CN104693363A

CN104693363A - 青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104693363A
Application number: CN201510069884.0A
Authority: CN
Inventors: 徐敏; 黄海龙; 宋建会; 葛昊; 冯智莹; 王敏; 潘斐; 张艳艳; 张惠东; 胡牧云; 罗雪娇; 温夏夏
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: CN104693363B

Abstract

本发明涉及一种青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球，其由青蒿琥酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸、磁性纤维素微球、引发剂和水制备而成。通过碱尿体系溶解纤维素，制备Fe₃O₄的流体，多孔磁性纤维素微球，从而制备得到青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球。本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球用作吸附剂，用于选择性识别和吸附青蒿琥酯，能够定量检测青蒿琥酯，并且能够分离纯化该物质，该微球能够回收重复利用。

Description

青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高分子功能性材料制备及应用技术领域，涉及表面分子印迹多孔磁性纤维素的制备方法，将制备的表面分子印迹多孔磁性纤维素微球用于检测、分离和纯化植物、药物以及自然环境中的青蒿琥酯。

背景技术

纤维素是地球上丰富且可再生自然资源之一，具有廉价、可降解、良好的生物相容性、无毒性等特点，得到国内外广泛研究。多孔纤维素微球，由于微球表面存在孔道与内部空腔连接，使得其密度低、表面积大、大小可控，利用空腔填充磁性物质、导电材料、催化剂以及药物等，使之成为重要的功能材料之一，并且在药物释放、生物传感、工业催化以及光电材料领域广泛应用。

表面分子印迹微球是一种对特定分子具有特异性识别，并且具有分离纯化能力的一种聚合物。制备简单，并且容易实施。通过单体与模板分子有序的结合，利用合适的交联剂和引发剂将模板分子固定在微球的表面，在表面上形成特异性尺寸的空腔与模板分子对应，为模板分子特异性识别提供了更多的结合位点。印迹分子使得识别与分离更简单，增加了结合速率和吸附量。该方法制备过程简单，只需选择适当的功能单体与聚合物微球聚合，就可做到对于特定分子的识别。

磁性高分子微球的应用及研究范围广泛，磁性微球在外磁场中的作用下，具有高效的选择性分离，从而起到对物质的回收分离的作用。由于磁性微球良好的生物相容性以及利用磁性特征能够磁性显影，被广泛应用在生物传感器、大分子信息传递、临床核磁共振诊断以及药物可控性释放等领域，发展前景可观。

在印迹聚合物与磁性高分子微球结合，印迹聚合物对模板分子发生特异性吸附之后，利用磁性特征响应，简单快速地分离收集印迹聚合物，通过洗脱液洗脱，将模板分子与印迹聚合物分离，从而分离纯化得到模板分子。这一应用不仅限于合成分子，并且能够应用在生物分子中，已有一些研究显示该技术可以用来对细胞进行特异性识别。因此磁性印迹技术已成为化学合成物质、天然药物以及生物细胞的特异性检测、分离和纯化的重要手段。

青蒿琥酯(Artesunate，AST)是从天然植物产物青蒿中提取出的一种含有过氧化基团的倍半萜内酯化合物，是目前常用的抗疟疾特效药之一。20世纪90年代以后，科学家发现除了良好的抗疟疾性之外，青蒿琥酯对于多种肿瘤细胞的生长都具有显著的抑制作用，对白血病、肝癌、肺腺癌及乳腺癌等都具有很好的抑制效果，而对正常组织细胞的毒性很低。除此以外，青蒿琥酯被发现可以抑制日本血吸虫幼虫的繁殖，对盘状红斑狼疮和系统性红斑狼疮、金额亚急性皮肤红斑狼疮具有治疗作用，对于小鼠曼氏血吸虫病有预防作用。但是传统的青蒿琥酯的制备方法过程复杂，成本高，难分离，而且不能重复利用。因此制备快速检测识别和从植物体内分离纯化青蒿琥酯的表面分子印迹多孔聚合物，非常必要。本发明选用青蒿琥酯作为模板分子。

