CN101393158B - 过氧化氢的生物传感酶检测电极及其的检测方法 - Google Patents

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一种材料分析技术领域的过氧化氢的生物传感酶检测电极及其的检测方法,生物传感酶检测电极包括:电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、隔离片和盖片,在对电极和工作电极两端覆盖上隔离片,在隔离片上部覆盖盖片,电极、隔离片和盖片之间的空隙形成加样孔。本发明方法中,将辣根过氧化物酶固定在生物传感酶检测电极中工作电极的表面,制成能够对过氧化氢进行快速检测的电流型生物传感器,过氧化氢与盐酸邻联甲苯胺在HRP的催化作用下发生氧化还原反应,产生电子迁移,形成电流。本发明能大大缩短样品处理和检测时间,实现样品中过氧化氢的快速检测,且易于产业化制作和一次性使用。

Description

过氧化氢的生物传感酶检测电极及其的检测方法
技术领域
本发明涉及一种传感器技术领域的装置和方法,具体是一种过氧化氢的生物传感酶检测电极及其的检测方法。 
背景技术
过氧化氢作为一种常见的抑菌保鲜剂在食品行业中应用广泛,如在水发食品牛百叶、海蜇、鱼翅以及虾仁、带鱼、鱿鱼、水果罐头、和面制品等的生产过程中添加双氧水,以提高产品的外观形象。随着生活水平的提高,人们对健康环保意识逐渐增强,对食品品质的要求日益提高,食品安全问题在我国得到了越来越广泛的重视,有关过氧化氢的残留危害的问题也日渐引起人们的注意。国内外很多研究表明,过氧化氢残留对机体某些生物大分子有很强的损伤作用,有较强的致癌性。因而建立一种快速有效的检测过氧化氢的方法,对于加强食品安全,保护人民群众的健康有重要的意义。 
目前,测定过氧化氢的主要方法有分光光度法、原子吸收法、光化学方法以及电化学方法等。其中采用电化学方法检测过氧化氢,具有样品处理简单,操作方便,灵敏度高等优点,成为当前研究过氧化氢检测的一个热点。当前检测食品及保健品中过氧化氢的国家标准方法是化学滴定法(GB1616-88高锰酸钾法或碘量法),该方法的样品前处理过程复杂,检测时间长,滴定终点难掌握,并且常因食品中含有还原性物质(如维生素C等)的存在导致检测结果偏高,并且检测限一般为100ppm左右,达不到许多微量或痕量检测要求。目前尚未见到有关采用丝网印刷技术产业化制作一次性用于残留过氧化氢检测酶电极的相关报道。 
经对现有技术文献的检索发现,中国专利申请号为03132054.6,名称为“一种制备二氧化钛凝胶膜电化学生物传感器的方法”,该专利中采用二氧化钛凝胶膜对传统电极进行修饰,然后采用电化学的方法来检测过氧化氢。该方法制备修饰电极的过程相当复杂,电极的准备时间超过2小时,制备出的修饰电极稳定性 差,修饰电极不能长期保存,当保存时间超过一个月时,电极的响应灵敏度下降超过25%,因而不能大范围推广使用。 
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足,提供了一种过氧化氢的生物传感酶检测电极及其的检测方法,使其易于产业化制作和一次性使用,并且大大缩短了样品处理和检测时间,从而实现样品的现场快速检测。 
本发明是通过以下技术方案实现的。 
本发明涉及一种过氧化氢的生物传感酶检测电极,包括:电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、隔离片和盖片,其中: 
接线端子、电极连线与工作电极连成一体组成一条电极基体,接线端子、电极连线与对电极连成一体组成另一条电极基体,两条电极基体相互平行,电极连线表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体,两条电极基体设置在电极基片上,接线端子和对电极均为裸露的导电材料薄膜,在相互平行的对电极和工作电极两端覆盖有隔离片,隔离片与对电极、工作电极垂直放置,隔离片上部覆盖盖片,电极、隔离片和盖片之间的空隙形成加样孔。 
所述工作电极、对电极,其形状均为正方形或长方形块状。 
所述电极基片,是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸盐中任选一种聚合物制成,该聚合物为片材或卷材。 
