CN110632160B - 一种三维细胞纸芯片传感器及在细菌脂多糖检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维细胞纸芯片传感器及在细菌脂多糖检测中的应用，属于分析检测技术领域。本发明通过将喷蜡打印技术、丝网印刷技术、细胞三维培养技术和电化学传感技术相结合构建一种新型三维细胞纸芯片传感器，同时具备纸芯片的低成本和便携式、细胞三维培养的真实性、电化学分析的高灵敏性和快速性，能准确地进行低含量脂多糖的检测。本发明还公开了该三维细胞纸芯片传感器的制备方法以及应用，可实现对食源性致病菌的间接检测及毒力判定，具有灵敏、高效、微型化等优点，并且价格低廉，适用于已知致病菌的检测及未知致病菌的毒力判定。

Description

一种三维细胞纸芯片传感器及在细菌脂多糖检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种三维细胞纸芯片传感器及在细菌脂多糖检测中的应用，属于分析检测技术领域。
背景技术
革兰氏阴性菌作为最常见的病原菌，已成为严重威胁食品安全和公众健康的一大威胁。虽然高温高压可以杀死细菌，但细菌内毒素(脂多糖，LPS)不会随着细菌的死亡而消失或被破坏。脂多糖由内至外由三个部分共价连接：疏水的类脂A、核心寡糖和亲水的O-抗原。其毒性成分主要为类脂A。脂多糖引起炎症反应，可导致许多感染或致命疾病。因此，对脂多糖生物活性的早期预警和检测与细菌本身的鉴定同样重要。不仅如此，位于革兰氏阴性菌外表面膜上的脂多糖被认为是检测细菌污染的最佳生物标志物。通过对脂多糖的高灵敏检测，可实现对革兰氏阴性菌的间接检测。
脂多糖通常使用经国际药典委员会(FDA，1987)批准和验证的鲎细胞溶解物(LAL)进行检测。但由于鲎资源的匮乏，科学家们相继研究开发了ELISA法、血清学检测法、银染检测法检测脂多糖。近年，更有采用基于磁纳米粒子转染细胞传感的电化学方法实现对脂多糖的定量检测。虽然上述新方法快速、精确，但其仅限于实验室检测，并且二维细胞培养技术无法模拟真实体内环境。
在二维的玻璃或聚苯乙烯底物上生长的真核细胞并不能准确地反映出自然条件下组织中细胞地生长及与细胞外基质地准确相互作用。三维培养是一种可以使细胞在体外条件下进行三维生长的培养方法，为细胞提供更加接近体内生存条件的微环境，能够更好地模拟生理状态，提高细胞的粘附性，保证细胞的活性。三维培养可分为有支架技术和无支架技术两种。细胞支架技术又可根据使用的支架材料的不同分为用固体支架、水凝胶和其它材料。其中水凝胶技术是应用的最广泛的一种。水凝胶具有高保水性的相互连接的孔组成，其中包含了各种细胞生长所需的营养素和气体。
纸微流芯片，简称纸芯片，是在纸上(如滤纸、层析纸及硝酸纤维素膜等)加工出具有一定结构的亲/疏水微细通道网络及相关分析器件，构建“纸上微型实验室”，也称微流控纸分析器件，具有成本低、加工简易、使用和携带方便等优点。将近十年来，以纸材料作为细胞三维培养的支架成为研究热点，为了便于监测培养于纸材料中的细胞对待测物刺激的反应，我们制备了一种细胞纸芯片电化学分析器件。
电化学传感技术作为一种新兴的快速检测方法，已受到广大研究者的关注。它以电化学手段作为信号传导和转换方法，通过将传感元件识别的信号转化为电化学工作站可以识别的电信号，进而达到被检物的快速被识别和检测的目的。电化学传感法具有分析时间短、检测精度高、操作容易等优点。在构建细胞传感器的过程中引进电化学技术将大幅提高细胞传感器的灵敏度和精确度。目前检测食源性细菌的电化学传感器大多数采用商品化常规电极作为传感换能元件(如金电极、玻碳电极等)。商品化常规电极价格昂贵，修饰后仍需反复使用。电极清洗活化复杂耗时，若再生不好对检测结果的准确性有影响。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，将细胞三维培养技术、纸芯片技术和电化学传感技术相结合构建一种新型三维细胞纸芯片传感器。