已有报道的青蒿素分子印记聚合物，主要利用分子印迹聚合物的特异性选择识别模板分子，从而达到对于物质的特异性检测，尤其是对其微量的检测。特异性识别吸附后印迹聚合物的分离过程复杂，成本高，不能实现快速的收集。利用液相色谱、气相色谱方法灵敏度高，但是成本过高，测试时间长，无法实现简单快速检测。利用凝胶色谱柱方式分离纯化青蒿琥酯，收集周期时间长，收集条件限定，无法实现特异性选择分离纯化。以上几种方法都不能够起到检测识别与分离纯化一体化的过程，对于一些目标检测的物质无法起到很好的重复利用，增加了后续成本，延长过程。

现有青蒿琥酯检测方法慢，过程复杂，成本高及无法回收再利用等问题，亟需一种改进的方法。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷，本发明为了解决现有的青蒿琥酯的检测和分离纯化过程中存在的步骤复杂、耗时长、成本高、吸附量少、无法一体化完成等问题，提供了一种快速简便的检测识别与分离纯化一体，可重复利用的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球及其制备方法和应用。

本发明提出一种青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备方法，包括通过碱尿体系溶解纤维素，制备Fe₃O₄的磁性流体，制备多孔磁性纤维素微球，以及青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备。其制备过程如图1所示。

本发明提出的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备方法，包括以下步骤：

(一)将Fe₃O₄纳米粒子加入到表面活性剂中制备得到磁性流体，缓慢滴加到利用碱尿体系溶解纤维素得到的纤维素溶液中，得到磁性纤维素溶液。

(二)将所述磁性纤维素溶液缓慢滴加到含有表面活性剂的有机溶剂体系中，超声，调节pH值至10-12，静置分层，将上层溶液经洗涤、分离得到多孔磁性纤维素微球。

(三)将预组装溶液与所述多孔磁性纤维素微球混合，引发剂、交联剂作用下经聚合反应得到所述青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球。其中，所述预组装溶液包括模板分子青蒿琥酯和功能单体；功能单体包括甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺。

本发明制备方法中，步骤(一)中，所述Fe₃O₄纳米粒子通过以下方式制备：将硫酸铁和硫酸亚铁溶解在去离子水中混合均匀溶解，25℃下氮气保护超声0.5h；缓慢滴加氢氧化钠浓溶液，调节混合pH至10-12，超声、静置，经回收、洗涤得到所述Fe₃O₄纳米粒子。

其中，所述硫酸铁和硫酸亚铁的摩尔比为1.25∶1。

其中，所述超声的过程为，首先超声0.5h，然后升温至60℃，氮气保护超声1h。超声功率为20kHz-40kHz。

本发明制备方法中，步骤(一)中，所述碱尿体系是碱/尿素水溶液。所述纤维素溶液通过以下方式制备：将所述碱/尿素水溶液冷冻至-15-0℃，加入纤维素，剧烈搅拌溶解纤维素，经离心脱泡得到所述纤维素溶液。其中，搅拌速度为1500rpm/min。其中，所述碱/尿素水溶液为氢氧化钠、尿素和水按照质量比为7∶12∶81混合得到的溶液。

进一步地，向碱/尿素水溶液中加入的纤维素经机械粉碎，纤维素的添加量为水溶液质量的3-7％，控制搅拌速度1500rpm/min，快速搅拌5-10min。纤维素溶解后8000rpm/min离心10-15min除气泡得到纤维素溶液。

本发明制备方法中，步骤(一)中，表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚，具体地是脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO7-AEO12)。该脂肪醇聚氧乙烯醚中，烷基链段长度为9，聚氧乙烯醚链段长度为7-9。

