CN105181780B - 基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器及制备方法与应用，其传感器的制备方法包括如下步骤：将石墨粉和石蜡油混匀成碳糊，制成碳糊电极，置于硫酸溶液中电位循环扫描，制成导电膜碳糊电极；将APTMS、TEOS、2‑乙氧基乙醇、含甲硝唑的2‑乙氧基乙醇溶液、NaOH溶液和去离子水按配比制成的溶胶滴涂到导电膜碳糊电极表面，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极，再与电化学装置连接组装成本发明传感器。本发明传感器具有增强的印迹识别能力和广泛的适用性，具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽、精密度和准确度高、检测费用低、环境友好、易于便携化和适用于现场监测等特点，且制备工艺简单、成本低廉、使用寿命长。

Description

基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器及制备方法与应用

技术领域

本发明属于临床分析及食品安全监控领域，特别涉及基于新型印迹识别，即基于双层异质分子印迹聚合物的甲硝唑电化学传感器及制备方法与在医药、临床、食品及其相关产品(如饲料等)硝基咪唑类药物分析监测中的应用。

背景技术

甲硝唑属于5-硝基咪唑类药物(其中.英文名称和结构见图1)，具有抗菌和抗原虫活性，常用于治疗人类滴虫病、梨形鞭毛虫病、阿米巴性肝脓肿等疾病。研究表明，过度使用或滥用甲硝唑药物，会造成其在人体内蓄积，达到或超过一定量后会诱发癫痫、周围神经病变及紊乱等疾病。甲硝唑也用于防治家禽的滴虫病、猪的出血性下痢及厌氧菌感染，同时还具有促生长和提高饲料喂养效率的作用。若被不合理使用及滥用于畜禽饲料或添加剂中，则可能导致可食性动物组织中的药物残留，造成食品安全隐患，最终损害人类健康。我国、欧盟和美国等均禁止甲硝唑等药物用于食品动物。因此，检测医药、体液、食品动物及饲料等相关产品中甲硝唑含量，对医药、临床医疗和保障食品质量安全都具有重要的现实意义。已报道的甲硝唑测定方法主要有分光光度法、色谱法、免疫检测法及电化学法等。这些方法或选择性、灵敏度难以达到实际测定的要求，或仪器设备昂贵，难以推广应用。

甲硝唑的化学结构式、中英文名称和英文缩写

人体或食品中残留的甲硝唑一般含量甚微，属于微量或痕量分析范畴。而在众多微/痕量检测新技术的研究中，传感器技术由于具有高选择性、低检出限、简便快捷、适合现场监测等特性，一直是分析化学领域中最受关注的热点；作为传感器的识别元件——能选择性识别和响应目标分析物的敏感膜，又是研究的核心和必须解决的关键问题。已报道的这类识别元件主要有两大类：一类是酶、抗体、受体、核酸等；以这类天然产物为识别元件的传感器具有优良的选择性，但也存在稳定性差、使用寿命短等不足。另一类是具有仿生功能的人工合成化合物，其中最受关注的当属分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymer,MIP)。该技术模拟天然受体与靶标分子之间“锁与钥匙”的相互作用模式，使MIP与模板分子再结合时具有了分子记忆功能，可选择性识别和响应目标分析物。传统MIP通常利用单烯烃衍生物作为功能单体，在模板分子存在下，与交联剂通过自由基聚合反应来制备。用该法及改良法制备的MIP虽然赋予传感器较高的识别选择性，但有模板洗脱难、传质效率低及溶剂致溶胀性等缺点。

解决这些问题的替代方法是通过溶胶-凝胶法制备分子印迹聚硅氧烷(molecularly imprinted siloxane,MIS)。基于MIS的传感器除了兼备传统MIP传感器的优点外，最突出特点是其增强的亲水性使印迹位点在水溶液中与模板分子再结合能力不受影响，且几无溶剂导致的溶胀性。但MIS的绝缘性在很大程度上仍将影响传感器的传导效率。

近年来出现的电聚合法制备MIP技术，能在任何形状的电极表面牢固地沉积一层结构均一、密度和厚度可控的分子印迹膜，并且使该敏感膜与转换器间的直接作用成为可能。此法一般适用于绝缘型MIP修饰电极测定在MIP制备条件下无电活性的物质。如果模板有电活性，则自身可能发生电化学反应而改变其结构；另一方面，导电型MIP虽可实现敏感膜与电极之间的直接传导，但模板或探针分子若不经印迹识别，直接在导电膜表面发生反应，则会降低导电型MIP传感器的选择性。

