CN104677962B - 一种过氧化聚多巴胺修饰电极以及基于该电极的氯霉素电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品中兽药残留检测技术领域，具体公开了一种过氧化聚多巴胺修饰电极以及基于该电极的氯霉素电化学检测方法。所述的过氧化聚多巴胺修饰电极，通过包含如下步骤的方法制备得到：将玻碳电极浸入多巴胺溶液中，利用多巴胺的自聚反应在电极表面形成聚多巴胺膜；将聚多巴胺修饰电极浸入碱溶液中进行电化学处理，制得过氧化聚多巴胺修饰电极。通过直接测定氯霉素在修饰电极上的电化学响应信号得到待测溶液中氯霉素的浓度。本发明的过氧化聚多巴胺修饰电极制备方法简便易行、成本低、便于批量制备，用该修饰电极检测氯霉素操作简单、选择性好，适用于牛奶和蜂蜜等食品样品中氯霉素残留的测定。
Description
技术领域
本发明涉及食品中兽药残留检测技术领域，具体涉及一种过氧化聚多巴胺修饰电极以及基于该电极的氯霉素电化学检测方法。
背景技术
氯霉素类抗生素，是一类包括氯霉素以及一系列氯霉素衍生物的广谱高效抗菌性药物，广泛用于动物各种细菌性传染疾病的治疗。医学研究表明，食品中的氯霉素类药物残留对人体有严重的副作用，长期微量摄入会使一些致病菌产生耐药性，引起机体正常菌群失调，使人容易感染各种疾病。此外，氯霉素类药物对人的骨髓细胞、肝细胞具有毒性作用。我国农业部2002年发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，禁止给所有食品动物使用氯霉素。但由于氯霉素价格低廉、抑菌效果好，目前仍有人在违规使用。因此，检测动物源性食品中的氯霉素残留量对食品质量监控和消费者健康保障具有重要意义。
目前，氯霉素残留的检测方法主要有微生物法、色谱法、光谱法、免疫分析和电化学传感分析等快速检测方法。微生物法经济简便、容易操作，但其敏感性和特异性低，而且由于其结果会出现假阳性，容易引起误判。色谱法具有灵敏度高、准确可靠等特点，但是专业性强、成本较高、样品前处理操作复杂，不适合进行大批量样品的快速筛选检测。光谱法具有成本低、操作简便等优点，但其选择性较低，而且近红外光谱法需要结合化学计量学技术进行数据解析，专业性强。免疫分析法快速灵敏、特异性强、适于大批量样品的快速筛选检测，但所用抗体的制备过程繁琐耗时、测定成本高。电化学传感分析法具有快速灵敏、操作简便、易于微型化和实现现场分析等特点，在氯霉素残留快速检测方面具有独特优势。近年来，氯霉素的生物电化学传感检测和分子印迹仿生传感检测方法取得了一定的突破，但是生物分子价格昂贵，且环境耐受性差。虽然分子印迹聚合物克服了生物分子的上述缺陷，但寻找合适的功能单体和洗脱剂的过程费时费力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是，为了克服现有技术中氯霉素残留检测技术的不足，提供一种用于食品中氯霉素残留检测的过氧化聚多巴胺修饰电极。
本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种基于过氧化聚多巴胺修饰电极的氯霉素电化学检测方法。
一种过氧化聚多巴胺修饰电极，通过包含如下步骤的方法制备得到：
S1.将玻碳电极置于多巴胺溶液中，在室温条件下避光反应，反应结束后，取出电极用超纯水充分淋洗，得聚多巴胺修饰电极；
S2. 将碱溶液置于电解杯中，通氮除氧后，以聚多巴胺修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极系统置于碱溶液中，分别通过电极线连接于电化学分析仪，用循环伏安法对聚多巴胺修饰电极进行电化学处理，即得过氧化聚多巴胺修饰电极。
本发明所述的过氧化聚多巴胺修饰电极相对于聚多巴胺修饰电极而言，通过过氧化处理使聚多巴胺所带的负电荷增加，与溶液中带正电荷的氯霉素分子之间的静电吸引作用力增强，氯霉素分子更容易到达电极表面进行电化学反应。因此，氯霉素在过氧化聚多巴胺修饰电极上的响应电流明显增强，可大大降低氯霉素的检出限，提高检测的灵敏度。
此外，本发明制备得到的过氧化聚多巴胺修饰电极对氯霉素具有良好的选择性。经检测，浓度为氯霉素浓度10倍的硫酸庆大霉素、青霉素钾、新霉素硫酸盐、盐酸金霉素、盐酸强力霉素、甲砜霉素均不干扰氯霉素的测定。
