CN110044987A - 二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测肌钙蛋白的方法 - Google Patents

二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测肌钙蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测肌钙蛋白的方法，本专利通过利用纳米材料高比表面积、高导电性、好的生物相容性等优点，结合免疫化学、电化学与计算机等技术，在检测限等分析评价指标上取得了很好的效果。在心脏标志物的快速、准确、高效分析及设备微型化发展上显示出了其它方法无可比拟的优势；同时电化学适配体传感器具有检测速度快，灵敏度高，特异性强，简单便携，成本效益相对较低和微型化等特点，在肌钙蛋白检测领域展现出较好的应用前景。

Description

二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测 肌钙蛋白的方法
技术领域
本发明涉及电化学传感领域，尤指一种二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法及其电化学检测肌钙蛋白的方法。
背景技术
肌钙蛋白(Cardiac troponin,cTn)是肌肉组织收缩的调节蛋白，位于收缩蛋白的细肌丝上，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要的调节作用。近年大量研究已表明，肌钙蛋白与急性心肌梗死(AMI)的发生密切相关，可作为AMI的特异生物标志物。因此建立快速、准确、灵敏的肌钙蛋白检测技术对AMI的早期预警和治疗具有重要意义。
目前主要的心脏标志物(肌钙蛋白等)检测技术主要包括干化学法、免疫测定(免疫层析试验、斑点金免疫渗滤试验)和生物传感技术等。但是，由于心脏生物标志物在病人，特别是早期心脑血管疾病患者实际血样中含量较低，且实际血液样品成分复杂，使得这些检测方法难以满足标志物高灵敏、高选择性检测的要求，其检测灵敏度较低，选择性差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择性高、检测灵敏度较高的二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法。
本发明的另一目的在于提供二茂铁基共价有机框架修饰电极在电化学传感上的应用。
为了达成上述目的，本发明的解决方案为：二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法，其特征在于：
步骤一：将1～20mmol/L2,3,6,7,10,11-六羟基三亚苯水溶液和1～20mmol/L硼酸二茂铁的水溶液按照体积比1:3混合，15～50℃下恒温反应8～24h，得到的混合液标记为混合液A；
步骤二：COF修饰电极制备：将预处理过的金电极先滴涂3～20μL浓度为1～20mmol/L对巯基苯硼酸乙醇溶液，室温下晾干，重复滴涂、晾干3～6次后，用蒸馏水淋洗；再将电极上滴涂3～20μL混合液A，室温下晾干，重复滴涂、晾干3～6次，蒸馏水淋洗，得到共价有机框架/金电极，记为修饰电极1；
步骤三：然后将修饰电极1滴涂3～20μL浓度为1～20mmol/L的MCH，室温下晾干，重复滴涂3～6次，蒸馏水淋洗，得到修饰电极2；
步骤四：滴涂5～20μL浓度为1～1000nmol/L的Tro4单链探针于修饰电极2上；并在15～50℃恒温反应30～90min，然后，在混合磷酸盐缓冲液中浸泡1～20min，得到二茂铁基共价有机框架修饰电极。
进一步，所述步骤二中所述金电极的预处理工艺为：金电极依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉抛光，然后将金电极放置于去离子水、乙醇和水体积比为1:1的乙醇溶液、去离子水中各超声5min，再将金电极浸泡在H2SO4:H2O2体积比为7:3的溶液中活化20min，活化后将金电极放置在0.5M H2SO4溶液中用循环伏安法扫描，扫描区间为-0.2～+1.5V，扫速100mV/s，扫描50圈，最后用大量水冲洗电极至中性，用N2N2吹干金电极表面。
进一步，所述Tro4单链探针与目标肌钙蛋白特异性结合，其序列为:5’-CGTG CAGTACGC CAAC CTTT CTCA TGCG CTGC CCCT CTTA-3’。