综上所述，研发新型基于双层异质分子印迹聚合物的甲硝唑电化学传感器制备方法，将为电化学传感器开拓新的研究平台，为医药、临床检验和食品安全与质量监控提供新技术，不仅具有重要的学术价值，也具有广阔的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实现本发明上述目的的技术方案是：一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比74～94:26～6在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13～17圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为100～140mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30～50℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为1～3：2～10：40～100：10～18：2～8：1～2；取此溶胶5～20μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

本发明的目的之二是提供一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法。

实现本发明上述目的的技术方案是：一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比74～94:26～6在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13～17圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为100～140mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30～50℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为1～3：2～10：40～100：10～18：2～8：1～2；取此溶胶5～20μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

本发明的目的之三是提供一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的应用。

实现本发明上述目的的技术方案是：基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器应用在医药、临床、食品及其相关产品(如饲料等)硝基咪唑类药物监测中。

本发明利用分子中同时含有能生成导电聚合物和硅氧缩聚物两类基团的苯胺甲基三乙氧基硅烷(anilinomethyltriethoxysilane，AMTEOS)作为功能单体，首先通过电聚合在碳糊电极(carbon paste electrode，CPE)表面形成导电聚合物层，然后在模板分子甲硝唑存在下，使连于硅原子上的乙氧基水解-缩聚，在该导电聚合物表面生成硅氧缩聚物分子印迹膜，即在电极表面形成具有双层异质结构的分子印迹聚合物(heterogeneousdouble-layered-based molecularly imprinted polymer，HDL-MIP)膜；位于外层的硅氧缩聚物具有亲水性和结构刚性等特点，其印迹位点的大小、形状、官能团分布均可根据模板分子的空间结构任意裁剪；位于内层的导电聚合物既具有“分子导线”功能，使电极与印迹膜之间的信号传递更加高效，又能使HDL-MIP牢固地整体“电镀”于电极表面，所含官能团还可协同外层MIS增强与模板分子的相互匹配-识别作用。

因此，基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器集成了导电分子印迹聚合物和分子印迹硅氧缩聚物二者的优势，实现了硝基咪唑类分子与转换器之间直接高效的信号转换，并且具有增强的印迹识别能力。该类新型传感器还具有广泛的适用性，不仅可用于电活性物质如硝基咪唑类药物的传感测定，也能用于非电活性物质的含量分析。

本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器可用于各种剂型医药品中甲硝唑的含量分析，临床血清、血浆、尿液等体液中甲硝唑的含量检测，也可用于食品如蜂蜜、牛奶、禽肉以及与之相关物如饲料等产品中甲硝唑的含量监测，其测定步骤如下：

第一步，建立校正曲线(或称工作曲线)及校正曲线方程：

用无水乙醇配制25mmol L^-1甲硝唑储备溶液，再用Britton–Robinson缓冲液(BR缓冲液，pH 3.5～6.0)稀释成不同浓度的甲硝唑系列标准溶液，用本发明的传感器测定系列标准液中甲硝唑含量，测定时采用差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)，记录扫描的伏安数据，扫描结束后，从DPV曲线-0.4V处读出对应该浓度甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。取出工作电极，用有机溶剂反复清洗，然后用DPV法检验，若-0.4V处再无甲硝唑的阴极还原峰出现，说明电极已清洗干净。此时该工作电极又可继续用于下一次测定。以同一浓度甲硝唑标准液平行测定三次的I_p平均值(单位为微安，μA)为纵坐标，以对应的标准溶液浓度c(单位为微摩尔每升，μmol·L^-1)为横坐标，作校正曲线，并建立校正曲线方程，其形式为：

I_p(μA)＝k c(μmol·L^-1)+B

式中k和B分别为校正曲线的斜率和截距。用本发明的传感器在选定的实验条件下测定系列甲硝唑标准溶液，所得校正曲线方程中，k＝0.0212、B＝0.2026。

第二步，样品预处理：

a.甲硝唑片剂预处理：

取甲硝唑片5粒，用玛瑙研钵研磨成粉末状，称取其十分之一质量(相当于0.5粒药)的粉末置于10mL试管中，加适量无水乙醇，超声助溶5分钟，用套有0.22μm滤膜头的注射器过滤，滤液转入100mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度；取20μL加入到5.0mL BR缓冲液(pH 3.5～6.0)中，作为供试液。

b.血浆(或血清)预处理：

将1.0mL血浆(或血清)加入2.0mL甲醇中，涡旋30秒，然后以每分钟3500转速离心5分钟；上清液过0.45μm滤膜，将滤液在氮气保护下蒸发至干，残留物用pH 3.5～6.0的BR缓冲液溶解并定容至5.0mL，作为供试液。