优选地，S1.中所述的多巴胺溶液通过如下方法配置得到：将多巴胺溶解在pH值为8.2~8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液（Tris-HCl）或pH值为6.8~7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中。
优选地，所述的多巴胺溶液中多巴胺的浓度为1~4 mg/mL；Tris-HCl或PBS的浓度为5~10 mmol/L。
优选地，S1.中所述的避光反应，其反应时间为2~20 h。
优选地，S1.中所述的室温是指15~30°C。
优选地，S2.中所述的碱溶液是浓度为0.1~0.5 mol/L的NaOH或KOH溶液。
优选地，S2.中所述的通氮除氧，其时间为10~30 min。
优选地，S2.中所述循环伏安法的具体条件为：在-1.5~1.0 V电压范围内，以50mV/s的扫速循环伏安扫描5~8圈，将处理后的电极用超纯水充分淋洗，即得。
一种基于过氧化聚多巴胺修饰电极的氯霉素电化学检测方法，使用本发明所述的过氧化聚多巴胺修饰电极，通过直接测定氯霉素在过氧化聚多巴胺修饰电极上的电化学响应信号得到待测溶液中氯霉素的浓度。
优选地，所述的氯霉素电化学检测方法为：检测氯霉素时，以过氧化聚多巴胺修饰电极为工作电极，采用方波伏安法直接测定氯霉素在-0.65 V的还原电流。
最优选地，所述的氯霉素电化学检测方法为：检测氯霉素时，以浓度为0.05~0.2mol/L的PBS（pH值为6.8~7.4）为背景溶液，通氮除氧10~30 min；当溶液中含有氯霉素时，静电吸引和氢键作用力使氯霉素分子到达过氧化聚多巴胺修饰电极的表面，从而可以在电极上获得氯霉素的还原电流，该还原电流与溶液中氯霉素的浓度成正比；根据电流与氯霉素浓度的对应关系，建立标准曲线，用于待测样品中氯霉素含量的测定。
相对于现有技术，本发明具有以下优点和有益效果：
（1）利用电化学方法测定氯霉素，克服了色谱等大型分析仪器测定成本高、现场分析能力差的缺点，具有样品前处理简单、试剂消耗量少、灵敏度高、快速简便等优点，可为微型、灵敏的现场快速检测仪器的发明提供依据。
（2）使用过氧化聚多巴胺修饰电极，通过直接测定氯霉素的还原电流进行检测，制备方法和检测方法快速简便、成本低廉。
（3）本发明建立的氯霉素电化学检测方法，选择性好、线性范围宽，可用于牛奶和蜂蜜等食品样品中氯霉素残留的快速检测。
（4）本发明中玻碳电极的修饰方法可推广至丝网印刷电极等微电极，进一步开发微型检测仪器。
附图说明
图1为实施例1中聚多巴胺修饰电极（a）和过氧化聚多巴胺修饰电极（b）在0.1mmol/L 氯霉素溶液中的方波伏安图。
图2为实施例1中过氧化聚多巴胺修饰电极测定不同浓度（a. 0.003, q. 1.1mmol/L）氯霉素溶液的方波伏安图；插图为还原电流与氯霉素浓度的关系曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例中所用试剂均为分析纯，所有溶液均用超纯水配制。
实施例1
1. 制备过氧化聚多巴胺修饰电极
多巴胺溶液的配制：将多巴胺溶解在pH值为8.5的10 mmol/L Tris-HCl中，其中，多巴胺的浓度为2 mg/mL。
聚多巴胺修饰电极的制备：将直径为3 mm的玻碳电极在抛光绒毛垫上依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉抛光，每一步均用超纯水洗净，然后依次在1:1 HNO3溶液、无水乙醇和超纯水中分别超声清洗3~5 min，再将电极置于0.5 mol/L硫酸溶液中，在-1.0~+1.0V电位区间内，以50 mV/s进行循环伏安扫描直到获得稳定的循环伏安响应为止，将电极取出用超纯水淋洗待用。将新鲜配制的多巴胺溶液置于小烧杯中，将上述预处理的玻碳电极置于多巴胺溶液中，室温条件下避光反应2.5 h，取出电极用超纯水充分淋洗。
过氧化聚多巴胺修饰电极的制备：将0.5 mol/L的NaOH溶液置于电解杯中，通氮除氧15 min后，以聚多巴胺修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极系统置于碱溶液中，分别通过电极线连接于电化学分析仪，在-1.5~1.0 V电压范围内，以50 mV/s的扫速循环伏安扫描6圈，将处理后的电极用超纯水充分淋洗。