本发明制备方法中，步骤(二)中，所述表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚，具体地是脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO7-AEO12)，其添加量根据有机溶剂体系的总体积确定，例如可以为25-75ml。本发明制备方法中，步骤(二)中，所述磁性纤维素溶液与所述有机溶剂体系比的质量比为：1-5∶25-75。所述有机溶剂体系由脂肪醇聚氧乙烯醚(其作为表面活性剂)、OP-10、液体石蜡按照体积比0.5-2∶0.25-1∶10-15比例混合，得到含有表面活性剂的有机溶解体系。

步骤(二)中，优选地，所述超声的超声功率为40kHz，超声时间为30-60min。

本发明制备方法中，步骤(三)中，所述预组装溶液通过以下方式制备：将模板分子青蒿琥酯与功能单体甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶解在水溶液中，25℃下静置5-8h，形成所述预组装溶液。

其中，模板分子与功能单体摩尔比为，青蒿琥酯∶甲基丙烯酸∶丙烯酰胺∶N，N-亚甲基双丙烯酰胺为1.0-1.5∶2.0-4.0∶2.0-4.0∶0.25-0.5。

本发明制备方法中，步骤(三)中，所述多孔磁性纤维素微球占预组装溶液总质量的10-20％；所述聚合反应温度为60-80℃，反应时间为24h；所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、硝酸铈铵、偶氮二异丁腈(AIBN)中的任意一种，引发剂的用量为所述功能单体总质量的6％；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，交联剂的用量为所述功能单体总质量的2％。

本发明提出的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球中，磁性四氧化三铁纳米粒子分布在多孔的纤维素微球内部，使得多孔微球带有磁性。包裹的纤维素微球起到了稳定性支撑的作用，同时保证了生物无毒特性。多孔结构能够使得吸附作用速度和吸附量增大。在微球表面聚合形成表面分子印迹聚合物，包覆在磁性纤维素微球表面，表面积增大，结合位点增多，吸附量增加。且由于纤维素大量氢键的存在起到保护作用，使得印迹聚合物稳定性增强，使用环境受到的温度、pH值限制减小。更好的检测、分离和识别青蒿琥酯不受外界条件影响。

本发明还提出了所述的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的应用，其可以用于对青蒿琥酯进行检测、分离和纯化。在一具体实施方案中，对青蒿草中的青蒿琥酯进行检测、分离和纯化。

将本发明的微球用于吸附青蒿琥酯从而检测其浓度的方法，是利用紫外可见分光光度计获得青蒿琥酯浓度与紫外波长为238nm时青蒿琥酯的吸光强度之间的线性关系，利用本发明的微球检测待测样品中青蒿琥酯的吸光强度，通过上述线性关系的方程得到样品中青蒿琥酯的浓度含量。

其中，检测方法为将本发明微球加入含有青蒿琥酯的待测样品溶液中，在25℃下，经恒温振荡、用磁铁分离，收集后将微球中吸附的青蒿琥酯经索氏提取、洗脱后，检测其在紫外波长为238nm时的吸光度，并根据上述线性关系对样品中青蒿琥酯含量进行定量计算。

进一步地，将洗脱液通过旋转蒸发仪，经减压蒸馏，除去溶剂得到纯化青蒿琥酯。

本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球用于对青蒿琥酯进行检测、分离和纯化的方法，具体包括以下：

利用紫外可见分光光度计绘制青蒿琥酯的标准曲线：以DMSO溶液为溶剂，配制浓度为10^-410^-5mol/L梯度浓度的青蒿琥酯溶液，紫外最大吸光度值对应的出峰值为238nm，绘制青蒿琥酯浓度与238nm处所对应的吸光度值，得到线性回归方程：Y＝0.20209X R²＝0.996，其中X代表青蒿琥酯浓度，Y代表紫外最大峰值238nm处对应的吸光度值。

将本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球用于测定青蒿琥酯，其过程包括：取青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球加入到青蒿琥酯的梯度浓度样品溶液中，置于25℃下，恒温振荡24h，用磁铁进行分离，收集后微球置于索氏提取仪中，加入甲醇/乙酸混合溶液(体积比为甲醇∶乙酸＝9∶1)，进行洗脱，将洗脱液在上述绘制标准曲线时的紫外分光光度计测定条件下进行检测，测定紫外238nm最大峰值处对应的吸光度值。通过代入上述线性方程，计算得到青蒿琥酯含量。

