CN105628761B - 基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器及制备方法与应用。其制备方法包括制备碳糊电极(CPE)、制备硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极和组装基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，并采用常规三电极系统，BMIP‑CPE作为工作电极。现有技术相比，本发明的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器制备工艺简单、成本低廉、使用寿命长，适用于现场监测，使用该传感器检测环境水、水产品及其相关产品中残留MG，具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽、精密度和准确度高、检测费用低和环境友好等特点。
Description
技术领域
本发明属于食品安全与环境保护监控领域，特别涉及一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器及其制备方法与应用。
背景技术
孔雀石绿(malachite green,MG)属三苯甲烷类染料，为高效抗原虫和真菌感染药，曾广泛应用于水产养殖业以防治鱼类水霉病、烂鳃病和寄生虫病等。MG极易被鱼类等水生动物吸收，经代谢后主要生成亲脂性的隐性孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)，MG和LMG的化学结构及它们之间的转化关系如下：
MG和LMG的化学结构式以及它们之间的相互转化关系
经研究表明，MG和LMG均具有潜在的致癌、致畸和致突变作用，故20世纪90年代以来,许多国家和地区(包括美国、日本、欧盟等)都将其列为水产养殖的禁用药物；我国在农业行业标准《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》中也将MG列为禁用药物。但由于MG价格低廉、效用强、易于获得，滥用现象时有发生，导致水产品、环境水以及相关产品MG的含量往往严重超标，对环境和食品安全构成威胁。因此，各国政府对检测MG残留量非常重视，研究灵敏准确、简便快捷的检测MG含量的新方法，具有重要的现实意义。目前检测MG的方法主要有酶联免疫检测法、分光光度法、色谱法及色质联用法等。这些方法或选择性差、或灵敏度低、或需要使用昂贵的仪器设备，难以推广应用。
在众多的痕量检测新技术研究中，电化学传感器，尤其是伏安型电化学传感器，由于具有制备简单、响应快速、灵敏度和选择性高和适合现场监测等特性，是目前MG含量测定中需要优先发展的检测技术。近年来，基于分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymer,MIP)修饰电极的研究引起了研究人员的极大关注。MIP是一种模拟天然受体与靶标分子之间“锁与钥匙”相互作用模式的具有仿生功能的人工合成物，对目标分子具有高选择性和高特异性识别能力。目前合成MIP的方法主要有电化学聚合法、原位聚合法、自组装法和溶胶-凝胶法等。由于溶胶-凝胶法所制备的MIP具有亲水性强、印迹位点在水溶液中与模板分子再结合能力不受影响、且无溶剂导致的溶胀性等特点，故被广泛应用于印迹型电化学传感器的构建。目前，大多数合成MIP与模板分子的相互作用主要是非共价作用力，如氢键、π-π堆积、静电作用和范德华力等。较弱的非共价作用力在一定程度上影响了MIP对模板分子的亲和能力及识别选择性。如果在MIP中引入路易斯酸碱结合位点，将配位相互作用引入其中,则能显著增强印迹位点对模板分子的亲和力和识别选择性。与非共价作用力相比，配位作用力更强，更具有方向性和特异性，由此制备的MIP传感器将表现出对被测物更强的再结合能力和更高的识别选择性。若将三价硼化合物掺杂到由溶胶-凝胶法制备的MIP中，路易斯酸碱结合位点即被引入到该硼掺杂的分子印迹聚合物(boron dopedmolecularly imprinted polymer,BMIP)中；基于BMIP的MG伏安传感器对MG应该具有良好的选择性识别能力。
综上所述，研发基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器制备方法，将为食品安全、环境保护与质量监控提供新技术，为电化学传感器开拓新的研究思路，不仅具有很高的实际应用价值，也具有重要的学术价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器。
实现本发明上述目的的技术方案是：一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其是采用如下方法制备的：
以甲基三甲氧基硅烷(methyltrimethoxysilane，MTMOS)和苯基三甲氧基硅烷(phenyltrimethoxysilane，PTMOS)为功能单体，间氨基苯硼酸(m-aminophenylboronicacid，APBA)为掺杂剂，MG为模板分子，四乙氧基硅烷(tetraethylorthosilicate，TEOS)为交联剂，通过溶胶-凝胶法制备新型硼掺杂MG分子印迹聚合物，并将该印迹聚合物用于修饰碳糊电极，构建检测MG的伏安传感器。
本发明进一步的技术方案是：
第一步、碳糊电极(CPE)的制备：
将石墨粉和石蜡油按重量比70～95:30～5的比例混合，置于含有无水乙醇的容器中，超声10～40分钟后得一悬浊液；然后在室温或温度不高于60℃的水浴加热情况下，将乙醇蒸发至完全除去，得到均一的碳糊；将碳糊紧密填充入聚丙烯或聚四氟乙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极，室温储存备用；
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
按配比将pH为8.5～11.5的磷酸缓冲液、含10～20mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60％乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，30～45℃搅拌至均匀，最后加入TEOS，30～45℃继续搅拌至溶胶形成；各成分的配比为：磷酸缓冲液、含10～20mmol·L-1间氨基苯硼酸和9～12mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、PTMOS、MTMOS和TEOS的体积配比为10～25：100～800：1～2：2～3：2～4；
取上述溶胶0.003～0.010mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发；再均匀滴涂0.5％Nafion乙醇溶液0.003～0.008mL，氮气吹干；然后将该电极用有机溶剂反复清洗，直到MG被完全洗除干净，得到硼掺杂分子印迹聚合物(BMIP)修饰碳糊电极(BMIP-CPE)；
第三步、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的组装：
将第二步制备好的硼掺杂分子印迹聚合物(BMIP)修饰碳糊电极BMIP-CPE与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，BMIP-CPE作为工作电极。