c.尿液预处理：

取1.0mL新鲜尿液，用pH 3.5～6.0的BR缓冲液稀释定容至5.0mL，作为供试液。

d.蜂蜜预处理：

称取1.000克蜂蜜置于10mL聚丙烯离心管中，加入3.0mL pH 6.0的BR缓冲液，35℃超声30分钟,以每分钟3000转速离心10分钟,上清液过0.45μm滤膜，滤液用pH 3.5～6.0的BR缓冲液定容至5.0mL，作为供试液。

e.奶粉预处理：

称取1.000克奶粉入20mL聚丙烯离心管中，再加入8mL体积比为1:1的乙腈-水混合液，35℃超声30分钟，以每分钟3500转速离心10min，上清液过0.45μm滤膜，将滤液在氮气保护下蒸发至干，残留物用pH 3.5～6.0的BR缓冲液溶解并定容至5.0mL，作为供试液。

f.饲料预处理：

将1.000g的饲料加入10mL聚丙烯离心管中，再向其中加入7.5mL乙酸乙酯，涡旋10分钟，然后以每分钟3500转速离心10min，上清液过0.45μm滤膜，将滤液在氮气保护下蒸发至干，残留物用pH 3.5～6.0的BR缓冲液溶解并定容至5.0mL，作为供试液。

第三步，样品中甲硝唑含量测定：

操作步骤与测定标准溶液时相同。最后，从DPV扫描曲线-0.4V处读出甲硝唑的阴极还原峰电流I_p(单位为微安，μA)，将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出待测样品中甲硝唑的浓度c(单位为微摩尔每升，μmol·L^-1)。

本发明所述的基于双层异质分子印迹聚合物电化学传感器检测甲硝唑的线性范围为4.0×10^-7～2.0×10^-4mol·L^-1，相关系数r＝0.9969，检测限为1.0×10^-7mol·L^-1，相对标准偏差为2.9％～4.7％，样品加标回收率为94.54～103.40％。具有电活性的潜在共存物(组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)和化学结构相似物(地美硝唑和罗硝唑)对本传感器测定等浓度甲硝唑无明显干扰(引起的峰电流信号变化<5％)；用本法测定甲硝唑片剂时，所得结果与药厂标称值一致。测定其它样品时，所得结果与高效液相色谱法测定结果比较无显著性差异，说明本方法测定甲硝唑准确度高、选择性好、结果可靠。

与现有技术相比，本发明的基于双层异质分子印迹聚合物电化学传感器及制备方法与其在检测医药、临床体液和食品及其相关产品中甲硝唑的应用，具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽、精密度和准确度高、检测费用低、环境友好、易于便携化和适用于现场监测等特色，并且传感器制备工艺简单、成本低廉、使用寿命长。具体表现为以下显著优点：

(1)选择碳糊电极作为基体电极，使传感器具有宽的电位范围和低的背景值，且制作成本低廉、操作简单、修饰方便，无需大型化工设备，几无能耗，无污染。

(2)传感识别元件具有双层异质结构，集成了导电分子印迹聚合物和分子印迹硅氧缩聚物二者的优势。首先，位于内层的导电聚合物既具有“分子导线”功能，实现了硝基咪唑类分子与转换器之间直接高效的信号转换，又能使印迹膜牢固地整体“电镀”于电极表面，延长电极的使用寿命。其次，导电聚合物层所含的苯胺基团还能协同外层MIS增强与模板分子的相互匹配-识别作用。第三，实验结果发现，导电聚苯胺骨架对甲硝唑的电化学还原还具有显著的催化活性，使其还原电位正向位移～200mV。(从～-0.6V移至-0.4V左右)，进一步提高了传感器的选择性。第四，位于外层的硅氧缩聚物具有亲水性和结构刚性，不溶涨、不变形，化学性质稳定、传质阻力小，可使传感器在各种溶液体系中使用，而且响应更为灵敏快捷。

(3)传感器具有良好的分析性能，线性范围宽(4.0×10^-7～2.0×10^-4mol·L^-1)，检测限低(1.0×10^-7mol·L^-1)，重复性好(相对标准偏差为2.9％～4.7％)，再现性高(六支不同电极的RSD<14.5％)，抗干扰性能强(五种电活性氨基酸和两种结构相似物对本传感器测定等浓度甲硝唑的干扰少于<5％)。适用于体液、食品等复杂背景下待测物的微量分析。

(4)由于分子印迹形成步骤中不涉及电化学反应，该传感器制备方法具有广泛的适用性，不仅可用于制备电活性物质如甲硝唑等硝基咪唑类传感器，也能用于制备非电活性物质的电化学传感器。

附图说明

图1为本发明双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极的制备过程(A)、印迹识别机制(B)及电化学传感器装配(C)示意图；