通过与上述检测同样的方法，可以实现青蒿琥酯的分离提纯。

进一步地，将洗脱液通过旋转蒸发仪，加热温度为60-70℃，减压10mmHg，经减压蒸馏除去溶剂得到纯化青蒿琥酯。

与现有技术相比较，本发明具有以下特点：

本发明提出的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球中，以纤维素为外壳，以Fe₃O₄纳米磁性材料为磁性内核，是一种多孔磁性纤维素微球。其不仅生物无毒、可降解、可再生而且保留了微球磁响应特性，外加磁场时磁性纤维素微球能够快速响应，纳米Fe₃O₄磁性粒子保证磁性纤维素微球不会在磁场中永久磁化，同时由于微球表面存在孔道与内部空腔连接，使得其密度低、表面积大，保证磁性粒子能够稳定分散在纤维素微球内，保证磁响应均匀稳定。本发明由于纤维素磁性微球具有的磁响应特性，使得印迹聚合物微球在分离纯化过程中，分离过程更加简单方便快捷，提高了分离效率。

本发明表面分子印迹多孔磁性纤维素微球是一种无毒、生物相容，可降解可再生材料。根据本发明制备的微球成本低、化学性能稳定、粒径均匀，多孔结构保证磁性粒子能够稳定分散在纤维素微球内，磁响应均匀稳定。便于本发明微球的重复利用，使其性能稳定。

本发明首次提出的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备方法，结合了磁性分离技术和表面分子印迹技术，制备得到青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球，可用于快速简便地定量检测和分离纯化植物中的青蒿琥酯。并且，该检测、分离技术简单可行，成本低，通过该方法定量检测和分离纯化的青蒿琥酯与通过液相色谱-质谱联用技术检测得到的实验数据对比，本发明方法更准确、快速、方便。根据本发明方法得到的青蒿琥酯纯度更高。实验结果表明，本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球是一种快速简便地检测和分离纯化的植物中青蒿琥酯含量的生物功能性材料。

本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球用作吸附剂，可用于选择性识别和吸附青蒿琥酯，定量检测青蒿琥酯，并且能够分离纯化该物质，并且该微球可以回收重复利用。本发明的青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球，还实现了方便快速检测和分离纯化一体化的过程。其中，分离过程快速简便，可重复利用，成本低，实际可操作性强。同时，其对于分离识别体系没有特别要求，可以进行大批量的分离纯化。

本发明提出的青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球具有生物相容性以及无毒性和可进行磁共振成像等特征，在生物领域、药物缓释等诸多方面具有广阔的应用前景。

本发明的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球还具有可重复检测和分离纯化的作用。

附图说明

图1是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球的制备过程示意图；

图2是本发明多孔磁性纤维素微球的红外谱图(IR)；

图3是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球的红外谱图(IR)；

图4是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球磁响应；

图5是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球粒径分布；

图6是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球显微镜图；其中，(a)为40x25，(b)为25x25，(c)为40x10；

图7是本发明中青蒿琥酯吸光强度与浓度线性关系；

图8是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球吸附曲线；

图9是本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球重复利用效果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明提出的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备方法，如图1所示，其过程如下：

(1)Fe₃O₄纳米粒子的制备：

硫酸铁(Fe₂(SO₄)₃)和硫酸亚铁(FeSO₄)溶解在除过氧的去离子水中，将0.125mol/LFe₂(SO₄)₃溶液和0.1mol/L FeSO₄溶液以体积比为1.25∶1混合，25℃下氮气保护下超声0.5h。将氢氧化钠浓溶液(浓度为0.5-1mol/L)，缓慢滴加到溶液中，调节混合溶液pH至10-12，继续超声0.5h。升温至60℃，氮气保护超声1h。将生成Fe₃O₄静置，用磁铁分离回收，用丙酮和水交替洗涤3次，得到Fe₃O₄纳米粒子。

