CN106560703B - 用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法，具体制备方法如下：用多巴胺、苯胺、吡咯或者氨基苯酚作为功能单体，甲基丙烯酸甲酯、三羟甲基丙烷‑三(3‑吖丙啶基丙酸酯)或者戊二醛作为交联剂，偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰作为引发剂，三聚氰胺作为目标分子，Fe₃O₄磁性纳米颗粒作为信号增强剂，通过化学聚合法在电极表面制备对目标分子有响应的分子印迹传感器。通过本发明的方法制备的分子印迹传感器，用于快速有效地检测食品中的三聚氰胺含量，对作为目标分子的三聚氰胺具有快速特异地选择性响应，信号增强剂的存在使传感器的灵敏度显著增强。

Description

用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法

技术领域

本发明涉及领域，尤其涉及一种食品化工领域，具体涉及一种特别用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法。

背景技术

有关饲料和食品中三聚氰胺残留量的检测方法，目前仅局限于高效液相色谱-二极管阵列法、气质联用(GC-MS)法、超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱四极杆质谱联用、固相萃取与高效液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等，这些方法的通病是高昂的代价和复杂的预处理，并且具有操作繁琐、分析时间长、不适用于多个样品重复处理等逆势。

分子印迹技术有着灵敏，简便，廉价的检测分析优势，采用分子印迹技术在食物样本中分析三聚氰胺，可满足快速监测牛奶中微量三聚氰胺的市场需求。

分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)是指制备对某一或特定的目标分子(也称模版分子、印迹分子或烙印分子)具有专一性选择的聚合物的过程。它被形象地称为制造识别″分子钥匙″的″人工锁″的技术。它的分子识别原理是建立在目标分子的周围形成一种高交联的刚性的分子印迹聚合物，洗脱目标分子之后，在聚合物的网状结构中留下了刚性的空穴，具有和底物分子相匹配的形状和一定排列顺序的功能基团，因此对目标分子有极高的选择识别性。因为分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymer，MIP)具有相当高的亲和性，极强的抗干扰能力，很好的重复使用性，稳定的性能等优点，已经被广泛地应用于不同功能电化学传感器的制作。从而，具有操作方便，制备过程简单，检测灵敏快速等优点的分子印迹电化学传感器也慢慢发展了起来。

目前，已有研发人员尝试过使用分子印迹聚合物的电化学传感器来测定牛奶中的三聚氰胺，聚合膜是以三聚氰胺为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用流量分析系统测定牛奶中的三聚氰胺。但此方法的不足之处在于很难达到聚合膜的高交联度要求，使得实验不能快速有效地开展，以及检测灵敏度较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法，所制成的分子印迹传感器，其对三聚氰胺具有快速的响应性。

为实现上述目的，本发明提供一种用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法，用多巴胺、苯胺、吡咯或者氨基苯酚作为功能单体，甲基丙烯酸甲酯、三羟甲基丙烷-三(3-吖丙啶基丙酸酯)或者戊二醛作为交联剂，偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰作为引发剂，三聚氰胺作为目标分子，Fe₃O₄磁性纳米颗粒作为信号增强剂，通过化学聚合法在电极表面制备对目标分子有响应的分子印迹传感器。

具体制备分子印迹传感器的方法如下：

步骤1)Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备：将含有Fe²⁺与Fe³⁺的溶液混合均匀后倒入容器，氩气保护条件下滴加NaOH溶液，生成黑色胶状物质，将该黑色胶状物质加热并熟化，用去离子水和无水乙醇洗涤，再用乙醇分散为Fe₃O₄磁性纳米颗粒悬浊液，超声条件下加入3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，快速搅拌反应一段时间后，反应产物即为硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒，用乙醇分散备用；

步骤2)ITO电极的清洗：首先将裸ITO电极依次用NaOH的乙醇溶液、50％丙酮、去离子水分别超声清洗，置于空气中晾干；

步骤3)分子印迹传感器的制备：量取三聚氰胺甲醇的饱和溶液，再加入α-氨基苯酚，充分混合，用磁力搅拌器搅拌一段时间，待混合均匀后依次加入偶氮二异丁腈、乙醇分散的硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒和甲基丙烯酸甲酯，即得印迹聚合物，在超声波清洗机中超声一段时间，然后用移液枪移取超声过的印迹聚合物滴加到清洗过的ITO电极表面，放入烘箱加热一段时间并冷却后，将修饰过聚合物的ITO电极端浸泡到乙酸和甲醇的混合溶液中洗脱模板分子，即制备得分子印迹传感器。