本发明再进一步的技术方案是：制备碳糊电极时，将石墨粉和石蜡油按重量配比混合，重量配比优选75～90:25～10；再优选80～90:20～10；更优选85:15。
本发明更进一步的技术方案是：制备硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极时，按配比将pH为8.5～11.5的磷酸缓冲液、含10～20mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60％乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，各成分的体积配比优选12～20：200～600：1.1～1.8：2.2～2.6：2.2～3.2；再优选15～18：300～500：1.3～1.6：2.3～2.5：2.5～3.0；更优选16：400：1.5：2.4：2.8。
本发明的目的之二是提供一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法。
实现本发明上述目的的技术方案是：一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法，其包括如下步骤：
第一步、碳糊电极(CPE)的制备：
将石墨粉和石蜡油按重量比70～95:30～5的比例混合，置于含有无水乙醇的容器中，超声10～40分钟后得一悬浊液；然后在室温或温度不高于60℃的水浴加热情况下，将乙醇蒸发至完全除去，得到均一的碳糊；将碳糊紧密填充入聚丙烯或聚四氟乙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极，室温储存备用；
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
按配比将pH为8.5～11.5的磷酸缓冲液、含10～20mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60％乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，30～45℃搅拌至均匀，最后加入TEOS，30～45℃继续搅拌至溶胶形成；各成分的配比为：磷酸缓冲液、含10～20mmol·L-1间氨基苯硼酸和9～12mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、PTMOS、MTMOS和TEOS的体积配比为10～25：100～800：1～2：2～3：2～4；
取上述溶胶0.003～0.010mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发；再均匀滴涂0.5％Nafion乙醇溶液0.003～0.008mL，氮气吹干；然后将该电极用有机溶剂反复清洗，直到MG被完全洗除干净，得到硼掺杂分子印迹聚合物(BMIP)修饰碳糊电极(BMIP-CPE)；
第三步、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的组装：
将第二步制备好的硼掺杂分子印迹聚合物(BMIP)修饰碳糊电极BMIP-CPE与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，BMIP-CPE作为工作电极。
本发明再进一步的技术方案是：制备碳糊电极时，将石墨粉和石蜡油按重量配比混合，重量配比优选75～90:25～10；再优选80～90:20～10；更优选85:15。
本发明更进一步的技术方案是：制备硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极时，按配比将pH为8.5～11.5的磷酸缓冲液、含10～20mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60％乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，各成分的体积配比优选12～20：200～600：1.1～1.8：2.2～2.6：2.2～3.2；再优选15～18：300～500：1.3～1.6：2.3～2.5：2.5～3.0；更优选16：400：1.5：2.4：2.8。
本发明的目的之三是提供一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的应用。
实现本发明上述目的的技术方案是：一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的应用，用于环境水、鱼、虾等水产品中MG的含量测定，以及与之相关物如饲料等产品中MG的含量检测。
本发明进一步的技术方案是：一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器应用于环境水、鱼、虾等水产品中MG的含量测定步骤如下：
第一步，建立校正曲线(或称工作曲线)及校正曲线方程：
用二次蒸馏水配制10.0mmol·L-1MG储备溶液，再用40mmol·L-1Britton–Robinson缓冲液(B-R缓冲液，pH 5～7)稀释成不同浓度的MG系列标准溶液，用本发明的传感器测定系列标准液中MG含量，测定时采用差分脉冲伏安法(differential pulsevoltammetry，DPV)，记录扫描的伏安数据，扫描结束后，从DPV曲线0.5V处读出对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip；取出工作电极，用有机溶剂反复清洗，然后用DPV法检验，若0.5V处再无MG的阴极还原峰出现，说明电极已清洗干净，此时该工作电极又可继续用于下一次测定；以同一浓度MG标准溶液平行测定三次的Ip平均值(单位为微安，μA)为纵坐标，对应标准溶液浓度c(单位为微摩尔每升，μmol·L-1)为横坐标，作校正曲线图，并建立校正曲线方程，其形式为：
Ip(μA)＝k c(μmol L-1)+B
式中k和B分别为校正曲线的斜率和截距；用本发明的伏安传感器在选定的实验条件下测定系列MG标准溶液，所得校正曲线方程的斜率k＝0.0946、截距B＝-0.0354；
第二步，样品预处理：
a.鱼肉：将鱼去皮和骨头，取鱼肉切片，搅碎成鱼肉泥；准确称取5.000克鱼肉泥于50mL离心管中，加入10mL乙腈和10克三氧化二铝，在涡旋混合器上振动40秒，再超声20分钟,然后以每分钟3000转速离心10分钟,将得到的上清液过0.45μm滤膜，滤液转移到50mL烧杯中；于滤渣中再加入10mL乙腈，涡旋40秒，再超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45μm滤膜，滤液合并到装有上一次滤液的烧杯中；该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后，50℃水浴旋转蒸干；在蒸干后的残留物中加入5.0mLB-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝5～7)复溶，作为供试液。
b.虾肉：将虾肉去皮后捣烂成虾肉泥，之后的处理程序与鱼肉泥相同，制得虾样供试液。