本发明提供了一种三维细胞纸芯片传感器的制备方法，优化确定该传感器的制备条件，并在革兰氏阴性菌脂多糖的检测及毒力判定中的应用。具体是基于在纸芯片中三维培养的Raw264.7细胞经脂多糖刺激后产生的NO在电极表面直接被氧化，从而产生电信号改变的特点，构建用于革兰氏阴性菌脂多糖的检测及毒力判定的三维细胞纸芯片传感器及其制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于革兰氏阴性菌脂多糖的检测及毒力判定的三维细胞纸芯片，包括参比电极、对比电极、工作电极；所述工作电极上功能化修饰聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion，且三维细胞培养系统固定在所得的功能化修饰纸芯片工作电极上；所述三维细胞培养系统是含有密度为103-107个/mL细胞的三维水凝胶-细胞复合物；
在本发明的一种实施方式中，纸芯片是利用如下方法制备得到的：
(1)利用CorelDRAW软件设计如图1所示的亲/疏水性区域及电极图案；
(2)利用蜡打印机将步骤(1)中设计的疏水性区域在双圈滤纸上印刷，制备纸芯片亲/疏水性区域；
(3)利用精密网版印刷机将步骤(1)中设计的电极图案印刷到步骤(2)中所得纸上，晾干后，切割，即得纸芯片工作电极。
所述亲/疏水性区域的制备，在本发明的一种实施方式中，是将印有蜡图案的双圈滤纸置于氮气保护的烘箱内，在130℃下加热150秒，使蜡图案融化并浸透纸的整个厚度，形成纸芯片的内部蜡疏水墙。
所述电极图案的印刷，在本发明的一种实施方式中，是利用精密网版印刷机将导电碳浆油墨印刷到芯片工作电极和对电极的位置，将银-氯化银浆印刷到芯片参比电极的位置。
所述功能化修饰聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion，在本发明的一种实施方式中，是翻转纸芯片，在纸芯片工作电极上滴加40μL 0.25～1mol/L吡咯单体、1mg/mL氧化石墨烯与0.05～0.4mol/L氯化钾混合溶液，待纸芯片亲水区完全吸收溶液后，工作电极、参比电极和对电极形成电回路，采用时间电流法，电压为1V，时间为40s，完成电聚合。电聚合后用超纯水清洗氮气吹干，得到聚吡咯/氧化石墨烯修饰的纸芯片。再滴加5μL 0.5wt％Nafion溶液于工作电极，室温下晾干，得到聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion修饰的纸芯片。
所述细胞，在本发明的一种实施方式中，是小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7。
所述三维细胞培养系统，在本发明的一种实施方式中，具体是，将5μL密度为107个/mL细胞与5μL海藻酸钠溶液混匀，滴加于工作电极表面，再滴加100mM CaCl2/DMEM溶液，钙浴1min，形成三维水凝胶-细胞复合物，待细胞固定后用PBS洗去未固定上的细胞，即得三维细胞培养系统。
所述海藻酸钠溶液，在本发明的一种实施方式中，是将1％海藻酸钠溶解于DMEM中，混合液超声处理5min，得到均匀的分散溶液，静置待用。
本发明的第二个目的是提供一种所述方法得到的用于革兰氏阴性菌脂多糖的检测及毒力判定的三维细胞纸芯片传感器。
在本发明的一种实施方式中，所述传感器还包括硬质夹具外壳，所述硬质夹具是利用CorelDRAW软件设计硬质夹具，采用聚甲基丙烯酸甲酯为原料，利用数控机床将步骤(4)中设计的硬质夹具加工成型。
在本发明的一种实施方式中，用硬质电极夹具夹好检测芯片，连接电化学工作站，即得到三维细胞纸芯片传感器。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述三维细胞纸芯片传感器的应用。
所述应用，是用来检测革兰氏阴性菌脂多糖及对其毒力进行判定。
所述应用，在本发明的一种实施方式中，包括如下步骤：