图2为本发明制备的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器用于甲硝唑测定的校正曲线图。

具体实施方式

下面通过对实施例对本发明进行具体描述，它们只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出一些非本质的改进或调整，均属于本发明保护范围。

实施例1：如图1所示，一种用于测定甲硝唑片剂中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：

将石墨粉和石蜡油以重量比84:16在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入长10cm内径为2.5mm的聚丙烯塑料管中，管子的一端插入直径为1mm的铜导线作为外电路连接点，用称量纸将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，得到碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：

将新制备的碳糊电极置于含0.10mol·L^-1AMTEOS的0.20mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描15圈，电位扫描范围为-0.5至0.9V，扫描速率为120mV·s^-1，得到表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：

首先，将100μL APTMS、300μL TEOS、3.0mL 2-乙氧基乙醇和770μL含0.030mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，35℃搅拌10分钟；再加入200μL 0.1mol·L^-1NaOH溶液和90μL去离子水，再搅拌20分钟，得到溶胶；然后，取此溶胶10μL滴涂到第二步制备的表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用甲醇-醋酸(8:2,v/v)反复清洗，直至模板分子被完全洗除干净(用DPV法检测不到甲硝唑的还原峰)；此步制得的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极简称为CPE/HDL-MIP；

四、组装用于测定甲硝唑片剂中甲硝唑含量的电化学传感器：

以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极，组装成用于测定药物中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实施例2：一种用于监测人血浆中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：

将石墨粉和石蜡油以重量比74:26在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入长10cm直内径为2.5mm的聚丙烯塑料管中。管子的一端插入直径为1mm的银导线作为外电路连接点，用称量纸将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，得到碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：

将新制备的碳糊电极置于含0.08mol L^-1AMTEOS的0.15mol L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13圈，电位扫描范围为-0.2至1.2V，扫描速率为110mV·s^-1，得到表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

(3)制备CPE/HDL-MIP：

首先，将90μL APTMS、310μL TEOS、4.0mL 2-乙氧基乙醇和760μL含0.040mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30℃搅拌20分钟；再加入190μL 0.1mol·L^-1NaOH溶液和80μL去离子水，再搅拌25分钟，得到溶胶；然后，取此溶胶12μL滴涂到第(2)步制备的导电型聚苯胺修饰电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用乙腈-醋酸(8:2,v/v)反复清洗，直至模板分子被完全洗除干净(用DPV法检测不到甲硝唑的还原峰)，得到CPE/HDL-MIP；

四、组装用于监测人血浆中甲硝唑含量的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：

以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极，组装成用于监测人血浆(或血清)中甲硝唑含量的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实施例3：一种用于监测人尿中甲硝唑含量的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：

将石墨粉和石蜡油以重量比94:6在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入长10cm内径为2.5mm的聚丙烯塑料管中，管子的一端插入直径为1mm的铜导线作为外电路连接点，用称量纸将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：

将新制备的碳糊电极置于含0.08mol·L^-1AMTEOS的0.18mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描14圈，电位扫描范围为-0.8至1.0V，扫描速率为100mV·s^-1，得到表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备CPE/HDL-MIP：

首先，将95μL APTMS、300μL TEOS、3.0mL 2-乙氧基乙醇和800μL含0.020mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，35℃搅拌15分钟；再加入200μL 0.10mol·L^-1NaOH溶液和90μL去离子水，再搅拌30分钟，得到溶胶；然后，取此溶胶8μL滴涂到第(2)步制备的导电型聚苯胺修饰电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使蒸发溶剂；最后，将该电极用甲醇-醋酸(9:1,v/v)反复清洗，直至模板分子被完全洗除干净(用DPV法检测不到甲硝唑的还原峰)，得到CPE/HDL-MIP；

(4)组装用于监测人尿中甲硝唑含量的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：

以CHI660型电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂盘电极为对电极，组装成用于监测人尿中甲硝唑含量的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实施例4：一种用于测定蜂蜜中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：

将石墨粉和石蜡油以重量比78:22在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入长10cm直径为2.5mm的聚丙烯塑料管中；管子的一端插入直径为1mm的碳棒作为外电路连接点，用称量纸将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：

将新制备的碳糊电极置于含0.10mol·L^-1AMTEOS的0.22mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描16圈，电位扫描范围为-0.6至0.9V，扫描速率为130mV·s^-1，得到表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备CPE/HDL-MIP：

首先，将105μL APTMS、320μL TEOS、3.5mL 2-乙氧基乙醇和740μL含0.025mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，40℃搅拌10分钟；再加入210μL 0.10mol·L^-1NaOH溶液和100μL去离子水，再搅拌20分钟，得到溶胶。然后，取此溶胶8μL滴涂到第二步制备的导电型聚苯胺修饰电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用甲醇-醋酸(8:2,v/v)反复清洗，直至模板分子被完全洗除干净(用DPV法检测不到甲硝唑的还原峰)，得到CPE/HDL-MIP；