(2)磁性纤维素溶液的制备：

将碱/尿素水溶液冷冻至-15-0℃，然后加入纤维素，剧烈搅拌溶解纤维素，离心脱泡除去杂质得到纤维素溶液。

将步骤(1)中得到Fe₃O₄粒子(2.5-3.0g)，加入到脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO9)25ml，用快速搅拌5-10min混合均匀，离心除泡得到磁性流体。然后将磁性流体缓慢加到纤维素溶液中，搅拌均匀，得到磁性纤维素溶液。

(3)多孔磁性纤维素微球的制备：

将磁性纤维素溶液缓慢滴加分散在含有表面活性剂的有机溶解体系中，保持超声。滴加结束后继续超声，保持常温不变。加入酸调整溶液pH值至中性，静置分层，倒出上层溶液，乙醇和水反复洗涤，用磁铁分离得到多孔磁性纤维素微球。

(4)青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备：

将模板分子青蒿琥酯与功能单体甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶解在水溶液中，其中青蒿琥酯与甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比例为1∶(2-4)∶(2-4)∶(0.25-0.5)，25℃静置5-8h，形成预组装溶液。将预组装溶液与多孔磁性纤维素微球混合，加入引发剂过硫酸铵，与交联剂EDMA混合通入氮气，容器密闭后置于60-80℃油浴中，聚合24h，生成表面分子印迹多孔磁性纤维素微球。用磁铁收集，用无水乙醇洗涤3次。再用体积比为(80-90)∶(20-10)的甲醇/乙酸混合溶液为洗脱液，实时检测洗脱液中模板分子，直到无模板分子被检测到，置于真空烘箱中60℃，干燥24h。得到青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球。

实施例1 制备青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球

(1)Fe₃O₄纳米粒子的制备：

室温蒸馏水100ml采用功率40kHz超声5-10min后，加入0.0125mol的Fe₂(SO₄)₃粉末和0.01mol的FeSO₄粉末，配制0.125mol/L的Fe₂(SO₄)₃溶液和0.1mol/L的FeSO₄溶液，按照Fe₂(SO₄)₃∶FeSO₄摩尔比1.25∶1混合。在25℃，氮气保护下继续超声，得到混合均匀的溶液。，缓慢滴加浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH值至12，继续超声0.5h。升温至60℃，氮气保护超声1h。其中，超声功率为40kHz。将生成Fe₃O₄静置，用磁铁分离回收，用丙酮和水交替洗涤3次，得到Fe₃O₄纳米粒子。

(2)磁性纤维素溶液的制备：

将碱/尿素水溶液冷冻至-15℃，然后加入用机械搅拌粉碎过的纤维素，添加量为水溶液质量的4％，控制搅拌速度1500rpm/min，快速搅拌10min，溶解纤维素后8000rpm/min离心15min除气泡得到纤维素溶液。

将步骤(1)中得到Fe₃O₄粒子2.5g，加入到脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO7-AEO12)中，快速搅拌10min混合均匀，得到磁性流体。然后将磁性流体缓慢加到75ml的纤维素溶液中，快速搅拌均匀后8000rpm/min离心15min除气泡得到磁性纤维素溶液。

(3)多孔磁性纤维素微球的制备：

将脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO7-AEO12)、OP-10、液体石蜡按照体积比为0.5∶0.25∶10配置含有表面活性剂的有机溶解体系，超声10min混合均匀。将5g磁性纤维素溶液缓慢滴加到75g有机溶解体系中，保持40kHz超声，常温不变，超声时间60min。静置分层，倒出上层溶液，用丙酮和乙醇反复水洗，用磁铁分离得到磁性纤维素微球。