(1)将已知浓度的脂多糖标准品分别滴加到三维细胞纸芯片传感器的工作区域后孵育，孵育后细胞产生的NO在电极表面直接被氧化，所产生的氧化电流与NO浓度成比例关系，并采用差分脉冲伏安法测定电流，利用脂多糖浓度与电流值构建线性模型，得到脂多糖标准品浓度对数值与电流值的标准曲线；
(2)待测样测试：处理菌株，提取得到脂多糖样品，然后滴加到三维细胞纸芯片传感器的三维细胞培养系统中，采用差分脉冲伏安法(DPV)测得电流值，再根据步骤(1)得到的标准曲线，定量菌株脂多糖浓度。测得脂多糖浓度越高，则其毒力越强。
在本发明的一种实施方式中，对于已知菌株，测定其脂多糖含量及毒力判定：将提取的脂多糖滴加到三维细胞纸芯片传感器的工作区域后孵育，采用差分脉冲伏安法(DPV)测定电流，再根据步骤(1)得到的标准曲线，定量已知菌株脂多糖浓度。测得脂多糖浓度越高，则其毒力越强；对于未知菌株，对其脂多糖毒力判定：将提取的脂多糖滴加到三维细胞纸芯片传感器的工作区域后孵育，采用差分脉冲伏安法(DPV)测定电流。相同菌量提取的脂多糖测得电流越大，则其毒力越强。这是由于不同种类革兰氏阴性菌的脂多糖结构不同，毒力大小不同，刺激Raw264.7细胞产生NO的量不同，电流的大小也不同。
所述电流值，在本发明的一种实施方式中，是在三维细胞纸芯片传感器工作区域滴加PBS溶液，设定适宜的扫描参数，进行差分脉冲伏安法(DPV)测定。
所述PBS溶液，在本发明的一种实施方式中，是含135mM NaCl，4.7mM KCl，10mMNa2HPO4，2mM NaH2PO4，pH值为7.4的缓冲溶液。
所述差分脉冲伏安法(DPV)的测试条件，在本发明的一种实施方式中，是：电压扫描范围为-0.2V到0.5V，脉冲幅度为50mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电势增量为4mV，所有测试均在室温下进行。
所述脂多糖标准品，在本发明的一种实施方式中，可以是肠炎沙门氏菌(L7770Sigma-Aldrich)来源脂多糖。
以脂多糖标准品浓度为横坐标，峰电流为纵坐标，绘制峰电流与标准品浓度之间的关系曲线。实验结果显示随着脂多糖标准品浓度的增加，其峰电流值升高。
所述标准曲线，在本发明的一种实施方式中，是：(1)肠炎沙门氏菌(L7770Sigma-Aldrich)来源脂多糖标准品浓度在1×10-2～3ng/mL范围内具有良好的线性相关，y＝0.55925lgx+43.64256，线性相关系数R2＝0.9973；(2)肠炎沙门氏菌(L7770Sigma-Aldrich)来源脂多糖标准品浓度在1×101～1×104ng/mL范围内具有良好的线性相关，y＝0.25755lgx+44.20041，线性相关系数R2＝0.9940。所述待测样品中肠炎沙门氏菌(L7770Sigma-Aldrich)来源脂多糖浓度的最低检测限可达到3.5×10-3ng/mL(S/N＝3)。
虽然所有革兰氏阴性菌细胞壁均有毒力因子脂多糖，但是脂多糖的结构是不同的，而脂多糖的毒力大小又是由脂多糖结构决定的。脂多糖中类脂A的酰化状态影响了脂多糖被Raw264.7细胞表面TLR4-CD14-MD2受体复合物的识别，进而影响由信号转导产生的NO量。为验证三维细胞纸芯片传感器判定毒力大小的能力，提取了肠炎沙门氏菌ATCC14028、阪崎肠杆菌ATCC29544、福氏志贺氏菌CMCC(B)51572、大肠杆菌O157：H7ATCC700728、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104这几种已知类脂A结构的脂多糖刺激传感细胞。结果显示，在相同浓度下，肠炎沙门氏菌ATCC14028、阪崎肠杆菌ATCC29544、福氏志贺氏菌CMCC(B)51572、大肠杆菌O157：H7ATCC700728脂多糖测得电流均大于铜绿假单胞菌脂多糖，即铜绿假单胞菌脂多糖毒力最弱。这与肠杆菌科中大多数细菌脂多糖的类脂A含有六个酰基链，铜绿假单胞菌脂多糖的类脂A含有五个酰基链；而六酰化类脂A表现出最强的免疫活性，五酰化类脂A活性要低100倍，四酰化类脂A则无活性的结果相一致。以上结果证明本发明可用于未知致病菌脂多糖毒力大小的判定。以上结果证明本发明可用于未知致病菌脂多糖毒力大小的判定。相同菌量提取的脂多糖测得电流越大，则其毒力越强。
