CN106596648B - 用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，利用氧化铝纳米多孔膜为核心传感平台，对其使用3‑(2,3‑环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPMS)进行处理，并在膜上直接固定细菌抗体，用于捕获相应的沙门氏菌。细菌造成纳米孔膜阻塞，抗生素作用于细菌，起灭菌作用，减少纳米孔膜的阻塞效应，可利用电化学阻抗法分析检测。本发明提供了一种用于环境中抗生素快速、简便检测分析的细菌生物传感器的制备方法。

Description

用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种传感器件的制备技术，尤其涉及一种用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法。
背景技术
抗生素能有效地用于治疗多种细菌性感染疾病。我国是抗生素的生产和使用大国，主要在畜禽养殖业，抗生素作为饲料添加剂被大量使用。但大部分抗生素不被动物机体吸收而随尿或粪便排出体外，进入水环境中，可导致大量耐药性致病菌的产生，成为自然界水体环境新的污染源。
传统的抗生素检测方法有气相色谱分析，色谱/质谱联用技术，高效液相色谱，毛细管电泳分析等。这些方法检测灵敏度高、准确度高，可同时进行多种元素或化合物的检测，但其对设备要求高，价格昂贵，样品前处理过程繁琐、费时，并且需要专业的技术人员，不适宜现场快速检测。因此，需要发展一种低成本、便携式的抗生素检测方法。
近年来，生物传感器趋向于微型化、集成化、智能化方向发展，在快速检测领域有越来越广阔的发展和应用前景。随着微生物固定化技术的发展，现已发展的微生物传感器如硝化细菌传感器、发光型微生物传感器、全细胞微生物传感器等，应用于水质分析。这些传感器借助于敏感膜电极或离子选择电极等检测微生物代谢产生的电活性物质或水体中的危害物质，该方法具有较好的特异性、选择性、成本低，但传感特性易受电极影响。
发明内容
为了克服已有细菌生物传感方式的无法适用于抗生素的检测分析的不足，本发明提供了一种用于环境中抗生素快速、简便检测分析的细菌生物传感器的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化铝纳米多孔膜的表面功能化：
氧化铝纳米多孔膜用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理后，利用环氧树脂胶封于聚二甲基硅氧烷(PDMS)容器中；加入沙门氏菌抗体溶液，0～4℃下静置3～6小时后，使得抗体固定在多孔膜上；
往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌抗体1～3次；将准备好的氧化铝纳米多孔膜器件放在4℃条件下备用；
(2)捕获细菌：将培养好的沙门氏菌分散在PBS缓冲液中，配成不同浓度的沙门氏菌溶液，取上述准备好的沙门氏菌溶液，加入到步骤(1)中得到的氧化铝纳米多孔膜上，静置6～10小时后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌1～3次，制备得到基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器。
进一步，所述制备方法还包括以下步骤：
(3)抗生素检测分析：往步骤(2)得到的细菌生物传感器加入待测试抗生素样品，抗生素作用一段时间后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于冲去失活的细菌和多余的抗生素1～3次；根据氧化铝纳米多孔膜两端阻抗的变化检测分析待测试样品中的抗生素。
再进一步，所述步骤(1)中，沙门氏菌抗体溶液浓度为0.5μg/mL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
所述步骤(2)中，沙门氏菌溶液浓度为0.001～10^5CFU/μL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
所述步骤(3)中，抗生素作用时间为分钟5～5小时。
本发明利用氧化铝纳米多孔膜蜂窝状结构使得氧化铝纳米多孔膜比表面积大且容易修饰。基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器，主要在膜上固定沙门氏菌抗体，捕获沙门氏菌。沙门氏菌在纳米孔内造成阻塞效应，阻碍溶液中离子通过多孔膜。抗生素作用于细菌，起到灭菌作用，减少阻塞效应。以上现象可通过电化学阻抗法分析，达到抗生素检测分析的目的。
本发明的有益效果主要表现在：将沙门氏菌固定在氧化铝纳米多孔膜上，用于抗生素的检测分析。实验表明该方法构建的电化学阻抗传感器可用于快速、简便的水体环境中抗生素分析检测。
附图说明
图1为本发明传感器的核心芯片纳米多孔膜修饰图；
图2为沙门氏菌在传感芯片上的扫描电子显微镜(SEM)图；
图3为本发明细菌生物传感器制备过程中沙门氏菌抗体固定、细菌捕获前后的电化学阻抗谱曲线；
图4为本发明细菌生物传感器阻抗与细菌浓度的对数之间的线性关系；
图5为本发明细菌生物传感器检测氨苄青霉素(Ampicillin)和恩诺沙星(Enrofloxacin)抗生素的电化学阻抗谱曲线；
图6为本发明细菌生物传感器检测氨苄青霉素和恩诺沙星抗生素的阻抗变化对比。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。
参照图1～图6，一种用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化铝纳米多孔膜的表面功能化：
氧化铝纳米多孔膜用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理后，利用环氧树脂胶封于聚二甲基硅氧烷(PDMS)容器中；加入沙门氏菌抗体溶液，0～4℃下静置3～6小时后，使得抗体固定在多孔膜上；
往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌抗体1～3次；将准备好的氧化铝纳米多孔膜器件放在4℃条件下备用；
(2)捕获细菌：将培养好的沙门氏菌分散在PBS缓冲液中，配成不同浓度的沙门氏菌溶液，取上述准备好的沙门氏菌溶液(100μL)，加入到步骤(1)中得到的氧化铝纳米多孔膜器件，静置6～10小时后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌1～3次，制备得到基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器。
进一步，所述制备方法还包括以下步骤：
(3)抗生素检测分析：往步骤(2)得到的细菌生物传感器加入待测试抗生素样品，抗生素作用一段时间后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于冲去失活的细菌和多余的抗生素1～3次；根据氧化铝纳米多孔膜两端阻抗的变化检测分析待测试样品中的抗生素。
再进一步，所述步骤(1)中，沙门氏菌抗体溶液浓度为0.5μg/mL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
所述步骤(2)中，沙门氏菌溶液浓度为0.001～10^5CFU/μL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
所述步骤(3)中，抗生素作用时间为分钟5～5小时。
本发明利用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的氧化铝纳米多孔膜表面的环氧基团共价结合沙门氏菌抗体，将抗体固定到氧化铝纳米多孔膜表面，捕获沙门氏菌。细菌在纳米孔内阻碍溶液中离子通过多孔膜，造成阻塞效应。抗生素作用于沙门氏菌，起灭菌作用，减少孔内阻塞效应。上述现象可通过电化学阻抗分析，进而检测分析水体环境中的抗生素。与传统的抗生素检测相比，操作过程简单，易于测量，并能实现快速检测分析。
实例1：细菌生物传感器的制备过程如图1所示：经2％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷硅烷化处理氧化铝纳米多孔膜，利用环氧树脂胶将硅烷化后的氧化铝纳米多孔膜封于聚二甲基硅氧烷(PDMS)容器中。加入沙门氏菌抗体溶液(0.5μg/mL，100μL)，4℃下静置4小时后，使得抗体固定在多孔膜上。往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌抗体，重复该步骤3次。将准备好的氧化铝纳米多孔膜器件放在4℃条件下备用。
将培养好的沙门氏菌分散在PBS中，配成不同浓度的沙门氏菌溶液。取上述准备好的沙门氏菌溶液(100μL)，加入氧化铝纳米多孔膜器件，静置8小时后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌3次，制备得到基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器。
抗生素检测分析过程如下：往上述制备得到的细菌生物传感器中加入氨苄青霉素(1mM,100μL)和恩诺沙星(1mM,100μL)抗生素，待抗生素作用3小时后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于冲去失活的细菌和多余的抗生素3次。根据氧化铝纳米多孔膜两端阻抗的变化检测分析待测试样品中的抗生素。
在氧化铝纳米多孔膜表面固定细菌后，用扫描电子显微镜(SEM)对其进行表征，得到结果如图2所示。细菌在纳米孔膜表面分散固定，说明该细菌生物传感器的成功制备。
在氧化铝纳米多孔膜表面固定抗体和捕获细菌前后，都需要对每个传感器芯片进行电化学阻抗谱扫描用于对纳米孔膜芯片进行电化学表征和对处理过程进行验证。以两根铂电极作为工作电极和参考电极，PDMS上下腔内分别注满PBS缓冲液作为电解液，以电化学工作站作为仪器平台对多孔膜进行电化学阻抗谱扫描。具体测试参数为：交流电压幅度为50mV，扫频范围为1Hz-10kHz。得到电化学阻抗谱曲线。抗体固定前后得到1Hz-1kHz范围的阻抗谱曲线如图3所示。从图中可以看出，氧化铝纳米多孔膜表面固定抗体和捕获细菌后，阻抗都显著增加，是因为抗体和细菌在很大程度上阻碍了离子通过纳米孔，电流减少，导致阻抗增加。因此，进一步证明基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器成功制备。不同细菌浓度的阻抗变化如图4所示。以阻抗谱的幅值(Y)为纵坐标，细菌浓度为横坐标，制作线性曲线，线性关系公式为Y＝1.765ln[C]-0.16，线性度为0.96。随着细菌浓度的增加，阻抗增加。
氨苄青霉素和恩诺沙星抗生素分别作用于细菌后，使得部分细菌被杀灭，检测到阻抗谱曲线如图5所示。随着抗生素对沙门氏菌起灭菌作用，阻抗谱减少。两种抗生素在相同时间内作用效果对比如图6所示。从结果可得，氨苄青霉素的作用略强。本发明中的基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器能够实现不同种类的抗生素快速检测分析，成本低、简便且易于操作。