c.鱼饲料:将5.000克鱼饲料碾磨成粉末后，转移至50mL聚丙烯离心管中，加入10.0mL乙腈，涡旋40秒、超声20分钟后，以每分钟3500转速离心10分钟，将得到的上清液过0.45μm滤膜，滤液转移到50mL烧杯中；于滤渣中再加入10mL乙腈，涡旋40秒、超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45μm滤膜，滤液合并到装有第一次滤液的烧杯中；该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后，50℃水浴旋转蒸干；在蒸干后的残留物中加入5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝5～7)复溶，作为供试液。
d.河水和鱼塘水:取新鲜河水或鱼塘水，过0.45μm滤膜除去不溶物；取10.0mL过滤后的河水或鱼塘水置于玻璃离心试管中，用注射器快速注入2.5mL体积比为4:1的乙腈-氯仿混合液，涡旋40秒，再以每分钟2500转速离心3分钟，用尖嘴吸管小心吸出沉于试管底部的氯仿萃取液，转移至另一支试管中，上层水相再用同样方法萃取第二次和第三次；合并三次氯仿萃取液，于50℃水浴旋转蒸干；残留物用5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝5～7)复溶，作为供试液。
第三步，样品中MG含量测定：
样品中MG含量测定的操作步骤，与第一步测定标准溶液时相同；从DPV扫描曲线0.5V处读出MG还原峰电流Ip(单位为微安，μA)，将该Ip值与校正曲线比对，读出对应的浓度c值；或将Ip值代入校正曲线方程，计算出待测样品中MG的浓度c(单位为微摩尔每升，μmol·L-1)。
本发明所述的基于硼掺杂分子印迹聚合物孔雀石绿伏安传感器检测MG的线性范围为0.5～70.0μmol·L-1，相关系数r＝0.9997，检测限为0.1μmol·L-1，样品加标回收率在94.7％-105.7％，相对标准偏差在1.0％-3.8％之间。具有电活性且结构相似的潜在共存物(隐性孔雀石绿、隐性结晶紫、结晶紫)对本传感器测定等浓度MG无明显干扰(引起的峰电流信号变化<5％)；潜在的共存离子(K+、Ca2+、Mg2+、Pb2+、I-、Cl-、NO3 -和SO4 2-浓度为MG的200倍)对本传感器测定MG亦无明显干扰(引起的峰电流信号变化<5％)。用本法测定样品中的MG时，所得结果与高效液相色谱法测定结果比较无显著性差异，说明本方法测定MG灵敏度高、选择性好、结果准确可靠。
本发明将芳香硼酸掺杂于分子印迹聚合物中，在印迹位点与模板MG之间引入了额外的配位相互作用，显著改善了该传感器对MG测定的识别选择性、测定灵敏度和准确度。
与现有技术相比，本发明的基于硼掺杂分子印迹聚合物孔雀石绿伏安传感器制备工艺简单、成本低廉、使用寿命长和适用于现场监测。使用该传感器检测环境水、水产品及其相关产品中残留MG，具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽、精密度和准确度高、检测费用低和环境友好等特点。具体表现为以下显著优点：
(1)选择碳糊电极作为基体电极，使传感器具有宽的电位应用范围和低的背景值，易通过不同方式的修饰提高其灵敏度和选择性，且制作成本低廉、制备方法简单、无需大型化工设备，无能耗，无污染。
(2)作为传感识别元件的分子印迹膜赋予传感器特异识别能力和高抗干扰能力，是传感器的关键组成部件。本专利采用溶胶凝胶法制备的MG分子印迹聚合物，不仅具有良好的亲水性和结构刚性(不溶涨、不变形)，且化学性质稳定，可使传感器在各种溶液体系中使用。硅胶材料的多孔性还可降低传质阻力，提高传感器的响应速度。另外，将硼掺杂到分子印迹聚合物中，可在印记识别的微环境中引入路易斯酸碱结合位点，其配位相互作用能增强对模板分子的亲和力和选择性识别能力，从而使得该传感器具有良好的选择性。更值得一提的是，本专利所制备的硼掺杂印迹膜还能催化MG的电化学反应，使其还原电位与未修饰碳糊电极相比降低了0.2V，还原峰电流也提高了仅7倍。
(3)传感器具有良好的分析性能，线性范围宽(0.5～70.0μmol·L-1)、检测限低(0.1μmol·L-1)、灵敏度高、重现性好(同一支电极平行六次测定50μmol·L-1MG，相对标准偏差为3.55％；同样方法制备的六支不同电极测定50μmol·L-1的MG，其相对标准偏差为3.15％)、抗干扰能力强(三种结构相似的潜在共存物和常见共存离子对本传感器测定等浓度MG的干扰少于<5％。)、使用寿命长(将电极在室温条件下置于空气中，每五天测一次，30天以后测得电极信号为最初信号的95.4％)。
(4)由于分子印迹形成步骤中不涉及电化学反应，该传感器制备方法具有广泛的适用性，不仅可用于制备电活性物质如MG等三苯甲烷类传感器，也能用于制备非电活性物质的电化学传感器。
附图说明
图1为基于掺硼印迹识别的孔雀石绿伏安传感器用于MG测定的校正曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出一些非本质的改进或调整，均属于本发明保护范围。
实施例1：用于测定鱼肉中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其是采用如下方法制备的：
第一步、碳糊电极的制备：
将石墨粉和石蜡油按重量比85:15的比例混合，置于含有无水乙醇的小烧杯中，超声15分钟后得一悬浊液，然后在室温下将乙醇蒸发至完全除去，得到混合均匀的碳糊；取碳糊紧密填充入直径为2mm的聚四氟乙烯管中；管子的一端插入直径为1mm的铜导线作为外电路连接点；用砂纸将另一端端面磨平，再用称量纸打磨成光滑的镜面，室温下储存备用。
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
将0.75mL 40mmol·L-1磷酸缓冲液(pH＝8.5)、6mL含11.6mmol·L-1间氨基苯硼酸和11.4mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、0.04mL PTMOS和0.095mL MTMOS混合，30～45℃搅拌至均匀，最后加入0.125mL TEOS，35℃继续搅拌40-60分钟至溶胶形成；取上述溶胶0.004mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发。再均匀滴涂0.005mL 0.5％Nafion乙醇溶液，氮气吹干。然后，将该电极用甲醇-醋酸溶液(9:1，v/v)反复清洗，直到MG被完全洗除干净(用DPV法检测不到MG的还原峰)，得到硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极(BMIP-CPE)；
第三步、用于测定鱼肉中MG含量的伏安传感器的组装：
以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，将第二步制备的BMIP-CPE作为工作电极，组装成用于测定鱼肉中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器。
实施例2：用于测定虾肉中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其是采用如下方法制备的：
第一步、碳糊电极的制备：
将石墨粉和石蜡油按重量比88:12的比例混合，置于含有无水乙醇的小烧杯中，超声20分钟；然后在40～45℃下将乙醇蒸发至完全除去，得到混合均匀的碳糊。取碳糊紧密填充入直径为2.5mm的聚丙烯塑料管中。管子的一端插入直径为1mm的银导线作为外电路连接点；用砂纸将另一端端面磨平，再用称量纸打磨成光滑的镜面。室温下储存备用。