(4)组装用于测定蜂蜜中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：

以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极，组装成用于测定蜂蜜中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实施例5：一种用于测定奶粉中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：

将石墨粉和石蜡油以重量比86:14在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入长10cm内径为2.5mm的聚丙烯塑料管中；管子的一端插入直径为1mm的银导线作为外电路连接点，用称量纸将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：

将新制备的碳糊电极置于含0.12mol·L^-1AMTEOS的0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描17圈，电位扫描范围为-0.4至1.1V，扫描速率为140mV·s^-1，得到导电型聚苯胺修饰电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备CPE/HDL-MIP：

首先，将110μL APTMS、280μL TEOS、2.5mL 2-乙氧基乙醇和820μL含0.035mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30℃搅拌15分钟；再加入220μL 0.10mol·L^-1NaOH溶液和85μL去离子水，再搅拌10分钟，得到溶胶；然后第，取此溶胶12μL滴涂到第(2)步制备的导电型聚苯胺修饰电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用乙腈-三乙胺(8:2,v/v)反复清洗，直至模板分子被完全洗除干净(用DPV法检测不到甲硝唑的还原峰)，制得CPE/HDL-MIP；

(4)组装用于测定奶粉中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：

以CHI660型电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂盘电极为对电极，组装成用于测定奶粉中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实施例6：一种用于测定饲料中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：

将石墨粉和石蜡油以重量比90:10在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入长10cm内径为2.5mm的聚丙烯塑料管中；管子的一端插入直径为1mm的碳棒作为外电路连接点，用称量纸将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：

将新制备的碳糊电极置于含0.12mol·L^-1AMTEOS的0.24mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描15圈，电位扫描范围为-0.5至1.0V，扫描速率为125mV·s^-1，所得导电型聚苯胺修饰电极用乙醇洗涤备用；

三、制备CPE/HDL-MIP：

首先，将100μL APTMS、290μL TEOS、2.0mL 2-乙氧基乙醇和720μL含0.030mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，40℃搅拌5分钟；再加入180μL 0.10mol·L^-1NaOH溶液和95μL去离子水，再搅拌15分钟，得到溶胶；然后，取此溶胶10μL滴涂到第(2)步制备的导电型聚苯胺修饰电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用甲醇-醋酸(8:2,v/v)反复清洗，直至模板分子被完全洗除干净(用DPV法检测不到甲硝唑的还原峰)制得CPE/HDL-MIP；

(4)组装用于测定饲料中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：

以CHI660C电化学工作站为电化学检测装置，采用常规三电极电解池，CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极，组装成用于测定饲料中甲硝唑含量的、基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器。

实施例7：一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器在测定甲硝唑片剂中甲硝唑含量中的应用，

本实例采用实施例1制备的甲硝唑电化学传感器测定甲硝唑片剂(购于本地药店，规格为0.20g)中的甲硝唑含量，其测定步骤如下：

第一步，如图2所示，建立校正曲线(或称工作曲线)及校正曲线方程

用无水乙醇配制25mmol·L^-1甲硝唑储备溶液，再用Britton–Robinson缓冲液(BR缓冲液，pH 5.0)稀释成不同浓度的甲硝唑系列标准溶液。用本发明实施例1制备的甲硝唑电化学传感器测定系列标准液的甲硝唑含量。测定前，将CPE/HDL-MIP浸入上述制备的5.0mL某浓度甲硝唑标准溶液中预富集，开路电位下磁力搅拌10min。取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后放入一装有空白BR缓冲液(5.0mL，pH 5.0)的三电极电解池中，以CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极。测定时采用DPV法，记录伏安数据及DPV伏安曲线图。DPV参数选定为：电位扫描区间0.0V至-1.0V，脉冲幅度80mV，脉冲宽度为100ms，电位增量为12mV。扫描结束后，从DPV曲线-0.4V处读出对应该浓度甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。取出工作电极，用甲醇-醋酸(8:2,v/v)反复清洗，然后用DPV法检验，若-0.4V处再无甲硝唑的阴极还原峰出现，说明电极已清洗干净。此时该工作电极又可继续用于下一次测定。以同一浓度甲硝唑标准液平行测定三次的I_p平均值(单位微安，μA)为纵坐标，以对应的标准溶液浓度c(单位微摩尔每升，μmol·L^-1)为横坐标，作校正曲线，并建立校正曲线方程：