所述隔离片,其双面带胶贴片,厚度均匀,是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸盐任选一种聚合物制成,该聚合物为片材或卷材。 
所述盖片,选用透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰亚胺片、聚乙烯片、聚乙烯对苯二甲酸盐片任选一种聚合物制成。 
所述两条平行电极连线之间的间距为2.5mm~3mm。 
所述工作电极,其与对电极之间的间距为0.8mm~1mm。 
本发明还涉及一种如应用上述过氧化氢的生物传感酶检测电极的检测方法,包括如下步骤: 
步骤一,在生物传感酶检测电极的工作电极上采用涂布法涂布一层壳聚糖膜,晾干后,在电极的工作电极上滴加1μL-5μL2mg/mL的辣根过氧化物酶液,低温冷冻干燥,粘贴上隔离片,然后盖上盖片,在4℃环境下保存生物传感酶检 测电极; 
步骤二,制备盐酸邻联甲苯胺溶液:取盐酸邻联甲苯胺0.1g-0.3g,加入无水乙醇1mL-5mL,然后再加入二氧六环1mL-5mL,最后用pH5.0的柠檬酸缓冲液定容为100mL,避光保存; 
步骤三,向待测的含有过氧化氢的样品液中加入盐酸溶液后,与盐酸邻联甲苯胺溶液等体积混合形成反应液,并将生成的反应液滴加到生物传感酶检测电极中加样孔; 
步骤四,检测工作电极与对电极之间的电流,若电流在电流检测仪的检测范围之内,则可通过电流检测仪自动处理转化,并与单片机中储存的标准曲线进行比对,转化为过氧化氢的浓度,直接由显示器显示出检测结果,若电流低于或高于电流检测仪的检测范围,则显示器显示过氧化氢浓度低于检测范围的最小值或高于检测范围的最大值。 
所述电流检测仪的检测范围为5mg/L-200mg/L。 
本发明利用壳聚糖良好的成膜性和较好的粘结能力以及其内部的极性化学基团,将辣根过氧化物酶(HRP)固定在生物传感酶检测电极中工作电极的表面,制成能够对过氧化氢进行快速检测的电流型生物传感器,过氧化氢与盐酸邻联甲苯胺在HRP的催化作用下发生氧化还原反应,产生电子迁移,形成电流,电流强度与过氧化氢浓度成正比,检测范围为5mg/L-200mg/L。 
与现有技术相比,具有如下有益效果: 
本发明具有丝网印刷电极结构简单,加工方法简便、成本低,用该丝网印刷电极制成的传感器检测过氧化氢操作方便,样品前处理简单,检测时间短,只需6秒,而且抗干扰能力较强,检测灵敏度高。 
本发明能够进行产业化生产,在食品中过氧化氢的现场快速检测领域将有很好的应用前景。 
附图说明
图1为本发明中生物传感酶检测电极的平面结构示意图; 
图2为本发明中生物传感酶检测电极的空间结构示意图; 
图3为本发明中生物传感酶检测电极的横向剖面示意图; 
图4为本发明的实施例中标定的检测结果曲线图, 
图中,图(a)为生物传感酶检测电极检测过氧化氢时间与电流曲线图,图 (b)为过氧化氢浓度与电流的标准曲线图; 
图5为本发明进行快速检测残留过氧化氢的工作原理图。 
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 
如图1、2、3所示,本实施例涉及一种过氧化氢的生物传感酶检测电极,包括:电极基片1、接线端子2、电极连线3、工作电极4、对电极5、隔离片6和盖片7,其中: 
接线端子2、电极连线3与工作电极4连成一体组成一条电极基体,接线端子2、电极连线3与对电极5连成一体组成另一条电极基体,两条电极基体相互平行,电极连线3表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体8,两条电极基体设置在电极基片1上,接线端子2和对电极5均为裸露的导电材料薄膜,在相互平行的对电极5和工作电极4两端覆盖有隔离片6,隔离片6与对电极5、工作电极4垂直放置,隔离片6上部覆盖盖片7,对电极5、工作电极4、隔离片6和盖片7之间的空隙形成加样孔9。 
所述电极基片1,其长度为32mm~36mm、宽度为7mm~8mm、厚度为0.3mm~0.5mm; 
所述接线端子2,其长度为4mm~6mm、宽度为1.5mm~2mm; 
所述电极连线3,其长度为20mm~25mm、宽度为0.8mm~1mm; 