(4)青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的的制备：

常温下，将1.0mmol的青蒿琥酯与2.0mmol的甲基丙烯酸和2.0mmol的丙烯酰胺、0.25mmol的N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶解在100ml蒸馏水中，25℃静置8h，形成预组装溶液。然后，加入预组装溶液总质量的20％的磁性纤维素微球，超声10min。氮气保护条件下，加入6％的引发剂过硫酸铵，与2％交联剂EDMA混合，容器密闭后置于80℃油浴中，聚合24h，生成表面分子印迹多孔磁性纤维素微球。用无水乙醇和水交替洗涤3次，用磁铁收集。再用体积比为90∶10的甲醇/乙酸混合溶液为洗脱液，实时检测洗脱液中青蒿琥酯含量，直到无青蒿琥酯被检测到，置于真空烘箱中60℃，干燥24h。得到青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球。

本实施例制备得到的青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球，对其进行检测的结果，如图2至图6所示。其中，磁性四氧化三铁纳米粒子分布在多孔的纤维素微球内部，使得多孔微球带有磁性。包裹的纤维素微球起到了稳定性支撑的作用，同时保证的生物无毒。多孔结构能够使得吸附作用速度和吸附量增大。在微球表面聚合形成表面分子印迹聚合物，包覆在磁性纤维素微球表面，表面积增大，结合位点增多，吸附量增加。且由于纤维素大量氢键的存在起到保护作用，使得印迹聚合物稳定性增强，使用环境受到的温度、pH值限制减小。更好的检测、分离和识别青蒿琥酯不受外界条件影响。

实施例2 青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球吸附性能测定

紫外可见分光光度计绘制青蒿琥酯的标准曲线：以DMSO溶液为溶剂，配制浓度为10^-4-10^-5mol/L(10^-5，2x10^-5，3x10^-5，4x10^-5，5x10^-5，6x10^-5，7x10^-5，8x10^-5，9x10^-5，10^-4)梯度浓度的青蒿琥酯溶液，紫外最大吸光度值对应的出峰值为238nm，绘制青蒿琥酯浓度与238nm处所对应的吸光度值，得到线性回归方程：Y＝0.20209X R²＝0.996，其中X代表青蒿琥酯浓度，Y代表紫外最大峰值238nm处对应的吸光度值。青蒿琥酯吸光强度与浓度线性关系，如图7所示。

用青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球测定方法为：取5mg的青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球加入到青蒿琥酯的梯度浓度10^-410^-5mol/L(10^-5，2x10^-5，3x10^-5，4x10^-5，5x10^-5，6x10^-5，7x10^-5，8x10^-5，9x10^-5，10^-4)待测样品溶液中，置于25℃下，恒温振荡24h，用磁铁进行分离，收集后微球置于索式提取仪中，加入甲醇乙酸体积比为(9∶1)混合溶液，进行洗脱，将洗脱液在上述紫外分光光度计测定条件下进行检测，测定紫外238nm最大峰值处对应的吸光度值，代入上述线性方程，计算得到分离提纯所得青蒿琥酯含量。

将洗脱液通过旋转蒸发仪，设定加热温度为60-70℃，减压10mmHg，减压蒸馏除去溶剂得到纯化青蒿琥酯。

结果表明：如图8所示，本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球在25℃饱和吸附量为0.48mg/mg，非印迹聚合物饱和吸附量为0.032mg/mg，达到饱和吸附时间6-8h，与现有吸附剂(例如，龚小燕等人制备的多孔硅胶表面分子印迹聚合物吸附剂，2011)相比较，本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球明显吸附量更多。将吸附的青蒿琥酯经过洗脱旋蒸处理后得到的青蒿琥酯的含量约为吸附青蒿琥酯的总质量的95％，且不含其他物质，说明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球能够特异性吸附并分离纯化青蒿琥酯。

实施例3 青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球重复利用效果测定

将采集的青蒿草研碎，然后加入DMSO溶液，过滤后除去残渣，然后用DMSO洗涤3-4次。得到待测植物组织液。

将青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球经过吸附检测青蒿琥酯，洗脱液洗脱分离模板分子后的青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球，再次置于经过上述处理后的植物组织液中，进行第二次青蒿琥酯的吸附检测，然后通过洗脱液洗脱分离纯化模板分子，计算第二次吸附过程中青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球吸附青蒿琥酯的含量，第二次洗脱后残留在微球上的青蒿琥酯的含量。重复上述过程5次。