本发明的有益效果：
(1)本发明以纸材料和水凝胶共同作为支架，构建三维细胞培养系统提高了细胞的粘附力和生命力，同时能模拟体内环境，真实反映细胞对脂多糖的响应过程，实现高灵敏、低成本、便携式、真实的革兰氏阴性菌脂多糖检测，浓度在1×10-2～3ng/mL范围内具有良好的线性相关，y＝0.55925lgx+43.64256，线性相关系数R2＝0.9973；浓度在1×101～1×104ng/mL范围内具有良好的线性相关，y＝0.25755lgx+44.20041，线性相关系数R2＝0.9940。且待测样品浓度的最低检测限可达到3.5×10-3ng/mL(S/N＝3)。
(2)Raw264.7细胞经脂多糖刺激后产生的NO在生物相容性和导电性较好的聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion修饰电极表面直接被氧化，产生电信号的改变。因此采用Raw264.7细胞作为识别元件所构建的传感器灵敏度高，可以定量检测已知菌的脂多糖含量。同时，Raw264.7细胞作为一种免疫细胞，表面TLR4-CD14-MD2受体复合物可特异性识别不同结构的脂多糖，发生的免疫反应强度不同。因此采用Raw264.7细胞作为识别元件所构建的传感器可用于未知菌脂多糖毒力大小的判定。
(4)利用纸芯片作为传感平台构建电化学细胞传感器，与使用常规电极的电化学细胞传感器相比，具有一次性、低成本等优点，推进便携型微型化传感器的发展。
(5)硬质夹具可逆连接纸芯片，可重复使用，操作简单。
附图说明
图1为纸芯片分析器件；
图2为三维细胞纸芯片传感器构建流程图；
图3为纸芯片传感器电极修饰表征(A)循环伏安曲线(CV)和(B)差分脉冲伏安曲线(DPV)；其中(a)裸电极，(b)聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion纸芯片电极，(c)聚吡咯/氧化石墨烯/Nafion/细胞/水凝胶纸芯片电极(细胞浓度为2×102个/mL)；
图4为纸芯片传感器细胞浓度优化；(A)差分脉冲伏安曲线电流，其中(a)1×102个/mL；(b)1×103个/mL；(c)1×104个/mL；(d)1×105个/mL；(e)1×106个/mL；(f)1×107个/mL；(g)1×108个/mL；(B)细胞数量对数线性图；
图5为脂多糖的检测；(A)不同浓度脂多糖溶液的差分脉冲伏安曲线，其中(a)1104ng/mL，(b)103ng/mL，(c)102ng/mL，(d)50ng/mL，(e)10ng/mL，(f)4ng/mL，(g)3ng/mL，(h)2ng/mL，(i)1ng/mL，(j)0.1ng/mL，(k)0.01ng/mL；(B)标准曲线；
图6脂多糖的SDS-PAGE分析；其中1:大肠杆菌O157:H7 ATCC700728；2:肠炎沙门氏菌源的脂多糖标准品(L7770 Sigma-Aldrich标准品)；3:肠炎沙门氏菌ATCC14028；4:铜绿假单胞菌CMCC(B)10104；5:阪崎肠杆菌ATCC29544；6:福氏志贺氏菌CMCC(B)51572；
图7为不同细菌种类来源的脂多糖刺激传感细胞的电流；其中1:大肠杆菌O157:H7ATCC700728；2：阪崎肠杆菌ATCC29544；3：肠炎沙门氏菌ATCC14028；4：福氏志贺氏菌CMCC(B)51572；5：铜绿假单胞菌CMCC(B)10104。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
下述实施例中涉及的肠炎沙门氏菌来源脂多糖(L7770 Sigma-Aldrich)均购买自Sigma-Aldrich公司，货号L7770。