所述工作电极4,其形状为实心方片状,长度为2mm~3mm、宽度为2mm~3mm; 
所述对电极5,其形状为实心方片状,长度为2mm~3mm、宽度为2mm~3mm; 
所述隔离片6,其长度为7~8mm、宽度为3mm~4mm、厚度为0.3mm~0.4mm; 
所述盖片7,其长度为10~14mm、宽度为7mm~8mm、厚度为0.2mm~0.3mm; 
所述两条平行电极连线3,其之间的间距为2.5mm~3mm; 
所述工作电极4,其与对电极5之间间距0.8mm~1mm。
所述电极基片1,其材料为聚乙烯对苯二甲酸盐,该聚合物为片材或卷材。 
所述隔离片6,其材料为聚氯乙烯,该聚合物为片材或卷材。 
所述盖片7,其材料为聚氯乙烯片。 
本实施例还涉及一种如应用上述过氧化氢的生物传感酶检测电极进行检测的方法,包括如下步骤: 
步骤一,在生物传感酶检测电极的工作电极上采用涂布法涂布一层壳聚糖膜,晾干后,在电极的工作电极上滴加1μL-5μL2mg/mL的辣根过氧化物酶液,低温冷冻干燥,粘贴上隔离片,然后盖上盖片,在4℃环境下保存生物传感酶检测电极; 
步骤二,制备盐酸邻联甲苯胺溶液:取盐酸邻联甲苯胺0.1g-0.3g,加入无水乙醇1mL-5mL,然后再加入二氧六环1mL-5mL,最后用pH5.0的柠檬酸缓冲液定容为100mL,避光保存; 
步骤三,向待测的含有过氧化氢的样品液中加入盐酸溶液后,与盐酸邻联甲苯胺溶液等体积混合形成反应液,并将生成的反应液滴加到生物传感酶检测电极中加样孔; 
步骤四,检测工作电极与对电极之间的电流,若电流在电流检测仪的检测范围之内,则可通过电流检测仪自动处理转化,并与单片机中储存的标准曲线进行比对,转化为过氧化氢的浓度,直接由显示器显示出检测结果,若电流低于或高于电流检测仪的检测范围,则显示器显示过氧化氢浓度低于检测范围的最小值或高于检测范围的最大值。 
所述电流检测仪的检测范围为5mg/L-200mg/L。 
本实施例中,采用丝网印刷技术将导电银浆在电极基片上印刷两条电极的基体,它们上端为裸露的接线端子,它们的中间部分的电极连线表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体,下端为相互平行的工作电极和对电极(工作电极和对电极也可单独用碳浆印制)。 
隔离片与工作电极和对电极的两端对齐,形成的加样孔的孔隙不能太大,加样孔主要是采用毛细现象让反应液滴自动进入空隙,并与工作电极上的反应层相接触发生反应。 
用300nm的二氧化钛纳米粉将工作电极抛光,再用质量百分比为50%的硝酸浸泡处理,最后用蒸馏水冲洗3次,用涂布法在工作电极上涂布一层质量百分 比为3%水溶性壳聚糖溶液,晾干,然后滴加2微升3mg/mL的辣根过氧化物酶液,4℃晾干,粘贴上隔离片,然后盖上盖片。 
如图4所示,标定过氧化氢溶液浓度与时间、电流的曲线图: 
将质量分数30%的过氧化氢溶液采用高锰酸钾滴定法滴定,然后分别稀释成以下浓度:0.0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L作为标准液。 
将每种浓度的过氧化氢标准液与等体积的盐酸邻联甲苯胺溶液混合均匀形成反应液,取10微升滴在以上述方法制成的生物传感酶检测电极的加样孔中,测定并记录电极的时间电流曲线,每一种过氧化氢浓度平行测定四次,过氧化氢浓度与传感器测定的电流在加样后6秒时成良好正比例关系。 
样品处理: 
(1)液体样品:用1mL移液器准确移取样品0.9mL,加入0.1mol/L盐酸100微升,搅拌均匀,静置5分钟,然后离心,取上清液作为待测溶液。 
(2)固体样品:用电子天平称取样品1.00g,然后加入蒸馏水2mL搅拌1分钟,然后加入0.1mol/L盐酸100微升,搅拌均匀,静置5分钟,然后离心,取上清液作为待测溶液。 
分别将上述液体样品制成的待测溶液和固体样品制成的待测溶液,与盐酸邻联甲苯胺溶液等体积混合滴加到已标定好的生物传感酶检测电极的加样孔中,检测过氧化氢残留,最低检测限达到0.5mg/L。 