进一步，所述步骤四中修饰电极2滴涂Tro4单链探针后，随后的恒温反应的反应条件为在12μL对巯基苯硼酸、12μL硼酸二茂铁-六羟基三亚苯混合液中富集时间为60min。
以上所得二茂铁基共价有机框架修饰电极的电化学检测肌钙蛋白的方法：
步骤一：将所得二茂铁基共价有机框架修饰电极用超纯水淋洗，在某一浓度肌钙蛋白富集30～90分钟后，在混合磷酸盐缓冲液中测得的差分脉冲曲线；
步骤二：将肌钙蛋白浓度依次递增，得到多个差分脉冲曲线，将多个差分脉冲曲线的峰电流Ip与对应的肌钙蛋白的浓度作图，得出差分脉冲曲线峰电流Ip与肌钙蛋白浓度的线性关系；
步骤三：检测测试样时，测得相同条件下的差分脉冲曲线的峰电流Ip，利用步骤二所得线性关系定量分析测试样中的肌钙蛋白含量。
进一步，将二茂铁基共价有机框架修饰电极用超纯水淋洗，加所需测含量的肌钙蛋白富集30～90分钟后，在混合磷酸盐缓冲液中测得的差分脉冲曲线，当肌钙蛋白浓度在100fg/mL～10ng/mL的浓度范围内时，其差分脉冲曲线的峰电流Ip与肌钙蛋白浓度对数lgC肌钙蛋白呈良好的线性关系，线性回归方程为Ip(10-9A)＝-2.60-0.081lg(C肌钙蛋白/g/mL)，相关性系数为r＝0.997，能在此浓度范围内对肌钙蛋白进行定量分析。
进一步，所述该方法的检测下限为100fg/mL。
进一步，所述步骤一中将所得二茂铁基共价有机框架修饰电极用超纯水淋洗，加某一浓度肌钙蛋白富集30～90分钟后，得到修饰电极4，将此修饰电极4作为工作电极，银氯化银作为参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，在混合磷酸盐缓冲液中进行微分脉冲伏安检测，测得差分脉冲曲线。
进一步，所述混合磷酸盐缓冲液为1～20mmol/L、pH为5.0～9.0的磷酸盐缓冲溶液
本专利通过利用纳米材料高比表面积、高导电性、好的生物相容性等优点，结合免疫化学、电化学与计算机等技术，在检测限等分析评价指标上取得了很好的效果。在心脏标志物的快速、准确、高效分析及设备微型化发展上显示出了其它方法无可比拟的优势；同时电化学适配体传感器具有检测速度快，灵敏度高，特异性强，简单便携，成本效益相对较低和微型化等特点，在肌钙蛋白检测领域展现出较好的应用前景。
采用上述方案后，因共价有机框架材料是一种结构较为稳定的新型晶形多孔材料,具有孔径分布明确、比表面积较大、导电性较强等特点,易于对各类功能分子或蛋白质等进行修饰和吸附。
电化学适配体传感器将寡核苷酸(DNA)反应的特异性和电化学仪器的灵敏性相结合，以适配体与目标物特异性结合为基础，将核酸适配体作为识别元件或检测对象，通过换能器的作用使发生在适配体分子特异性识别中产生的信号转化为电学信号。
附图说明
图1为本专利示意图；
图2为修饰电极1(a)、修饰电极2(b)、修饰电极3(c)、和修饰电极4(d)在检测液(1～20mmol/L、pH5.0～9.0的磷酸盐缓冲溶液)中的微分脉冲伏安图；
图3为修饰电极1在检测液中的不同扫速循环伏安图。
图4为Tro4单链探针与不同浓度CnTnI杂交的差分脉冲伏安图；
图5为修饰电极2在适配体DNA与不同蛋白质杂交后的差分脉冲伏安曲线氧化峰电流值柱状图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明做详细描述。
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，电化学实验在CHI650C型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)进行。
二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备：
A)根据权利要求设计一条Tro4单链探针,能与目标肌钙蛋白特异性结合，所述Tro4单链探针的Tro4单链探针探针序列为:5’-CGTG CAGT ACGC CAAC CTTT CTCA TGCGCTGC CCCT CTTA-3’；
B)金电极预处理：将金电极依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉抛光，然后将金电极放置于去离子水、乙醇和水体积比为1:1的乙醇溶液、去离子水中各超声5min，再将金电极浸泡在H2SO4:H2O2体积比为7:3的piranha溶液中活化20min，活化后将金电极放置在0.5M H2SO4溶液中用循环伏安法扫描，区间为-0.2～+1.5V，扫速100mV/s，扫描50圈，最后用大量水冲洗电极至中性，用N2吹干金电极表面，备用。