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
将0.8mL 40mmol·L-1磷酸缓冲液(pH＝9.0)、5mL含15mmol·L-1间氨基苯硼酸和11mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、0.05mL PTMOS和0.105mL MTMOS混合，40℃搅拌至均匀，最后加入0.115mL TEOS，30～45℃继续搅拌40～60分钟至溶胶形成；取上述溶胶0.006mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发。再均匀滴涂0.006mL 0.5％Nafion乙醇溶液，氮气吹干。然后，将该电极用乙醇-醋酸溶液(9:1，v/v)反复清洗，直到MG被完全洗除干净(用DPV法检测不到MG的还原峰)，得到硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极(BMIP-CPE)。
第三步、用于测定虾肉中MG含量的伏安传感器的组装：
以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为辅助电极，第二步制备的BMIP-CPE作为工作电极，组装成用于测定虾肉中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器。
实施例3：用于测定河水中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其是采用如下方法制备的：
第一步、碳糊电极的制备：
将石墨粉和石蜡油以重量比为90:10的比例混合，置于含有无水乙醇的小烧杯中，超声25分钟；然后在45～55℃下将乙醇蒸发至完全除去，得到均匀混合的碳糊；取碳糊紧密填充入直径为2mm的聚四氟乙烯管中，管子的一端插入直径为1mm的铜导线作为外电路连接点；用砂纸将另一端端面磨平，再用称量纸打磨成光滑的镜面；室温下储存备用。
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
将0.7mL 40mmol·L-1磷酸缓冲液(pH＝9.0)、6.5mL含17mmol·L-1间氨基苯硼酸和10mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、0.06mL PTMOS和0.10mL MTMOS混合，45℃搅拌至均匀，最后加入0.12mL TEOS，45℃继续搅拌45-50分钟至溶胶形成；取上述溶胶0.006mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发；再均匀滴涂0.003mL 0.5％Nafion乙醇溶液，氮气吹干；然后，将该电极用甲醇-醋酸溶液(8:2，v/v)反复清洗，直到MG被完全洗除干净(用DPV法检测不到MG的还原峰)，得到硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极(BMIP-CPE)。
第三步、用于测定河水中MG含量的伏安传感器的组装：
以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，将第二步制备的BMIP-CPE作为工作电极，组装成用于测定河水中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器。
实施例4：用于测定鱼塘水中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法，包括如下步骤：
第一步、碳糊电极的制备：
将石墨粉和石蜡油以重量比为92:8(w/w)的比例混合，置于含有无水乙醇的烧杯中，超声30分钟；在55～60℃下将乙醇蒸发至完全除去，得到混合均匀的碳糊；取碳糊紧密填充入直径为3.0mm的聚丙烯塑料管中，管子的一端插入直径为1mm的银导线作为外电路连接点；用砂纸将另一端端面磨平，再用称量纸打磨成光滑的镜面；室温下储存备用。
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
将0.65mL 40mmol·L-1的磷酸缓冲溶液(pH＝10.5)、7mL含20mmol·L-1间氨基苯硼酸和9mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、0.075mL和0.085mL MTMOS混合，35℃搅拌至均匀，最后加入0.13mL TEOS，35℃继续搅拌50～60分钟至溶胶形成；取上述溶胶0.007mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发；再均匀滴涂0.007mL 0.5％Nafion乙醇溶液，氮气吹干。然后，将该电极用甲醇-丙酮溶液(5:5，v/v)反复清洗，直到MG被完全洗除干净(用DPV法检测不到MG的还原峰)，得到硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极(BMIP-CPE)。
第三步、用于测定河水中MG含量的伏安传感器的组装：
以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为辅助电极，BMIP-CPE为工作电极，组装成用于测定鱼塘水中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器。
实施例5：用于测定鱼饲料中MG含量的、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法，包括如下步骤：
第一步、碳糊电极的制备：
将石墨粉和石蜡油以重量比95:5的比例混合，置于含有无水乙醇的小烧杯中，超声35分钟；然后在50～55℃下将乙醇蒸发至完全除去，得到均匀混合的碳糊。取碳糊紧密填充入直径为2mm的聚四氟乙烯管中，管子的一端插入直径为1mm的银导线作为外电路连接点；用砂纸将另一端端面磨平，再用称量纸打磨成光滑的镜面；室温下储存备用。
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
将0.85mL 40mmol·L-1磷酸缓冲溶液(pH＝9.5)加入到6mL含16mmol·L-1间氨基苯硼酸和10.5mmol·L-1MG的60％乙醇溶液、0.05mL PTMOS和0.10mL MTMOS混合，45℃搅拌至均匀，最后加入0.12mL TEOS，40℃继续搅拌50-55分钟至溶胶形成；取上述溶胶0.008mL均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发。再均匀滴涂0.005mL 0.5％Nafion乙醇溶液，氮气吹干。然后，将该电极用丙酮-醋酸溶液(8:2，v/v)反复清洗，直到MG被完全洗除干净(用DPV法检测不到MG的还原峰)，得到硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极(BMIP-CPE)。
第三步、用于测定河水中MG含量的伏安传感器的组装：