进一步的，步骤1)中，以FeSO₄溶液、FeCl₃溶液及氢氧化纳，制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

进一步的，步骤1)中，分别配制浓度为0.5mol/L的FeSO₄和FeCl₃溶液，按Fe²⁺与Fe³⁺摩尔比1∶1.75将两种盐溶液混合均匀后倒入150mL的三口烧瓶中，边搅拌边通入氩气，同时滴加1mol/L的NaOH溶液，直至生成黑色胶状物质，继续反应35min后停止，将该黑色胶状物质加热至85℃熟化40min后，用去离子水和无水乙醇交替洗涤至中性，即得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒，将Fe₃O₄磁性纳米颗粒浸入四甲基氢氧化铵水溶液中，静置两小时，用水和乙醇交替洗涤3～5次，用乙醇分散为Fe₃O₄磁性纳米颗粒悬浮液。

进一步的，步骤1)中，将Fe₃O₄磁性纳米颗粒氨基硅烷化，具体地，移取20mL由乙醇分散的Fe₃O₄磁性纳米颗粒悬浮液，超声30min后，加入0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，快速搅拌反应7-10h，反应产物即为硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒，用乙醇清洗5次后，用乙醇分散备用。

进一步的，步骤2)中，裸ITO电极首先依次用NaOH的乙醇溶液、50％丙酮、去离子水分别超声清洗，每种溶液分别清洗15min，置于空气中晾干。

进一步的，步骤3)中，具体合成步骤为：量取三聚氰胺甲醇的饱和溶液2ml，再用分析天平称量0.0545g的α-氨基苯酚，在5ml圆底烧瓶中充分混合，用磁力搅拌器搅拌3h，待混合均匀后依次加入0.03g的偶氮二异丁腈、10uL的乙醇分散的Fe₃O₄磁性粒子和2ml的甲基丙烯酸甲酯，在超声波清洗机中超声30min，然后用移液枪移取超声过的混合物8uL修饰到ITO电极上，放入烘箱，温度设置为70℃，加热10h后冷却。

进一步的，冷却后，用1∶9的乙酸和甲醇的混合溶液浸泡ITO电极修饰端5h，接着用去离子水洗涤两次，即制备得分子印迹传感器。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、通过本发明的方法制备的分子印迹传感器，对作为目标分子的三聚氰胺具有快速特异地选择性响应，并且磁性粒子的存在显著使传感器的灵敏度增强，用于快速有效地检测食品中的三聚氰胺含量。

2、本发明的分子印迹传感器可用于牛奶中三聚氰胺的的测定，加标回收率为99.47％～103.0％。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为非磁修饰电极与磁性粒子修饰后电极在PBS溶液中的表征。

图2为非磁性修饰电极与磁性修饰电极的阻抗。

图3为分子印迹传感器的红外谱图。

图4为磁性分子印迹传感器洗脱前的扫描电镜图。

图5为磁性分子印迹传感器洗脱后的扫描电镜图。

图6为磁性分子印迹传感器和非磁性分子印迹传感器的比较图

图7为不同浓度的三聚氰胺的电极响应图。

图8为三聚氰胺印迹模板的合成路径及最终产品。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法，具体制备及分析方法如下：

1、制备磁性分子印迹电化学传感器所需的试剂，见下表1：

表1 试剂

2、制备磁性分子印迹电化学传感器所需的仪器，见下表2：

表2 仪器

3、制备分子印迹传感器的步骤如下：

3.1 Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备

分别配制浓度为0.5mol/L的FeSO₄和FeCl₃溶液，按Fe²⁺与Fe³⁺摩尔比1∶1.75将两种盐溶液混合均匀后倒入三口烧瓶，边搅拌边通入氩气，同时滴加氢氧化钠水溶液(1mol/L)，直至生成黑色胶状物质(pH值约为11)，继续反应35min后停止。将产品加热至85℃熟化40min后用去离子水和无水乙醇交替洗涤至中性，即得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒。将磁性Fe₃O₄纳米颗粒浸入四甲基氢氧化铵TMAOH(7％)水溶液中，静置两小时，用水和乙醇交替洗涤3～5次，用乙醇分散为Fe₃O₄磁性纳米颗粒悬浮液。