C)将1～20mmol/L 2,3,6,7,10,11-六羟基三亚苯水溶液和1～20mmol/L硼酸二茂铁的水溶液按照体积比1:3混合，15～50℃下恒温反应8～24h，得到的混合液标记为混合液A；
D)共价有机框架/金电极制备：将预处理过的金电极先滴涂3～20μL浓度为1～20mmol/L对巯基苯硼酸乙醇溶液，室温下晾干，重复滴涂、晾干3～6次后，用蒸馏水淋洗；再将电极上滴涂3～20μL混合液A，室温下晾干，重复滴涂、晾干3～6次，蒸馏水淋洗，得到共价有机框架/金电极，记为修饰电极1；
E)将修饰电极1滴涂3～20μL 1～20mmol/L 6-巯基己醇，室温下晾干，重复滴涂3～6次，蒸馏水淋洗，得到修饰电极2；
F)滴涂5～20μL浓度为1～1000nmol/L的Tro4单链探针于修饰电极2上，并在15～50℃恒温反应30～90min，然后，在混合磷酸盐缓冲液中浸泡1～20min，得到二茂铁基共价有机框架修饰电极(传感器)，记为修饰电极3；所述Tro4单链探针与目标肌钙蛋白特异性结合，其序列为:5’-CGTG CAGT ACGC CAAC CTTT CTCA TGCG CTGC CCCT CTTA-3’；
G)在修饰电极3上滴涂5～20μL0.001～1000pg/mL肌钙蛋白溶液中,15～50℃反应30～90min，在混合磷酸盐缓冲液中浸泡1～20min，得到修饰电极4。
如图1所示,单链核酸适配体(Tro4)能有效吸附在该共价有机框架修饰电极表面且引起聚合物电化学响应的明显变化，引起电化学信号减少；而当适配体修饰电极进一步与目标分子(肌钙蛋白CnTnI)作用后，核酸适配体由于构象改变从电极表面脱落，使修饰电极信号恢复,达到对肌钙蛋白的检测。
一：各修饰电极的电化学行为
将所得修饰电极1、修饰电极2、修饰电极3和修饰电极4分别置于检测液(1～20mmol/L、pH5.0～9.0的磷酸盐缓冲溶液)中进行微分脉冲伏安测试；从微分脉冲伏安图(图2)可发现，修饰电极1在检测液中有一个良好的氧化峰a，说明共价有机框架已经被成功自组装在电极表面，形成具有电活性的共价有机框架聚合物；当共价有机框架/金电极滴涂上6-巯基己醇后，6-巯基己醇封闭了金电极裸露的位点，电流少量降低，如图2氧化峰b；当6-巯基己醇/共价有机框架/金电极滴涂Tro4单链探针时，Tro4单链探针裸露的碱基与共价有机框架的三苯环发生π-π堆积作用，对共价有机框架电子转移造成扰动，使其电流减小，如图2氧化峰c；当Tro4单链探针-6-巯基己醇/共价有机框架/金电极与肌钙蛋白反应后,肌钙蛋白与Tro4单链探针特异性结合，造成Tro4单链探针构象发生改变，肌钙蛋白与Tro4单链探针从电极表面脱落，共价有机框架电子扰动效应消失，如图2的d曲线，电流变大，信号曲线有恢复的趋势。
二：共价有机框架配合物在电极表面的电化学行为
将共价有机框架/金电极(修饰电极1)置于检测液中检测不同扫速的循环伏安曲线，如图3中a到l的扫速依次为：10,20,40,60,80,100,150,200,250,300,350,400mV/s，插图为其氧化还原峰电流值(Ip)与扫描速率(v)线性关系图，线性回归方程为Ipa(10-9A)＝0.29+1.38v，r＝0.982；Ipc(10-9A)＝-1.85-30.99v,r＝0.990。电流值(Ip)与扫描速率(v)呈线性关系，说明电极表面的反应主要是受吸附作用控制，同时也说明已成功合成硼酸二茂铁-六羟基三亚苯聚合物。
三：二茂铁基共价有机框架修饰电极的分析性能
修饰电极2滴涂Tro4单链探针反应后，在12μL对巯基苯硼酸，12μL硼酸二茂铁-六羟基三亚苯混合液中富集60分钟；再滴加肌钙蛋白富集60min后，超纯水淋洗，得到修饰电极4，将此修饰电极4作为工作电极，银氯化银作为参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，在检测液中进行微分脉冲伏安检测，测得的差分脉冲曲线，改变肌钙蛋白浓度，分别在检测液中测得的差分脉冲曲线，考察二茂铁基共价有机框架修饰电极的分析灵敏度；
使用不同浓度肌钙蛋白重复以上反应得到多个差分脉冲曲线，如图4A为不同浓度肌钙蛋白所测得的杂交的差分脉冲伏安图，a到f分别对应肌钙蛋白的浓度为100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL，从图4A可以看出，随着肌钙蛋白浓度的升高，氧化峰电流强度逐渐增大。
具体如下表一:
表一