为考察对聚多巴胺修饰电极进行过氧化处理的作用，使用过氧化处理前后的聚多巴胺修饰电极对0.1 mmol/L 氯霉素溶液（pH 7.0 PBS配制）进行测定，结果如图1所示。氯霉素在过氧化聚多巴胺修饰电极上的响应电流明显增强。这主要是由于过氧化处理使聚多巴胺所带的负电荷增加，与溶液中带正电荷的氯霉素分子之间的静电吸引作用力增强，氯霉素分子更容易到达电极表面进行电化学反应。
2. 检测方法和样品的测定
氯霉素的检测方法：用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）配制不同浓度的氯霉素溶液或稀释待测样品溶液。以过氧化聚多巴胺修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极系统置于通氮处理15 min的氯霉素溶液中，分别通过电极线连接于电化学分析仪，采用方波伏安法直接测定氯霉素在-0.65 V的还原电流。该还原电流与溶液中氯霉素的浓度成正比。根据电流与氯霉素浓度的对应关系，建立标准曲线，用于待测样品中氯霉素含量的测定。
选择性：以0.1 mmol/L氯霉素溶液为对照，考察相同浓度、10倍浓度的硫酸庆大霉素、青霉素钾、新霉素硫酸盐、盐酸金霉素、盐酸强力霉素、甲砜霉素对测定氯霉素的干扰情况。结果显示，加入上述干扰物质后氯霉素的响应电流无明显变化，表明本发明建立的氯霉素检测方法对氯霉素具有良好的选择性。
线性范围和检出限：使用方波伏安法考察不同浓度的氯霉素溶液在过氧化聚多巴胺修饰电极上的电流响应，如图2所示。随着氯霉素浓度的增加，在-0.65 V处的还原电流逐渐增大。还原电流（I，μA）与氯霉素的浓度（c，mmol/L）在3.0×10-6~1.1×10-3 mol/L范围内呈线性关系，线性回归方程为：I = 25.27c + 1.648（R = 0.993，n = 17）。基于三倍的信噪比（S/N = 3），得到该修饰电极对氯霉素的检出限为7.8×10-7 mol/L。
蜂蜜样品的检测：取0.2 g购于超市的蜂蜜，用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶解后作为待测样品溶液。将待测溶液置于电解杯中，使用过氧化聚多巴胺修饰电极进行方波伏安法测试，未出现氯霉素的特征还原峰，表明所测蜂蜜样品中不含有氯霉素。为进一步验证方法的准确性，进行了样品加标回收实验，所测蜂蜜中氯霉素的加标回收率在91.5%～108.6%之间，表明该修饰电极可对蜂蜜样品中的氯霉素残留进行分析。
实施例2
1. 制备过氧化聚多巴胺修饰电极
多巴胺溶液的配制：将多巴胺溶解在pH值为7.0的10 mmol/L Tris-HCl中，其中，多巴胺的浓度为4 mg/mL。
聚多巴胺修饰电极的制备：玻碳电极的预处理方法同实施例1。将新鲜配制的多巴胺溶液置于小烧杯中，将预处理的玻碳电极置于多巴胺溶液中，室温条件下避光反应20 h，取出电极用超纯水充分淋洗。
过氧化聚多巴胺修饰电极的制备：将0.5 mol/L的KOH溶液置于电解杯中，通氮除氧30 min后，以聚多巴胺修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极系统置于碱溶液中，分别通过电极线连接于电化学分析仪，在-1.5~1.0 V电压范围内，以50 mV/s的扫速循环伏安扫描8圈，将处理后的电极用超纯水充分淋洗。
2. 检测方法和样品的测定
氯霉素的检测方法和选择性实验同实施例1。
线性范围和检出限：标准曲线的制作方法同实施例1。还原电流（I，μA）与氯霉素的浓度（c，mmol/L）在1.0×10-6~1.7×10-3 mol/L范围内呈线性关系，线性回归方程为：I =41.70c + 2.134（R = 0.997，n = 12）。基于三倍的信噪比（S/N = 3），得到该修饰电极对氯霉素的检出限为3.5×10-7 mol/L。