Claims (5)

1.一种用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)氧化铝纳米多孔膜的表面功能化
氧化铝纳米多孔膜用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理后，利用环氧树脂胶封于聚二甲基硅氧烷PDMS容器中；加入沙门氏菌抗体溶液，0～4℃下静置3～6小时后，使得抗体固定在多孔膜上；
往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌抗体1～3次；将准备好的氧化铝纳米多孔膜器件放在4℃条件下备用；
(2)捕获细菌：将培养好的沙门氏菌分散在PBS缓冲液中，配成不同浓度的沙门氏菌溶液；取上述准备好的沙门氏菌溶液，加入到步骤(1)中得到的氧化铝纳米多孔膜上，静置6～10小时后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的沙门氏菌1～3次，制备得到基于氧化铝纳米多孔膜的细菌生物传感器。
2.如权利要求1所述的用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：
(3)抗生素检测分析：往步骤(2)得到的细菌生物传感器加入待测试抗生素样品，抗生素作用一段时间后，往PDMS容器的上下腔以恒定的速率缓慢通入和抽出PBS缓冲液，用于冲去失活的细菌和多余的抗生素1～3次；根据氧化铝纳米多孔膜两端阻抗的变化检测分析待测试样品中的抗生素。
3.如权利要求1或2所述的用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，沙门氏菌抗体溶液浓度为0.5μg/mL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
4.如权利要求1或2所述的用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，沙门氏菌溶液浓度为0.001～10^5CFU/μL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
5.如权利要求2所述的用于环境中抗生素检测分析的细菌生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，抗生素作用时间为5分钟～5小时。
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