以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，BMIP-CPE作为工作电极，组装成用于测定鱼饲料中MG含量的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器。
实施例6：基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器在测定鱼肉中MG含量中的应用。
采用实施例1的孔雀石绿伏安传感器测定草鱼(购于超市)肉中的MG含量：
第一步、建立校正曲线(或称工作曲线)及校正曲线方程：
用二次蒸馏水配制10.0mmol·L-1MG储备溶液，再用40mmol·L-1B-R缓冲液(pH6.0)稀释成不同浓度的MG系列标准溶液；用本发明实施例1制备的孔雀石绿伏安传感器测定一系列不同浓度标准液中MG的含量；测定前，将BMIP-CPE浸入上述制备的5.0mL某浓度MG标准溶液中预富集，开路电位下磁力搅拌20min，预富集温度控制在33±2℃(水浴控温)；取出电极，用蒸馏水小心洗去电极表面可能吸附的杂质，氮气干燥；最后将电极插入装有5.0mL空白B-R缓冲溶液(40mmol·L-1，pH＝6.0)的三电极电解池中，以BMIP-CPE作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极；静止10s后用DPV法检测并记录伏安数据及DPV伏安曲线图；DPV参数选定为：电位扫描区间0.1V至0.8V，脉冲幅度为0.05V，脉冲宽度为0.05V，电位增量为0.016V；扫描结束后，从DPV曲线0.5V处读出对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip；测定结束后取出工作电极，用甲醇-醋酸溶液(9:1，v/v)反复清洗，然后用DPV法检验，若0.5V处再无MG的阴极还原峰出现，说明电极已清洗干净；此时该工作电极又可继续用于下一次测定；以同一浓度MG标准溶液平行测定三次的Ip平均值(单位为微安，μA)为纵坐标，以对应的标准溶液浓度c(单位为微摩尔每升，μmol·L-1)为横坐标，作校正曲线图，并建立校正曲线方程：
Ip＝0.0946c-0.0354。
第二步、鱼肉供试液的制备：
将鱼去皮和骨头，取鱼肉切片，搅碎成泥；准确称取5.000克鱼肉泥于50mL离心管中，加入10mL乙腈和10克三氧化二铝，在涡旋混合器上振动40秒，再超声20分钟,然后以每分钟3000转速离心10分钟,将得到的上清液过0.45μm滤膜，滤液转移到50mL烧杯中；于滤渣中再加入10mL乙腈，涡旋40秒，再超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45μm滤膜，滤液合并到装有第一次滤液的烧杯中；该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后，50℃水浴旋转蒸干；在蒸干后的残留物中加入5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.0)复溶，作为供试液。
第三步、含量测定：
测定方法与第一步相同，只是测定对象不是标准溶液，而是待测鱼肉样品的供试液。测定前，将工作电极浸入5.0mL供试液中，开路电位磁力搅拌20分钟，预富集温度控制在33±2℃(水浴控温)；取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥；然后将其放入5.0mL空白B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH 6.0)中，用DPV法测定；从DPV曲线0.5V处读出并记录对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip；将平行测定三次所得到的平均值Ip与校正曲线比对，读出对应的c值；或将该Ip值代入校正曲线方程，计算出MG浓度c；平行三次的测定结果表明，本实例供试的鱼肉中未检出MG。
通过A、B、C三组加标回收实验来评价本发明伏安传感器的准确度；往上述未检出MG的鱼肉供试液中加入已知量的MG标准液，再测定其MG含量。
按式(1)计算加标回收率R:
式(1)中，c0为加标后供试液中MG的浓度，c1为传感器实际测得的MG浓度。然后按式(2)折算成每克固体样品(鱼、虾或饲料)中MG的含量：
式(2)中，c1的意义同式(1)，即供试液中被传感器检出的MG浓度(单位为μmol·L-1)，V为供试液体积(单位为升，L)，M为孔雀石绿的分子量(364.9)，G为供试固体样品的质量(单位为克，g)。计算结果以每克样品中含MG的微克数表示(μgg-1)。
A组加标后的MG浓度为5.0μmol·L-1，实际测得值(为三次平行测定的平均值，下同)为5.2μmol·L-1，由此计算出平均回收率R＝104.0％，相对标准偏差为3.4％。B组加标后的MG浓度为30.0μmol·L-1，实际测得值为28.4μmol·L-1，平均回收率R＝94.7％，相对标准偏差为3.2％。C组加标后的MG浓度为60.0μmol·L-1，实际测得值为57.4μmol·L-1，平均回收率R＝95.7％，相对标准偏差为2.5％。按式(2)计算加标后A、B、C三组鱼肉中被检测出的MG含量分别为1.90、10.37和20.95μg g-1。良好的回收率和较低的相对标准偏差说明本传感器测定鱼肉中MG含量，具有很高的准确度高和精密度。
实施例7：基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器在测定虾肉中MG含量中的应用。
采用实施例2的孔雀石绿伏安传感器测定虾肉(购于本地超市)中的MG含量。
第一步，建立校正曲线及校正曲线方程：
方法与实施例6相同。
第二步，虾肉供试液的制备：
将虾去皮后捣烂成泥，准确称取5.000克虾肉泥于50mL离心管中，加入10mL乙腈和10克三氧化二铝，在涡旋混合器上振动40秒、超声20分钟,然后以每分钟3000转速离心10分钟,将得到的上清液过0.45μm滤膜，滤液转移到50mL烧杯中；于滤渣中再加入10mL乙腈，涡旋40秒，再超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45μm滤膜，滤液合并到装有前一次滤液的烧杯中；该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后，50℃水浴旋转蒸干；残留物用5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝5.5)复溶，作为供试液。
第三步，含量测定：
用本发明实施例2制备的孔雀石绿伏安传感器测定虾样中MG含量。测定前，将BMIP-CPE浸入5.0mL供试液中，开路电位磁力搅拌20分钟，预富集温度控制在33±2℃(水浴控温)。取出电极，用蒸馏水小心洗去电极表面可能吸附的杂质，氮气干燥；然后将电极放入装有5.0mL空白B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝5.5)的三电极电解池中，以BMIP-CPE作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极。静止10s后用DPV法测定。DPV参数选定为：电位扫描区间0.1V至0.8V，脉冲幅度为0.05V，脉冲宽度为0.05V，电位增量为0.016V。扫描结束后，从DPV曲线0.5V处读出并记录对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip。用与实例6相一致的方法，将该Ip值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将Ip值代入校正曲线方程，计算出MG浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的虾肉中未检出MG。