I_p(μA)＝0.0212c(μmol L^-1)+0.2026。

第二步，药物样品溶液的制备。取甲硝唑片5粒，用玛瑙研钵研磨成粉末状。称取其十分之一质量(相当于0.5粒药，理论上含甲硝唑0.100g)的粉末置于10mL试管中，加适量无水乙醇，超声助溶5分钟，用套有0.22μm滤膜头的注射器过滤，滤液转入100mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。取20μL加入到5.0mL pH 5.0的BR缓冲溶液中，作为供试液。

第三步，含量测定。测定方法与第一步相同，只是测定对象不是标准溶液，而是待测药物的供试液。测定前，将工作电极浸入5.0mL供试液中开路电位、磁力搅拌下预富集10分钟，取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将其放入5.0mL BR缓冲液(pH 5.0)中，用DPV法测定。从DPV曲线-0.4V处读出并记录对应该浓度甲硝唑的阴极还原峰电流I_p，平行测定三次得到的I_p平均值为0.678μA。将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出甲硝唑浓度c。本实例中计算出供试液中甲硝唑的浓度为22.42μmol·L^-1。按如下公式折算出1片药中甲硝唑的含量：

式中，m指每片甲硝唑的含量(g)；c为供试液中甲硝唑的浓度(μmol·L^-1)；V₀代表滤液定容的体积(mL)；V₁指供试液的体积(mL)；M代表甲硝唑的摩尔质量(171.15g mol^-1)；V₂指配制供试液时所取样品溶液的体积(μL)。最终计算出1片药片中甲硝唑的含量约为0.192g。相对误差为-4.0％，结果与标称值无显著性差异，说明本传感器能准确测定样品中甲硝唑含量。

实施例8：基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器在测定血浆中甲硝唑含量中的应用。

本实例采用实施例2制备的甲硝唑电化学传感器测定人体血浆(由健康志愿者提供)中的甲硝唑含量。

第一步，建立校正曲线及校正曲线方程，方法与实例7相同。

第二步，人血浆样品溶液制备。将1.0mL血浆(或血清)加入2.0mL甲醇中，涡旋30秒，3500rpm离心5分钟。上清液过0.45μm滤膜，将滤液在氮气保护下蒸发至干，残留物用pH5.5的BR缓冲液溶解并定容至5.0mL，作为供试液。

第三步，含量测定。用本发明实施例2制备的甲硝唑电化学传感器测定血浆中甲硝唑含量。测定前，将CPE/HDL-MIP浸入5.0mL人血浆(或血清)供试液中，开路电位、磁力搅拌下预富集10分钟，取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后放入一装有空白BR缓冲液(5.0mL，pH 5.5)的三电极电解池中，以CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极。用DPV法测定，扫描0.0V至-1.0V范围，脉冲幅度40mV，脉冲宽度为60ms，电位增量为5mV。从DPV曲线-0.4V处读出对应于甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。用与实例7相一致的方法，将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出甲硝唑浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的血浆中未检出甲硝唑。

通过A、B两组加标回收实验来评价本发明传感器的准确度。往上述未检出甲硝唑的血浆供试液中加入已知量的甲硝唑标准液，再测定其甲硝唑含量。按下式计算加标回收率R：

式中，c₀为加标后供试液中的甲硝唑浓度，c₁为传感器实际测得的甲硝唑浓度。A组加标后的甲硝唑浓度为20.0μmol·L^-1，实际测得值(为三次平行测定的平均值，下同)为20.3μmol·L^-1，由此计算出平均回收率R＝101.5％，相对标准偏差为4.1％。B组加标后的甲硝唑浓度为80.0μmol·L^-1，实际测得值为75.6μmol·L^-1，平均回收率R＝94.5％，相对标准偏差为3.2％。良好的回收率和较低的相对标准偏差说明本传感器测定人血浆中甲硝唑含量，具有很高的准确度高和精密度。

实施例9：基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器在测定人尿中甲硝唑含量中的应用。

本实例采用实施例3制备的甲硝唑电化学传感器测定人体尿液(由健康志愿者提供)中的甲硝唑含量。

第一步，建立校正曲线及校正曲线方程，方法与实例7相同。

第二步，尿液样品溶液制备。取1.0mL新鲜尿液，用pH 4.5的BR缓冲液稀释定容至5.0mL，作为供试液用于下一步测定。

第三步，含量测定。用本发明实施例3制备的甲硝唑电化学传感器测定尿液中甲硝唑含量。测定前，将CPE/HDL-MIP浸入5.0mL尿供试液中，开路电位、磁力搅拌下预富集10分钟，取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将其放入一装有空白BR缓冲液(5.0mL，pH 4.5)的三电极电解池中，以CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂盘电极为对电极。用DPV法测定，扫描0.0V至-1.0V范围，脉冲幅度50mV，脉冲宽度为80ms，电位增量为16mV。从DPV曲线-0.4V处读出对应于甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。用与实例7相一致的方法，将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出甲硝唑浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的尿液中未检出甲硝唑。