磁性Fe₃O₄纳米颗粒的氨基硅烷化：移取20mL乙醇分散磁性Fe₃O₄纳米颗粒悬浮液，超声30min后，加入0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液，快速搅拌反应7-10h，反应产物即为硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒，用乙醇清洗5次后，用乙醇分散备用。

3.2 分子印迹传感器的制备

1.ITO电极的清洗

裸ITO电极首先依次用NaOH的乙醇溶液、50％丙酮、去离子水分别超声清洗15min，置于空气中晾干，备用。

2.ITO分子印迹传感器的制备

物品准备：三聚氰胺甲醇的饱和溶液、α-氨基苯酚、甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈(AIBN)、乙醇分散的硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

合成步骤：量取三聚氰胺甲醇的饱和溶液2ml，再用分析天平称量0.0545g的α-氨基苯酚，在5ml圆底烧瓶中充分混合，用磁力搅拌器搅拌3h，待混合均匀后依次加入事先称量好的0.03g的偶氮二异丁腈、10uL的乙醇分散的硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒和2mL的甲基丙烯酸甲酯，超声30min后，用移液枪移取超声过的印迹聚合物8uL滴加到ITO电极上。放入烘箱，温度设置为70℃，加热10h，冷却后，用乙酸和甲醇的混合溶液浸泡ITO电极聚合物表面5h，洗脱出模板分子三聚氰胺，再用去离子水浸泡洗涤电极两次，制备得分子印迹传感器备用。在其它可替换的实施例中，也可以采用多巴胺、苯胺或者吡咯作为功能单体，三羟甲基丙烷-三(3-吖丙啶基丙酸酯)或者戊二醛作为交联剂，过氧化苯甲酰作为引发剂，来制备分子印迹传感器。

无磁分子印迹传感器的制备步骤同上，只不需要加入磁性粒子即可，最后对ITO电极表面不同状态进行标号，磁性分子印迹传感器，非磁性分子印迹传感器，分子印迹传感器，非分子印迹传感器，对其表征。

3.3 分子印迹传感器的表征方法

1.裸ITO电极的表征方法

(1)清洗过的裸ITO电极、铂电极、与饱和甘汞电极组成三电极体系，在0.01mol/L铁氰化钾与亚铁氰化钾混合溶液中扫描循环伏安图(CV)。在-1～1V扫描电位区间内，以0.1V/s的扫描速率扫描至循环伏安曲线稳定为止。

2.分子印迹传感器的表征方法

(1)在1mmol/L三聚氰胺的磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)中扫描传感器的方波伏安行为。SWV的扫描窗口是-0.6～1.2V，脉冲频率10Hz，电压增幅4mV。

(2)修饰不同膜的电极CV表征(包括裸ITO电极、非分子印迹传感器、分子印迹传感器电极洗脱前、分子印迹传感器电极洗脱后、磁性分子印迹传感器洗脱前、磁性分子印迹传感器洗脱后)在10mmol/L K₃[Fe(CN)₆]溶液(支持电解质为0.1mol/L PBS)中的循环伏安法测量。CV的扫描窗口是-0.5～0.8V，扫描速率0.1V/s，孵育时间2s。

(3)磁性分子印迹传感器电极在PBS溶液(pH＝7)中进行方波伏安法扫描，参数设置同上。然后依次滴加三聚氰胺甲醇的饱和溶液0.125ml，0.250ml，0.375ml，0.500ml，直至峰电流不再响应，观察其在对应电势下的响应峰的变化规律。非磁性分子印迹传感器的表征方法相同。

(4)电镜扫描处理

将电极作以下处理：在电极表面滴加聚合物，扫描电镜图；将模板分子洗脱后制备成分子印迹电极，扫描电镜图。

(5)红外分光光度法表征

将ITO分子膜电极在甲醇/乙酸(9∶1)溶液中，浸泡5h后，将洗脱前与洗脱后电极表面分别在红外光谱仪器上进行表征，观察峰的变化，跟踪模板分子是否已洗涤干净，

3.4分子印迹传感器的应用

选择牛奶作为实验检测的实际样品，取采购的牛奶样品10mL，并加入10mL甲醇溶液。将混合溶液在15,000rpm下离心，将上层清液过滤后，得到脱蛋白处理的样品，可消除溶液中蛋白质的影响。