通过三组加标回收实验来评价本发明伏安传感器的准确度。在上述未检出MG的虾样供试液中分别加入三个水平已知量的MG标准液，加标值分别为5.0、30.0和60.0μmol·L-1。按实施例6中式(1)计算加标回收率R:
用本传感器测定加标后虾样中MG的含量，实际测得值(为三次平行测定的平均值，下同)分别为4.8、31.7和57.5μmol·L-1。平均回收率分别为96.0％、105.7％和95.8％，相对标准偏差为3.4％、3.8％和2.9％。按实施例6中式(2)计算加标后三组虾肉中被检测出的MG含量分别为1.75，11.57和20.99μg g-1。良好的回收率和较低的相对标准偏差说明本传感器测定虾肉中MG含量，具有很高的准确度高和精密度。
实施例8：基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器在测定河水中MG含量中的应用。
采用实施例3制备的孔雀石绿伏安传感器测定河水(取于本地)中的MG含量。
第一步，建立校正曲线及校正曲线方程：
方法与实例6相同。
第二步，河水供试液的制备：
取新鲜河水，过0.45μm滤膜以除去不溶物。取10.0mL过滤后的河水置于玻璃离心试管中，用注射器快速注入2.0mL体积比为4:1的乙腈-氯仿混合液，涡旋40秒，再以每分钟2500转速离心3分钟，用尖嘴玻璃吸管小心吸出沉于试管底部的氯仿萃取液，转移至另一支试管中。余下的水相再用同样方法萃取第二次和第三次。合并三次氯仿萃取液，于50℃水浴旋转蒸干。残留物用5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.0)复溶，作为供试液。
第三步，含量测定：
用本发明实施例3制备的孔雀石绿伏安传感器测定河水中MG含量。测定前，将BMIP-CPE浸入5.0mL供试液中，开路电位磁力搅拌20分钟，预富集温度控制在33±2℃(水浴控温)。取出电极，小心洗去电极表面可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将其放入5.0mL空白B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.0)的三电极电解池中，以BMIP-CPE作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极。静止10s后用DPV法测定。DPV参数选定为：电位扫描区间0.1V至0.8V，脉冲幅度为0.05V，脉冲宽度为0.05V，电位增量为0.016V。扫描结束后，从DPV曲线0.5V处读出并记录对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip。用与实例6相一致的方法，将该Ip值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将Ip值代入校正曲线方程，计算出MG浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的河水中未检出MG。
通过三组加标回收实验来评价本发明伏安传感器的准确度。在上述未检出MG的河水供试液中分别加入三个水平已知量的MG标准液，然后用本传感器测定加标后河水供试液中MG的含量。加标值分别为0.8、35.0和65.0μmol·L-1，实际测得值(三次平行测定的平均值)分别为0.8、33.7和66.9μmol·L-1，平均回收率在96.3％～102.9％范围内，相对标准偏差为1.0％～2.1％。
然后按式(3)折算成供检测的原液体(河水或鱼塘水)中MG的含量：
式(3)中，c1为供试液中被传感器检出的MG浓度(单位为μmol·L-1)，V为供试液体积(单位为毫升，mL)，M为孔雀石绿的分子量(364.9)，V0为河水或池塘水的体积(单位为毫升，mL)。计算结果以每毫升水中含MG的微克数表示(μg mL-1)。按式(3)计算加标后三组河水中被检测出的MG含量分别为0.15、6.15和12.21μg mL-1。
实施例9：基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器在测定鱼塘水中MG含量中的应用。
采用实施例4制备的孔雀石绿伏安传感器测定鱼塘水(取于本地)中的MG含量。
第一步，建立校正曲线及校正曲线方程：
方法与实例6相同。
第二步，鱼塘水供试液的制备：
取新鲜鱼塘水，用0.45μm滤膜过滤除去不溶物。取10.0mL过滤后的鱼塘水置于玻璃离心试管中，用注射器快速注入2.0mL体积比为4:1的乙腈-氯仿混合液，涡旋40秒，再以每分钟2500转速离心3分钟，用尖嘴吸管小心吸出沉于试管底部的氯仿萃取液，转移至另一支试管中。余下的水相再用同样方法萃取第二和第三次。合并三次氯仿萃取液，于50℃水浴旋转蒸干。残留物用5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.5)复溶，作为供试液。
第三步，含量测定：
用本发明实施例4制备的孔雀石绿伏安传感器测定鱼塘水中MG含量。测定前，将BMIP-CPE浸入5.0mL供试液中，开路电位磁力搅拌20分钟，预富集温度控制在33±2℃(水浴控温)。取出电极，用蒸馏水小心洗去电极表面可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将电极放入装有5.0mL空白B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.5)的三电极电解池中，以BMIP-CPE作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂片电极为对电极。静止10s后用DPV法测定。DPV参数选定为：电位扫描区间0.1V至0.8V，脉冲幅度为0.05V，脉冲宽度为0.05V，电位增量为0.016V。扫描结束后，从DPV曲线0.5V处读出并记录对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip。用与实例6相一致的方法，将该Ip值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将Ip值代入校正曲线方程，计算出MG浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的池塘水中未检出MG。
在上述未检出MG的池塘水中分别加入已知量MG标准液，使加标后的池塘水供试液中MG含量分别为2.0、35.0和65.0μmol·L-1。用本传感器实际测得值(三次测定的平均值)分别为1.9、34.0和64.1μmol·L-1。最后按实例8中式(3)计算加标后三组鱼塘水中被检测出的MG含量分别为0.35、6.21和11.70μg mL-1。
用本传感器测定鱼塘水的平均加标回收率在95.0％～97.1％范围内，相对标准偏差为1.0％～3.2％。说明本传感器测定鱼塘水中MG含量，具有良好的准确度和精密度。