分别在上述未检出甲硝唑的尿样中加入三个水平已知量的甲硝唑标准液，然后用本传感器测定加标后尿液中甲硝唑含量。加标值分别为5.0、50.0和150.0μmol·L^-1，实际测得值(三次测定的平均值)分别为5.2、50.9和147.2μmol·L^-1，平均回收率在98.1％～104.0％范围内，相对标准偏差为4.2％～2.9％。

实施例10：基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器在测定蜂蜜中甲硝唑含量中的应用。

本实例采用实施例4制备的甲硝唑电化学传感器测定蜂蜜(购于本地超市)中的甲硝唑含量。

第一步，建立校正曲线及校正曲线方程，方法与实例7相同。

第二步，蜂蜜样品溶液制备。准确称取1.000克蜂蜜置于10mL聚丙烯离心管中，然后加入3.0mL pH 6.0的BR缓冲液，35℃超声30分钟,以每分钟3000转速离心10分钟,上清液过0.45μm滤膜，滤液用pH 6.0的BR缓冲液定容至5.0mL，作为供试液。

第三步，含量测定。用本发明实施例4制备的甲硝唑电化学传感器测定蜂蜜中甲硝唑含量。测定前，将CPE/HDL-MIP浸入5.0mL蜂蜜供试液中，开路电位、磁力搅拌下预富集10分钟，取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将其放入一装有空白BR缓冲液(5.0mL，pH6.0)的三电极电解池中，以CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极。DPV法测定，扫描0.0V至-1.0V范围，脉冲幅度120mV，脉冲宽度为120ms，电位增量为8mV。用与实例7相一致的方法，从DPV曲线-0.4V处读出对应于甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出甲硝唑浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例供试的蜂蜜中未检出甲硝唑。

分别在上述未检出甲硝唑的蜂蜜中加入两个不同浓度的甲硝唑标准液，然后用本传感器测定加标后蜂蜜中甲硝唑含量。加标值分别为30.0和100.0μmol·L^-1，实际测得值(三次测定的平均值)分别为29.8和102.9μmol·L^-1。平均加标回收率分别为99.3％和102.9％，相对标准偏差分别为4.5％和3.0％。

实施例11：基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器在测定奶粉中甲硝唑含量中的应用。

本实例采用实施例5制备的甲硝唑电化学传感器测定奶粉(购于本地超市)中的甲硝唑含量。

第一步，建立校正曲线及校正曲线方程，方法与实例7相同。

第二步，称取1.000克奶粉入20mL聚丙烯离心管中，加入体积比为1:1的乙腈-水混合液8mL，35℃超声30分钟，以每分钟3500转速离心10min，上清液过0.45μm滤膜，将滤液在氮气保护下蒸发至干，残留物用pH 3.5的BR缓冲液溶解并定容至5.0mL，作为供试液。

第三步，含量测定。用本发明实施例5制备的甲硝唑电化学传感器测定奶粉中甲硝唑含量。测定前，将CPE/HDL-MIP浸入5.0mL奶粉供试液中，开路电位、磁力搅拌下预富集10分钟，取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将其放入一装有空白BR缓冲液(5.0mL，pH 3.5)的三电极电解池中，以CPE/HDL-MIP作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂盘电极为对电极。DPV法测定，扫描0.0V至-1.0V范围，脉冲幅度140mV，脉冲宽度为180ms，电位增量为18mV。从DPV曲线-0.4V处读出对应于甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。用与实例7相一致的方法，将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出甲硝唑浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例测试的奶粉中未检出甲硝唑。

在上述未检出甲硝唑的奶粉中分别加入已知量的甲硝唑标准液，使加标后的奶粉供试液中甲硝唑含量分别为1.0μmol·L^-1和20.0μmol·L^-1，实际测得值(三次测定的平均值)分别为1.0μmol·L^-1和19.8μmol·L^-1。平均加标回收率分别为100.0％和99.0％，相对标准偏差为4.7％和3.5％。

实施例12：基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器在测定饲料中甲硝唑含量中的应用。

本实例采用实施例6制备的甲硝唑电化学传感器测定饲料(购于衡阳创新生物科技有限公司)中的甲硝唑含量。

第一步，建立校正曲线及校正曲线方程，方法与实例7相同。

第二步，饲料样品溶液的制备。将1.000g的饲料加入10mL聚丙烯离心管中，再向其中加入7.5mL乙酸乙酯，涡旋1分钟，然后以每分钟3500转速离心10min，上清液过0.45μm滤膜，将滤液在氮气保护下蒸发至干，残留物用pH 4.0的BR缓冲液溶解并定容至5.0mL，作为供试液。