实施例1：三维细胞纸芯片传感器的构建
三维细胞纸芯片传感器的构建流程如图2所示，是先制备纸芯片分析器件，翻转纸芯片，将吡咯/氧化石墨烯分散液滴加到电极上，翻转纸芯片，电聚合聚吡咯/氧化石墨烯，滴加Nafion修饰工作电极，翻转纸芯片，将三维细胞培养系统加载到工作电极，翻转纸芯片，将纸芯片与导电夹套组合，连接电化学工作站，构建三维细胞纸芯片传感器。
1.制备纸芯片分析器件
利用CorelDRAW软件设计亲/疏水性区域及电极图案；利用蜡打印机在双圈滤纸上印刷疏水性区域，并置于氮气保护的烘箱内，在130℃下加热150秒，使蜡图案融化并浸透纸的整个厚度，形成纸芯片的内部蜡疏水墙；利用精密网版印刷机将导电碳浆油墨印刷到芯片工作电极和对电极的位置，将银-氯化银浆印刷到芯片参比电极的位置；利用CorelDRAW软件设计硬质夹具；采用聚甲基丙烯酸甲酯为原料，利用数控机床将硬质夹具加工成型。制备得到如图1所示的纸芯片分析器件。
2.聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion修饰纸芯片电极
在纸芯片工作电极上滴加40μL 0.25～1mol/L吡咯单体/氧化石墨烯与0.05～0.4mol/L氯化钾混合溶液，待纸芯片亲水区完全吸收溶液后，工作电极、参比电极和对电极形成电回路，采用电流时间法，初始电位为1.0V，运行时间为150s，完成电聚合。电聚合后用超纯水清洗氮气吹干，再滴加Nafion溶液于工作电极，得到聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion修饰的纸芯片。
3.制备三维细胞培养系统
将1％海藻酸钠溶解于DMEM中，混合液超声处理5min，得到均匀的海藻酸钠溶液，静置待用。将5μL密度为107个/mL细胞与5μL海藻酸钠溶液混匀，滴加于工作电极表面，再滴加100mM CaCl2/DMEM溶液，钙浴1min，形成三维水凝胶-细胞复合物，待细胞固定后用PBS洗去未固定上的细胞，即得三维细胞培养系统。
4.制备三维细胞纸芯片传感器
用硬质电极夹具夹好检测芯片，连接电化学工作站，即得到三维细胞纸芯片传感器。
实施例2：三维细胞纸芯片传感器的表征
对构建的三维细胞纸芯片传感器进行电化学表征。循环伏安法的测试条件是：电压扫描范围为-0.2V到0.6V，扫描速率为100mV/s，采样间隔为1mV。差分脉冲伏安法的测试条件是：电压扫描范围为-0.2V到0.6V，脉冲幅度为50mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电势增量为4mV。Fe(CN)6 3-/4-电解液浓度为2.5mmol/L，所有测试均在室温下进行。
在图3A中，曲线a为裸电极在Fe(CN)6 3-/4-溶液中扫描得到可逆型氧化还原峰，此时的峰电流大小为11.12μA(由图3B DPV图中a曲线计算得)；曲线b为聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion修饰电极的可逆型氧化还原峰，此时峰电流值为42.82μA(由图3B DPV图中b曲线计算得)，说明聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion膜导电性良好；当细胞/水凝胶固定于工作电极表面后，此时氧化还原峰值明显降低(曲线c)，峰电流大小为18.87μA(由图3B DPV图中c曲线计算得)，这种现象可能是细胞和凝胶都是生物大分子，具有一定的绝缘性，在一定程度上阻碍了电极表面的电子传递，因此也证明了三维细胞培养系统在电极表面的成功固定。
为保证后续实验的有效性，采用差分脉冲伏安法对三维细胞纸芯片传感器所需细胞数量进行优化。结果如图4A所示，随细胞浓度的增加，电流逐渐降低并趋于稳定。在1×103个/mL～1×107个/mL的浓度范围内，细胞浓度的对数值与电流值呈良好的线性关系，线性方程为y＝-1.23064lgx+20.87759(x为细胞浓度)，R2＝0.99923(图4B)。当细胞浓度超过1×107个/mL时，该线性方程不再适用。因此选择浓度为1×103个/mL～1×107个/mL的细胞进行后续实验。