实施例10：基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器在测定鱼饲料中MG含量中的应用。
采用实施例5制备的孔雀石绿伏安传感器测定鱼饲料(购于本地)中的MG含量。
第一步，建立校正曲线及校正曲线方程：
方法与实例6相同。
第二步，鱼饲料供试液的制备：
将5.000克鱼饲料碾磨成粉末后，转移至50mL聚丙烯离心管中，加入10.0mL乙腈，涡旋40秒、超声20分钟后，以每分钟3500转速离心10分钟，将得到的上清液过0.45μm滤膜，滤液转移到50mL烧杯中。于滤渣中再加入10mL乙腈，涡旋40秒、超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45μm滤膜，滤液合并到装有前一次滤液的烧杯中。该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后，50℃水浴旋转蒸干。残留物用5.0mL B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.0)溶解，作为供试液。
第三步，含量测定：
用本发明实施例5制备的孔雀石绿伏安传感器测定鱼饲料中MG含量。测定前，将BMIP-CPE浸入5.0mL供试液中，开路电位磁力搅拌20分钟，预富集温度控制在33±2℃(水浴控温)。取出电极，用蒸馏水小心洗去电极表面可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将电极放入装有5.0mL空白B-R缓冲液(40mmol·L-1，pH＝6.0)的三电极电解池中，以BMIP-CPE作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极。静止10s后用DPV法测定。DPV参数选定为：电位扫描区间0.1V至0.8V，脉冲幅度为0.05V，脉冲宽度为0.05V，电位增量为0.016V。扫描结束后，从DPV曲线0.5V处读出并记录对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip。用与实例6相一致的方法，将该Ip值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将Ip值代入校正曲线方程，计算出MG浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的饲料中未检出MG。
在上述未检出MG的饲料中分别加入已知量的MG标准液，使加标后的饲料供试液中MG含量分别为2.0、25.0和50.0μmol·L-1。用本传感器实际测得值(三次测定的平均值)分别为：2.1、23.8和50.2μmol·L-1。按实施例6中式(2)计算加标后三组饲料中被检测出的MG含量分别为0.77，8.69和18.32μg g-1。
本传感器测定鱼饲料供试液的平均加标回收率在95.2％～105.0％范围内，相对标准偏差为2.2％～3.9％，说明本传感器测定鱼饲料中MG的含量，具有很高的准确度高和精密度。
Claims (10)
1.一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其特征是采用如下方法制备的：
以甲基三甲氧基硅烷（methyltrimethoxysilane，MTMOS）和苯基三甲氧基硅烷（phenyltrimethoxysilane，PTMOS）为功能单体，间氨基苯硼酸（m-aminophenylboronicacid，APBA）为掺杂剂，MG为模板分子，四乙氧基硅烷(tetraethylorthosilicate，TEOS)为交联剂，通过溶胶-凝胶法制备新型硼掺杂MG分子印迹聚合物，并将该印迹聚合物用于修饰碳糊电极，构建检测 MG 的伏安传感器。
2.根据权利要求1所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其特征是采用如下方法制备的：
第一步、碳糊电极的制备：
将石墨粉和石蜡油按重量比70~95:30~5的比例混合，置于含有无水乙醇的容器中，超声10~40分钟后得一悬浊液；然后在室温或温度不高于60℃的水浴加热情况下，将乙醇蒸发至完全除去，得到均一的碳糊；将碳糊紧密填充入聚丙烯或聚四氟乙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极，室温储存备用；
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
按配比将pH 为8.5~11.5的磷酸缓冲液、含10~20 mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60%乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，30~45 ℃搅拌至均匀，最后加入TEOS，30~45 ℃继续搅拌至溶胶形成；各成分的配比为：磷酸缓冲液、含10~20 mmol·L-1间氨基苯硼酸和9~12 mmol·L-1MG的60%乙醇溶液、PTMOS、MTMOS和TEOS的体积配比为10~25：100~800：1~2：2~3：2~4；
取上述溶胶0.003 ~0.010 mL 均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发；再均匀滴涂0.5% Nafion乙醇溶液0.003~0.008 mL，氮气吹干；然后将该电极用有机溶剂反复清洗，直到MG被完全洗除干净，得到硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极；
第三步、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的组装：
将第二步制备好的硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极 BMIP-CPE 与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，BMIP-CPE 作为工作电极。
3.根据权利要求2所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其特征是制备碳糊电极时，将石墨粉和石蜡油按重量配比混合，重量配比75~90:25~10。
4.根据权利要求2所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，其特征是制备硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极时，按配比将pH为8.5~11.5的磷酸缓冲液、含10~20mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60%乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，各成分的体积配比12~20：200~600：1.1~1.8：2.2~2.6：2.2~3.2。
5.一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法，其特征是包括如下步骤：
第一步、碳糊电极（CPE）的制备：