牛奶样品的检测：取5 mL购于超市的牛奶，按照Jeon等（Biotin-avidin mediatedcompetitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues oftetracyclines in milk. Microchem. J., 2008, 88(1): 26-31.）报道的方法，利用McIlvaine-EDTA溶液和三氯乙酸去除牛奶样品中的蛋白质和脂肪。取出上清液，用磷酸盐配制成pH值为7.0的待测样品溶液。使用过氧化聚多巴胺修饰电极进行方波伏安法测试，未出现氯霉素的特征还原峰，表明所测牛奶样品中不含有氯霉素。为进一步验证方法的准确性，进行了样品加标回收实验，所测牛奶中氯霉素的加标回收率在83.4%～94.1%之间，表明该修饰电极可对牛奶等食品样品中的氯霉素残留进行分析。
Claims (9)
1.一种基于过氧化聚多巴胺修饰电极的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，使用过氧化聚多巴胺修饰电极，通过直接测定氯霉素在过氧化聚多巴胺修饰电极上的电化学响应信号得到待测溶液中氯霉素的浓度；
所述的过氧化聚多巴胺修饰电极通过包含如下步骤的方法制备得到：
S1.将玻碳电极置于多巴胺溶液中，在室温条件下避光反应，反应结束后，取出电极用超纯水充分淋洗，得聚多巴胺修饰电极；
S2. 将碱溶液置于电解杯中，通氮除氧后，以聚多巴胺修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极系统置于碱溶液中，分别通过电极线连接于电化学分析仪，用循环伏安法对聚多巴胺修饰电极进行电化学处理，即得过氧化聚多巴胺修饰电极。
2.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，S1.中所述的多巴胺溶液通过如下方法配置得到：将多巴胺溶解在pH值为8.2~8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液或pH值为6.8~7.4的磷酸盐缓冲溶液中。
3.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，所述的多巴胺溶液中多巴胺的浓度为1~4 mg/mL；三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液的浓度为5~10mmol/L。
4.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，S1.中所述的避光反应，其反应时间为2~20 h。
5.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，S2.中所述的碱溶液是浓度为0.1~0.5 mol/L的NaOH或KOH溶液。
6.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，S2.中所述的通氮除氧，其时间为10~30 min。
7.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，所述循环伏安法的具体条件为：在-1.5~1.0 V电压范围内，以50 mV/s的扫速循环伏安扫描5~8圈，将处理后的电极用超纯水充分淋洗。
8.根据权利要求1所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，检测氯霉素时，以过氧化聚多巴胺修饰电极为工作电极，采用方波伏安法直接测定氯霉素在-0.65 V的还原电流。
9.根据根据权利要求8所述的氯霉素电化学检测方法，其特征在于，检测氯霉素时，以浓度为0.05~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH值为6.8~7.4）为背景溶液，通氮除氧10~30min；当溶液中含有氯霉素时，静电吸引和氢键作用力使氯霉素分子到达过氧化聚多巴胺修饰电极的表面，从而可以在电极上获得氯霉素的还原电流，该还原电流与溶液中氯霉素的浓度成正比；根据电流与氯霉素浓度的对应关系，建立标准曲线，用于待测样品中氯霉素含量的测定。
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