实施例3：三维细胞纸芯片传感器的应用：
1.脂多糖的检测
用PBS溶解肠炎沙门氏菌来源的脂多糖标准品(L7770Sigma-Aldrich)，配置1mg/mL的储备液。用DMEM培养液稀释成浓度分别为104ng/mL，103ng/mL，102ng/mL，50ng/mL，10ng/mL，4ng/mL，3ng/mL，2ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL的脂多糖溶液。将脂多糖溶液滴加到三维细胞纸芯片传感器的工作区域，刺激细胞，待检测。
2.分析条件与方法
电化学检测参数：采用差分脉冲伏安法，电压扫描范围为-0.2V～0.5V，脉冲幅度为50mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电势增量为4mV，在反应介质液为PBS溶液(135mM NaCl，4.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，pH值为7.4的缓冲溶液)中进行测量。所有的测量均在室温下进行。
以脂多糖浓度的对数值和电流值作图，即得三维细胞纸芯片传感器检测脂多糖的标准曲线。
3.检测结果与毒力判定
实验结果表明随着肠炎沙门氏菌来源脂多糖(L7770Sigma-Aldrich)浓度的增加，其峰电流值增大(图5A)。由图5B可知：(1)肠炎沙门氏菌来源脂多糖标准品(L7770Sigma-Aldrich)浓度在1×10-2～3ng/mL范围内具有良好的线性相关，y＝0.55925lgx+43.64256(x为脂多糖浓度)，线性相关系数R2＝0.9973；(2)肠炎沙门氏菌来源脂多糖标准品(L7770Sigma-Aldrich)浓度在1×101～1×104ng/mL范围内具有良好的线性相关，y＝0.25755lgx+44.20041(x为脂多糖浓度)，线性相关系数R2＝0.9940。其中待测样品中肠炎沙门氏菌来源脂多糖(L7770Sigma-Aldrich)浓度的最低检测限可达到3.5×10-3ng/mL(S/N＝3)。
对于已知菌株，采用差分脉冲伏安法(DPV)测定电流，再根据标准曲线，定量已知菌株脂多糖浓度。测得脂多糖浓度越高，则其毒力越强。
采用经典的热酚水法提取脂多糖(具体方法参照Leong D，Diaz R，Milner K，etal.Some structural and biological properties of Brucella endotoxin[J].Infection and immunity，1970，1(2):174-182.)。脂多糖的SDS-PAGE分析结果如图6所示。虽然所有革兰氏阴性菌细胞壁均有毒力因子脂多糖，但是脂多糖的结构是不同的，而脂多糖的毒力大小又是由脂多糖结构决定的。脂多糖中类脂A的酰化状态影响了脂多糖被Raw264.7细胞表面TLR4-CD14-MD2受体复合物的识别，进而影响由信号转导产生的NO量。为验证三维细胞纸芯片传感器判定毒力大小的能力，提取了肠炎沙门氏菌ATCC14028、阪崎肠杆菌ATCC29544、福氏志贺氏菌CMCC(B)51572、大肠杆菌O157：H7ATCC700728(NCTC12900)、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104这几种已知类脂A结构的脂多糖刺激传感细胞。结果如图7所示，在相同浓度下，肠炎沙门氏菌ATCC14028、阪崎肠杆菌ATCC29544、福氏志贺氏菌CMCC(B)51572、大肠杆菌O157：H7ATCC700728脂多糖测得电流均大于铜绿假单胞菌CMCC(B)10104脂多糖，即铜绿假单胞菌CMCC(B)10104脂多糖毒力最弱。这与肠杆菌科中大多数细菌脂多糖的类脂A含有六个酰基链，铜绿假单胞菌脂多糖的类脂A含有五个酰基链；而六酰化类脂A表现出最强的免疫活性，五酰化类脂A活性要低100倍，四酰化类脂A则无活性的结果相一致。以上结果证明本发明可用于未知致病菌脂多糖毒力大小的判定。以上结果证明本发明可用于未知致病菌脂多糖毒力大小的判定。相同菌量提取的脂多糖测得电流越大，则其毒力越强。