如图9所示，结果表明得到青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球重复5次使用吸附量分别为0.48mg/mg，0.44mg/mg，0.42mg/mg，0.40mg/mg，0.41mg/mg，残留青蒿琥酯含量占吸附青蒿琥酯的总量分别为5％，6.9％，7.5％，8.9％，8.8％。说明制备的青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球具有吸附稳定，残留量低，可重复使用的性能。

根据上述青蒿琥酯含量的检测方法，利用本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔磁性纤维素微球对青蒿草植物组织液中进行分离、提纯，得到青蒿琥酯。由此可见，本发明青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球能够用于定量检测植物组织中的青蒿琥酯含量以及分离纯化青蒿琥酯。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims

1.一种青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的制备方法，其特征在于，包括以下：

(一)将Fe₃O₄纳米粒子加入到表面活性剂中制备得到磁性流体，缓慢滴加到利用碱尿体系溶解纤维素得到的纤维素溶液中，得到磁性纤维素溶液；

(二)将所述磁性纤维素溶液缓慢滴加到含有表面活性剂的有机溶剂体系中，超声，调节pH值至10-12，静置分层，将上层溶液经洗涤、分离得到多孔磁性纤维素微球；

(三)将预组装溶液与所述多孔磁性纤维素微球混合，引发剂、交联剂作用下经聚合反应得到所述青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球；

其中，所述预组装溶液包括模板分子青蒿琥酯和功能单体；所述功能单体包括甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(一)中，所述Fe₃O₄纳米粒子通过以下方式制备：将硫酸铁和硫酸亚铁溶解在去离子水中混合均匀溶解，25℃下氮气保护超声0.5h；缓慢滴加氢氧化钠浓溶液，调节混合pH至10-12，超声、静置，经回收、洗涤得到所述Fe₃O₄纳米粒子。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超声包括，首先超声0.5h，然后升温至60℃，氮气保护超声1h；超声功率为20kHz-40kHz。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(一)中，所述碱尿体系是碱/尿素水溶液；所述纤维素溶液通过以下方式制备：将所述碱/尿素水溶液冷冻至-15-0℃，加入纤维素，剧烈搅拌溶解纤维素，经离心脱泡得到所述纤维素溶液。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(一)和步骤(二)中，所述表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(二)中，所述磁性纤维素溶液与所述有机溶剂体系的质量比为1-5∶25-75；所述有机溶剂体系包括脂肪醇聚氧乙烯醚、OP-10、液体石蜡。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(三)中，所述预组装溶液通过以下方式制备：将模板分子青蒿琥酯与功能单体甲基丙烯酸、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶解在水溶液中，25℃下静置5-8h，形成所述预组装溶液。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预组装溶液中，模板分子与功能单体摩尔比为青蒿琥酯∶甲基丙烯酸∶丙烯酰胺∶N，N-亚甲基双丙烯酰胺＝1.0-1.5∶2.0-4.0∶2.0-4.0∶0.25-0.5。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(三)中，所述多孔磁性纤维素微球占预组装溶液总质量的10-20％；所述聚合反应温度为60-80℃，反应时间为24h；所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、硝酸铈铵、偶氮二异丁腈中的任意一种，引发剂的用量为所述功能单体总质量的6％；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，交联剂的用量为所述功能单体总质量的2％。

10.根据权利要求1-9之任一项所述方法制备得到的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球。

11.如权利要求10所述的青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球，其特征在于，其以纤维素为外壳，以Fe₃O₄纳米磁性材料为磁性内核；所述微球表面的外壳具有孔道，与内部空腔连接。

12.如权利要求10所述青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球的应用，其特征在于，所述青蒿琥酯表面分子印迹多孔纤维素微球用于青蒿琥酯检测、分离和纯化。