4分子印迹电化学传感器的表征结果

4.1非磁修饰电极与磁性粒子修饰后电极在磷酸盐缓冲溶液中的表征

参见图1中所示，图中a磁性分子印迹传感器，b非磁性分子印迹传感器，c磁性未洗脱电极，d非磁性未洗脱电极。可以看出，ITO分子印迹电极表面峰电流(a)比非磁性印迹印迹电极(b)高2mA，而未洗脱磁性电极(c)表面峰电流也比未洗脱非磁性电极高许多。这是由于纳米磁性粒子的化学稳定性和优良的导电性提高电极表面的电子传递能力，扩大了电极表面的电流响应信号。

4.2非磁性修饰电极与磁性修饰电极的阻抗

参见图2所示，图中a表示磁性分子印迹传感器；b表示非磁性分子印迹传感器；c磁性未洗脱电极，d非磁性未洗脱电极。磁性未洗脱分子膜电极比非磁性未洗脱分子膜电极阻抗小360Ohm，而洗脱后的磁性分子印迹膜电极比洗脱后的非磁性分子印迹膜电极的阻抗要小250Ohm，这同样也是由于纳米磁性粒子的化学稳定性和优良的导电性减小了电极表面电子传递的阻力所引起的。

4.3分子印迹传感器的红外谱图

将分子印迹传感器浸泡在体积比为9∶1的甲醇/乙酸洗涤聚合物的溶液中洗涤，可以发现洗脱后，传感器对三聚氰胺的识别效果越好。为探究是否洗脱对目标分子的影响，利用红外光谱仪对洗脱液进行测定。查询数据得，三聚氰胺在1651～1551cm^-1处有明显N-H弯曲振动特征峰。为了更好地作出对比，同时对四种修饰电极表面进行红外表征，可以发现磁性未洗脱分子膜电极表面的红外光谱图在1651～1551cm^-1处有明显的中强特征峰。而洗脱后的的红外谱图有了明显的变化。而非磁性分子膜电极在洗脱前和洗脱后的红外谱图对比中，1651～1551cm^-1处也有较为明显的变化。说明未洗脱ITO分子膜电极表面确实含有聚合的三聚氰胺，而洗脱后的电极表面，模板分子则基本被洗脱完全，分子印迹电极制备成功。

4.4传感器洗脱前后的扫描电镜图(SEM)

如图4和图5，采用扫描电镜对磁性粒子修饰ITO传感器洗脱前后电极的表面形貌进行表征。由图4可见，纳米磁性粒子已经均匀地分散在ITO电极表面，形成了很好的磁性粒子修饰电极。图5则为洗脱后的电极表面状态，由于模板分子三聚氰胺的洗脱ITO电极表面形成很多与三聚氰胺分子形状和结构相匹配的空穴。也是由于含有这些孔穴的聚合物膜的存在，而使得电极表面变得非常粗糙。因为这些空穴对模板分子的形状与结构相匹配，所以分子印迹传感器针对待测样品具有一定的选择性。

4.5分子印迹传感器的电化学响应以及标准曲线

由于膜中的印迹孔穴可以作为电子传质的通道，以三聚氰胺为探针，根据其电流的大小可以看出印迹电极对三聚氰胺的响应。图6是磁性传感器(a)和非磁性传感器(b)对0.1μg/mL三聚氰胺溶液的SWV响应图，从图中可以明显的看出，磁性传感器对三聚氰胺的响应信号是磁性传感器的4倍。由此可见，Fe₃O₄磁性颗粒的存在增强了印迹膜对三聚氰胺分子的检测电流。故选用磁性分子印迹传感器测定标准曲线和样品加标回收率。

图7是不同浓度的三聚氰胺的电极响应图。由图7可看出，低浓度三聚氰胺的电极表面的电流很低，接近于-25uA，但随着滴加三聚氰胺的浓度的增大，其电极响应也在变大，但到达g点时不再响应，其原因是空穴被填满。当然a点是刚开始的响应点。于是我们可以得出结论，磁性分子印迹电极的检测下限为a，上限为g。对应的数值分别为0.15ug/mL和1.67ug/mL，用此分子印迹传感器对三聚氰氨进行线性表征，三聚氰胺的浓度在0.15～1.67μg/mL范围内呈线性关系，线性方程i(μA)＝0.06249C(μg/mL)-0.00827，检测限为0.05μg/mL。