第三步，含量测定。用本发明实施例6制备的甲硝唑电化学传感器测定饲料中甲硝唑含量。测定前，将CPE/HDL-MIP浸入5.0mL饲料供试液中，开路电位、磁力搅拌下预富集10分钟，取出电极，用蒸馏水小心洗去可能吸附的杂质，氮气干燥。然后将其放入一装有空白BR缓冲液(5.0mL，pH 4.0)的三电极电解池中，以HDL-MIP/CPE为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极。用DPV法测定，扫描0.0V至-1.0V范围，脉冲幅度120mV，脉冲宽度为150ms，电位增量为20mV。用与实例7相一致的方法，从DPV曲线-0.4V处读出对应于甲硝唑的阴极还原峰电流I_p。将该I_p值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将I_p值代入校正曲线方程，计算出甲硝唑浓度c。平行三次的测定结果表明，本实例测试的饲料中未检出甲硝唑。

在上述未检出甲硝唑的饲料中分别加入已知量的甲硝唑标准液，使加标后的饲料供试液中甲硝唑含量分别为5.0μmol·L^-1和30.0μmol·L^-1，实际测得值(三次测定的平均值)分别为5.2μmol·L^-1和29.8μmol·L^-1。平均加标回收率分别为104.0％和99.3％，相对标准偏差为3.9％和3.1％。

Claims (7)

1.一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其特征是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比74～94:26～6在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13～17圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为100～140mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30～50℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为1～3：2～10：40～100：10～18：2～8：1～2；取此溶胶5～20μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

2.根据权利要求1所述的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其特征是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比75:25在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13～14圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为100～110mol·L^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30～35℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为1～1.5：2～4：40～50：10～12：2～3：1～1.2；取此溶胶5～10μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

3.根据权利要求1所述的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，其特征是采用如下方法制成的：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比92:10在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描16～17圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为130～140mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，45～50℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为2.5～3：8～10：90～100：17～18：7～8：1.8～2；取此溶胶15～20μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

4.一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其特征是包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比74～94:26～6在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13～17圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为100～140mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30～50℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为1～3：2～10：40～100：10～18：2～8：1～2；取此溶胶5～20μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

5.根据权利要求4所述的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其特征是包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比75:25在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描13～14圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为100～110mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，30～35℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为1～1.5：2～4：40～50：10～12：2～3：1～1.2；取此溶胶5～10μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

6.根据权利要求4所述的基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的制备方法，其特征是包括如下步骤：

一、制备碳糊电极：将石墨粉和石蜡油以重量比92:10在研钵中充分混匀成碳糊，然后将其紧密填充入聚丙烯塑料管中，管子的一端插入导线作为外电路连接点，将另一端端面的碳糊打磨成光滑的镜面，制成碳糊电极；

二、制备表面含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜碳糊电极：将上述制备的碳糊电极置于含0.08～0.12mol·L^-1功能单体AMTEOS的0.15～0.25mol·L^-1硫酸溶液中，电位循环扫描16～17圈，电位扫描范围为-0.8～1.2V，扫描速率为130～140mV·s^-1，在电极表面沉积含烷氧硅基的聚苯胺型导电膜，所得电极简称为导电膜碳糊电极，用乙醇洗涤备用；

三、制备双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)：首先按配比将氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)、2-乙氧基乙醇与含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液混合，45～50℃搅拌至均匀；然后加入0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水，再搅拌至溶胶形成；APTMS、TEOS、2-乙氧基乙醇、含0.01～0.05mol·L^-1甲硝唑的2-乙氧基乙醇溶液、0.1mol·L^-1NaOH溶液和去离子水的体积配比为2.5～3：8～10：90～100：17～18：7～8：1.8～2；取此溶胶15～20μL滴涂到第二步制备的导电膜碳糊电极表面，室温下静置过夜、使电极表面修饰层发生水解-缩聚反应，形成双层异质分子印迹聚合物膜，同时使溶剂蒸发；最后，将该电极用有机溶剂反复清洗，直至甲硝唑被完全洗除干净，得到双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)；

四、组装基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器：将第三步制备的双层异质分子印迹聚合物膜修饰碳糊电极(CPE/HDL-MIP)与具有差分脉冲伏安扫描功能的电化学装置连接，即组装成本发明基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器，本发明传感器采用常规三电极系统，CPE/HDL-MIP作为工作电极。

7.一种基于新型印迹识别的甲硝唑电化学传感器的应用，其特征是应用在医药、临床、食品及其相关产品硝基咪唑类药物监测中。