将石墨粉和石蜡油按重量比70~95:30~5的比例混合，置于含有无水乙醇的容器中，超声10~40分钟后得一悬浊液；然后在室温或温度不高于60℃的水浴加热情况下，将乙醇蒸发至完全除去，得到均一的碳糊；将碳糊紧密填充入聚丙烯或聚四氟乙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极，室温储存备用；
第二步、硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极的制备：
按配比将pH 为8.5~11.5的磷酸缓冲液、含10~20 mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60%乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，30~45 ℃搅拌至均匀，最后加入TEOS，30~45 ℃继续搅拌至溶胶形成；各成分的配比为：磷酸缓冲液、含10~20 mmol·L-1间氨基苯硼酸和9~12 mmol·L-1MG的60%乙醇溶液、PTMOS、MTMOS和TEOS的体积配比为10~25：100~800：1~2：2~3：2~4；
取上述溶胶0.003 ~0.010 mL 均匀滴涂到碳糊电极表面，室温下静置过夜，同时使溶剂蒸发；再均匀滴涂0.5% Nafion乙醇溶液0.003~0.008 mL，氮气吹干；然后将该电极用有机溶剂反复清洗，直到MG被完全洗除干净，得到硼掺杂分子印迹聚合物（BMIP）修饰碳糊电极（BMIP-CPE）；
第三步、基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的组装：
将第二步制备好的硼掺杂分子印迹聚合物（BMIP）修饰碳糊电极 BMIP-CPE 与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，BMIP-CPE 作为工作电极。
6.根据权利要求5所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法，其特征是制备碳糊电极时，将石墨粉和石蜡油按重量配比混合，重量配比75~90:25~10。
7.根据权利要求5所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的制备方法，其特征是制备硼掺杂分子印迹聚合物修饰碳糊电极时，按配比将pH为8.5~11.5的磷酸缓冲液、含10~20mmol·L-1间氨基苯硼酸和MG的60%乙醇溶液、PTMOS和MTMOS混合，各成分的体积配比12~20：200~600：1.1~1.8：2.2~2.6：2.2~3.2。
8.一种基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的应用，其特征是孔雀石绿伏安传感器是采用如下方法制备的：
以甲基三甲氧基硅烷（methyltrimethoxysilane，MTMOS）和苯基三甲氧基硅烷（phenyltrimethoxysilane，PTMOS）为功能单体，间氨基苯硼酸（m-aminophenylboronicacid，APBA）为掺杂剂，MG为模板分子，四乙氧基硅烷(tetraethylorthosilicate，TEOS)为交联剂，通过溶胶-凝胶法制备新型硼掺杂MG分子印迹聚合物，并将该印迹聚合物用于修饰碳糊电极，构建检测 MG 的伏安传感器；
孔雀石绿伏安传感器应用于环境水产品中MG 的含量测定，以及与之相关物产品中 MG的含量检测。
9.根据权利要求8所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的应用，其特征是测定步骤如下：
第一步，建立校正曲线及校正曲线方程：
用二次蒸馏水配制10.0mmol·L-1MG储备溶液，再用pH5~7的40mmol·L-1 Britton–Robinson缓冲液稀释成不同浓度的MG系列标准溶液，用本发明的传感器测定系列标准液中MG含量，测定时采用差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV），记录扫描的伏安数据，扫描结束后，从DPV曲线0.5 V处读出对应该浓度MG的阴极还原峰电流Ip；取出工作电极，用有机溶剂反复清洗，然后用DPV法检验，若0.5 V处再无MG的阴极还原峰出现，说明电极已清洗干净，此时该工作电极又可继续用于下一次测定；以同一浓度MG标准溶液平行测定三次的Ip平均值为纵坐标，对应标准溶液浓度c为横坐标，作校正曲线图，并建立校正曲线方程，其形式为：
Ip = kc + B，Ip的单位为μA，c的单位为μmol·L−1；
式中k和B分别为校正曲线的斜率和截距；用本发明的伏安传感器在选定的实验条件下测定系列MG标准溶液，所得校正曲线方程的斜率k = 0.0946、截距B = − 0.0354；
第二步，样品预处理；
第三步，样品中MG含量测定：
样品中MG含量测定的操作步骤，与第一步测定标准溶液时相同；从DPV扫描曲线 0.5 V处读出MG还原峰电流Ip，将该Ip值与校正曲线比对，读出对应的浓度c值；或将Ip值代入校正曲线方程，计算出待测样品中MG的浓度c。
10.根据权利要求9所述的基于印迹识别的孔雀石绿伏安传感器的应用，其特征是样品预处理方法如下：
a. 鱼肉：将鱼去皮和骨头，取鱼肉切片，搅碎成鱼肉泥；准确称取 5.000 克鱼肉泥于50 mL离心管中，加入 10 mL 乙腈和 10 克 三氧化二铝，在涡旋混合器上振动40秒，再超声20分钟, 然后以每分钟3000转速离心10分钟, 将得到的上清液过0.45 μm滤膜，滤液转移到50 mL烧杯中；于滤渣中再加入10 mL乙腈，涡旋40秒，再超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45 μm滤膜，滤液合并到装有上一次滤液的烧杯中；该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后，50°C水浴旋转蒸干；在蒸干后的残留物中加入pH5~7的40mmol·L-1 B–R缓冲液5.0 mL复溶，作为供试液；
b. 虾肉：将虾肉去皮后捣烂成虾肉泥，之后的处理程序与鱼肉泥相同，制得虾样供试液；
c. 鱼饲料:将5.000克鱼饲料碾磨成粉末后，转移至50 mL聚丙烯离心管中，加入10.0mL乙腈，涡旋40秒、超声20分钟后，以每分钟3500转速离心10分钟，将得到的上清液过0.45μm滤膜，滤液转移到50 mL烧杯中；于滤渣中再加入10 mL乙腈，涡旋40秒、超声20分钟，以每分钟3000转速离心10分钟，上清液过0.45 μm滤膜，滤液合并到装有第一次滤液的烧杯中；该萃取过程再重复一次，三次滤液合并后， 50°C水浴旋转蒸干；在蒸干后的残留物中加入pH5~7的40mmol·L-1 B–R缓冲液5.0 mL复溶，作为供试液；
d.河水和鱼塘水:取新鲜河水或鱼塘水，过0.45 μm 滤膜除去不溶物；取10.0 mL过滤后的河水或鱼塘水置于玻璃离心试管中，用注射器快速注入2.5 mL体积比为4:1的乙腈-氯仿混合液，涡旋40秒，再以每分钟2500转速离心3分钟，用尖嘴吸管小心吸出沉于试管底部的氯仿萃取液，转移至另一支试管中，上层水相再用同样方法萃取第二次和第三次；合并三次氯仿萃取液，于50°C水浴旋转蒸干；残留物用pH5~7的40mmol·L-1 B–R缓冲液5.0 mL 复溶，作为供试液。
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