1所述的有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、马来松香丙烯酸乙二醇酯和四乙基氧硅烷中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的有机胂类磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述的模板分子为阿散酸、洛克沙砷、卡巴胂和硝苯砷酸中的任意一种。
7.利用权利要求1的制备方法所制备的有机胂类磁性分子印迹聚合物在动物性食品中有机胂类兽药残留的分析检测方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）将浓度为1000μmol/L的有机胂类药物标准溶液分别加入到三份均质后的样品中，使三份样品中有机胂类药物的浓度分别为250μg/kg、500μg/kg和1000μg/kg；
（2）分别对三份样品进行匀浆处理，从三份匀浆后的样品中各取5g作为试样，将三份试样分别放入装有25mL甲醇的离心管中，并对离心管中的混合物进行超声破碎和涡旋混合各10min，离心15min，并取上清液，然后，向离心处理后取过上清液的剩余物料中再次加入25mL甲醇，并对所得混合物进行超声破碎和涡旋混合各10min，离心15min，再次取上清液，然后，合并两次所得上清液，并向合并后的溶液中加入4mL质量浓度为2%的高氯酸溶液，涡旋混合均匀后过滤，对所得滤液进行减压旋转蒸干，得固体残渣，用5mL甲醇对固体残渣进行溶解，得到样品溶液，备用；
（3）取30mg有机胂类磁性分子印迹聚合物加入到样品溶液中，将所得混合物置于振荡器中进行振荡15min，然后，利用磁铁对振荡后的混合物进行磁性分离，除去磁性分离后所得混合物中的上清液，剩余下层底物，采用体积比为8:2的甲醇-水混合溶液对下层底物进行淋洗，采用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液对下层底物进行洗脱，并采用孔径为0.22μm的有机微孔滤膜对所得洗脱液进行过滤，得滤液，采用高效液相色谱仪对所得滤液中的有机胂类药物含量进行检测，即完成有机胂类药物从带有有机胂类药物的样品溶液中的分离和测定。
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