如图5所示,本实施例使用生物传感酶检测电极和电流检测装置进行快速检测残留过氧化氢的工作原理图,生物传感酶检测电极上HRP催化反应液中的过氧化氢发生氧化还原反应,放出电子,电子再与反应液中的盐酸邻联甲苯胺反应,生成传电子络合物,电子在传感器检测仪的恒电位激励下发生定向移动形成电流,电流被转换及放大后经过模数转换器之后,由单片机将电信号转换成过氧化氢浓度直接从液晶显示器上读出,同时还将数据存储到存储器中。 
本实施例重复性好,反应灵敏,检测时间短,只需6秒,样品处理方法简单,而且抗干扰能力较强,在食品中过氧化氢的现场快速检测领域将有很好的应用前景。

Claims (9)

1.一种过氧化氢的生物传感酶检测电极的检测方法,该过氧化氢的生物传感酶检测电极包括:电极基片、接线端子、电极连线、工作电极、对电极、隔离片和盖片,其中:接线端子、电极连线与工作电极连成一体组成一条电极基体,接线端子、电极连线与对电极连成一体组成另一条电极基体,两条电极基体相互平行,电极连线表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体,两条电极基体设置在电极基片上,接线端子和对电极均为裸露的导电材料薄膜,在相互平行的对电极和工作电极两端覆盖有隔离片,隔离片与对电极、工作电极垂直放置,隔离片上部覆盖盖片,电极、隔离片和盖片之间的空隙形成加样孔;其特征在于,所述方法包括如下步骤:
步骤一,在生物传感酶检测电极的工作电极上采用涂布法涂布一层壳聚糖膜,晾干后,在电极的工作电极上滴加1μL-5μL 2mg/mL的辣根过氧化物酶液,低温冷冻干燥,粘贴上隔离片,然后盖上盖片,在4℃环境下保存生物传感酶检测电极;
步骤二,制备盐酸邻联甲苯胺溶液:取盐酸邻联甲苯胺0.1g-0.3g,加入无水乙醇1mL-5mL,然后再加入二氧六环1mL-5mL,最后用pH5.0的柠檬酸缓冲液定容为100mL,避光保存;
步骤三,向待测的含有过氧化氢的样品液中加入盐酸溶液后,与盐酸邻联甲苯胺溶液等体积混合形成反应液,并将生成的反应液滴加到生物传感酶检测电极中加样孔;
步骤四,检测工作电极与对电极之间的电流,若电流在电流检测仪的检测范围之内,则可通过电流检测仪自动处理转化,并与单片机中储存的标准曲线进行比对,转化为过氧化氢的浓度,直接由显示器显示出检测结果,若电流低于或高于电流检测仪的检测范围,则显示器显示过氧化氢浓度低于检测范围的最小值或高于检测范围的最大值。
2.根据权利要求1所述的应用过氧化氢的生物传感酶检测电极进行检测的方法,其特征是,所述检测范围为5mg/L-200mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述工作电极、对电极,其形状均为正方形或长方形。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述电极基片,是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸盐中任选一种聚合物制成,该聚合物为片材或卷材。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述隔离片,其双面带胶贴片,厚度均匀,厚度为0.3mm~0.4mm。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述隔离片,是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸盐中任选一种聚合物制成,该聚合物为片材或卷材。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述盖片,是由透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰亚胺片、聚乙烯片、聚乙烯对苯二甲酸盐片中任选一种聚合物制成。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述两条平行电极连线之间的间距为2.5mm~3mm。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述工作电极,其与对电极之间的间距为0.8mm~1mm。
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