5分子印迹电化学传感器选择性

为探究分子印迹传感器对三聚氰胺分子的选择性，选取结构相似的苯代三聚氰胺与水解产物三聚氰酸、三聚氰酸二酰胺这三种干扰物，用分子印迹传感器分别对0.50μg/mL干扰物进行方波伏安扫描。扫描发现，该传感器对苯代三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸二酰胺的电化学响应都比较低，接近于零。这是由于分子印迹膜内形成了具有识别功能的空穴，该空穴的结构与功能集团排列只与三聚氰胺分子结构相匹配，使得其他干扰物难以进入该空穴引起电化学响应。同时，在0.50μg/mL三聚氰胺溶液中加入大量Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、NH⁴⁺、Cl^-、SO₄ ^2-等无机离子，对峰电流高度不产生影响，即对测定结果不产生干扰作用。

5.1分析应用

将本方法应用于牛奶中三聚氰胺含量的测定。采用加标检测方法，在牛奶样品中加入不同浓度的三聚氰胺溶液，在优化实验条件下用传感器对其进行检测。结果见表3，因为牛奶中含有三聚氰胺，所以回收率为99.47％～103.0％。此结果说明该传感器在很强的干扰下也有很好的回收率和准确性，能用于实际样品中三聚氰胺的检测。

表3

5.2分子印迹传感器的重现性与稳定性

重现性和稳定性也是考察传感器的重要指标之一。采用同一支印迹电极对1.0μg/mL三聚氰胺溶液连续进行6次平行测定，相对标准偏差为1.3％。在室温条件下保存一周，传感器的响应值为初次的96.7％，说明电极具有良好的稳定性和重复性，这主要归因于印迹膜中α-氨基苯酚稳定的六元环的刚性结构。其分子印迹膜的合成路径及最终产品见图8。

以上所述的具体实例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.用于制备检测三聚氰胺的分子印迹传感器的方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1)Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备：分别配制浓度为0.5mol/L的FeSO₄和FeCl₃溶液，按Fe²⁺与Fe³⁺摩尔比1∶1.75将两种盐溶液混合均匀后倒入150mL的三口烧瓶中，边搅拌边通入氩气，同时滴加1mol/L的NaOH溶液，直至生成黑色胶状物质，继续反应35min后停止，将该黑色胶状物质加热至85℃熟化40min后，用去离子水和无水乙醇交替洗涤至中性，即得到Fe₃O₄磁性纳米颗粒，将Fe₃O₄磁性纳米颗粒浸入四甲基氢氧化铵水溶液中，静置两小时，用水和乙醇交替洗涤3～5次，用乙醇分散为Fe₃O₄磁性纳米颗粒悬浮液；移取20mL由乙醇分散的Fe₃O₄磁性纳米颗粒悬浮液，超声30min后，加入0.3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，快速搅拌反应7-10h，反应产物即为硅烷化Fe₃O₄磁性纳米颗粒，用乙醇清洗5次后，用乙醇分散备用；

步骤2)ITO电极的清洗：裸ITO电极首先依次用NaOH的乙醇溶液、50％丙酮、去离子水分别超声清洗15min，置于空气中晾干；

步骤3)分子印迹传感器的制备：量取三聚氰胺甲醇的饱和溶液2ml，再用分析天平称量0.0545g的α-氨基苯酚，在5ml圆底烧瓶中充分混合，用磁力搅拌器搅拌3h，待混合均匀后依次加入0.03g的偶氮二异丁腈、10μL的乙醇分散的Fe₃O₄磁性粒子和2ml的甲基丙烯酸甲酯，在超声波清洗机中超声30min，然后用移液枪移取超声过的混合物8μL修饰到ITO电极上，放入烘箱，温度设置为70℃，加热10h后冷却；冷却后，用1∶9的乙酸和甲醇的混合溶液浸泡ITO电极修饰端5h，接着用去离子水洗涤两次，即制备得到分子印迹传感器。