实施例4：准确性评价
分别将水蜜桃汁和橙汁离心取上清液，稀释10倍，高压灭菌处理后用于分析。向两种样品中分别直接添加浓度为3.5×10-3ng/mL，7×10-3ng/mL，3.5×10-2ng/mL的肠炎沙门氏菌来源脂多糖标准品(L7770Sigma-Aldrich)，用实施例1-2中的方法对样品进行检测。分析样品获得的结果如表1所示，所有测试样品的回收率非常高，且RSD小于2.65％，可见，该方法具有较高的准确性。
表1样品中脂多糖的回收率和相对标准偏差(n＝5)
Figure BDA0002210940770000091
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种三维细胞纸芯片，其特征在于，包括参比电极、对比电极、工作电极；所述工作电极上功能化修饰聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion，且三维细胞培养系统固定在所得的功能化修饰纸芯片工作电极上；所述三维细胞培养系统是含有密度为103-107个/mL细胞的三维水凝胶-细胞复合物；其中，
所述功能化修饰聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion是在纸芯片工作电极上滴加吡咯单体、氧化石墨烯与氯化钾混合溶液，待纸芯片亲水区完全吸收溶液后，利用工作电极、参比电极和对电极形成电回路，进行电聚合，再滴加Nafion溶液于工作电极，实现聚吡咯/氧化石墨烯-Nafion修饰；
所述三维细胞培养系统具体是将密度为103-107个/mL细胞与海藻酸钠溶液混匀，滴加于工作电极表面，再滴加CaCl2/DMEM溶液，钙浴后形成三维水凝胶-细胞复合物，待细胞固定后除去未固定上的细胞，即得三维细胞培养系统；所述细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7。
2.根据权利要求1所述的三维细胞纸芯片，其特征在于，所述海藻酸钠溶液是将海藻酸钠溶解于DMEM中，混合液超声处理得到均匀的分散溶液。
3.一种三维细胞纸芯片传感器，其特征在于，所述传感器包括权利要求1或2所述的三维细胞纸芯片、硬质电极夹具。
4.根据权利要求3所述的三维细胞纸芯片传感器，其特征在于，用硬质电极夹具夹好检测芯片，连接电化学工作站，即得到三维细胞纸芯片传感器。
5.权利要求1或2所述的三维细胞纸芯片或者权利要求3或4所述的三维细胞纸芯片传感器在检测领域中的应用。
6.一种测定革兰氏阴性菌脂多糖含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)标准曲线构建：将已知浓度的脂多糖标准品分别滴加到权利要求3或4所述的三维细胞纸芯片传感器的三维细胞培养系统中进行孵育，并采用差分脉冲伏安法测定电流，利用脂多糖浓度与电流值构建线性模型，得到脂多糖标准品浓度对数值与电流值的标准曲线；
(2)待测样测试：处理菌株，提取得到待测的脂多糖样品，然后滴加到权利要求3或4所述的三维细胞纸芯片的三维细胞培养系统中，采用差分脉冲伏安法测得电流值，再根据步骤(1)得到的标准曲线，定量菌株脂多糖浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脂多糖标准品是肠炎沙门氏菌来源脂多糖标准样品。
8.权利要求6或7所述的方法在革兰氏阴性菌脂多糖毒力评价方面的应用。
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