浓度 100fg/mL 1pg/mL 10pg/mL 100pg/mL 1ng/mL 10ng/mL
Log浓度 -13 -12 -11 -10 -9 -8
电流(A) -1.555×10<sup>-7</sup> -1.64×10<sup>-7</sup> -1.719×10<sup>-7</sup> -1.82×10<sup>-7</sup> -1.878×10<sup>-7</sup> -1.943×10<sup>-7</sup>
根据上表数据发现在100fg/mL～10ng/mL的浓度范围内，峰电流Ip与肌钙蛋白浓度对数(lgC肌钙蛋白)呈良好的线性关系(图4B)，其线性回归方程为Ip(10-9A)＝-2.60-0.081lg(C肌钙蛋白/g/mL)，相关性系数为r＝0.997，表明该二茂铁基共价有机框架修饰电极能在此浓度范围内对肌钙蛋白进行定量分析，该二茂铁基共价有机框架修饰电极的检测下限为100fg/mL。
四、进一步通过改变蛋白质，考察了该二茂铁基共价有机框架修饰电极的杂交选择性
将肌钙蛋白CnTn1替换为对照组蛋白质(牛血蛋白BSA、肌红蛋白MB、肌钙蛋白及牛血蛋白和肌红蛋白混合液)，进一步通过改变蛋白质，考察了二茂铁基共价有机框架修饰电极的杂交选择性。实验中，先将Tro4单链探针滴涂在多个修饰电极2上反应30～90min，再在不同修饰电极2上分别滴涂牛血蛋白(c＝1～100pg/mL)、肌红蛋白(c＝1～100pg/mL)、肌钙蛋白(c＝1～100pg/mL)及牛血蛋白和肌红蛋白混合液，反应30～90min后，超纯水淋洗，在检测液(1～20mmol/L磷酸盐(PBS,pH5.0～9.0)缓冲溶液)混合磷酸盐缓冲液中测得的差分脉冲曲线。由图5可知目标物为牛血蛋白BSA和肌红蛋白MB牛血蛋白和肌红蛋白时修饰电极上的峰电流与空白液)中的峰电流差值几乎为0，这是因为牛血蛋白BSA和肌红蛋白MB蛋白质并未与Tro4单链探针发生特异性吸附，在此电极上的峰电流值几乎不变；由于肌钙蛋白与Tro4单链探针发生特异性吸附，核酸适配体由于构象改变从电极表面脱落，使修饰电极信号恢复，导致因此修饰电极4的峰电流增大。；当Tro4单链探针与肌钙蛋白及牛血蛋白和肌红蛋白混合液混合液反应时，与混合液中的肌钙蛋白发生特异性吸附，导致其峰电流与只含有肌钙蛋白CnTn1的电流值大致相同，由此说明，该二茂铁基共价有机框架修饰电极对不同蛋白质具有良好的选择特异性，能对肌钙蛋白进行特异性检测。
五、实际样品检测
为检测该二茂铁基共价有机框架修饰电极对实际样品的分析检测能力，采用修饰电极3对实际样品进行检测。
从漳州市医院得到人体血清样品，采用标准加入法，分别在血清内加入0、0.01、0.5、1、5ng/L肌钙蛋白制成肌钙蛋白样品,分别滴加所述肌钙蛋白样品富集30～90min后，超纯水淋洗，得到修饰电极4，将此修饰电极4作为工作电极，银氯化银作为参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，在检测液中进行微分脉冲伏安检测，测得的差分脉冲曲线，读取每次差分脉冲曲线的峰电流值填入下表二，把峰电流值代入上述第三部分中所得的线性关系函数可计算出肌钙蛋白浓度对数(lgC肌钙蛋白)，进而求出检测量。
表二
由表二可知，该实施例的回收率在95％～105％内，符合误差范围要求，因此本实验方法可靠可行。
以上所述仅为本发明的实施例，并非对本案设计的限制，凡依本案的设计关键所做的等同变化，均落入本案的保护范围。

Claims (9)

1.二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法，其特征在于：
步骤一：将1～20mmol/L 2,3,6,7,10,11-六羟基三亚苯水溶液和1～20mmol/L硼酸二茂铁的水溶液按照体积比1:3混合，15～50℃下恒温反应8～24h，得到的混合液标记为混合液A；
步骤二：COF修饰电极制备：将预处理过的金电极先滴涂3～20μL浓度为1～20mmol/L对巯基苯硼酸乙醇溶液，室温下晾干，重复滴涂、晾干3～6次后，用蒸馏水淋洗；再将电极上滴涂3～20μL混合液A，室温下晾干，重复滴涂、晾干3～6次，蒸馏水淋洗，得到共价有机框架/金电极，记为修饰电极1；
步骤三：然后将修饰电极1滴涂3～20μL浓度为1～20 mmol/L的MCH，室温下晾干，重复滴涂3～6次，蒸馏水淋洗，得到修饰电极2；
步骤四：滴涂5～20μL浓度为1～1000nmol/L的Tro4单链探针于修饰电极2上；并在15～50℃恒温反应30～90min，然后，在混合磷酸盐缓冲液中浸泡1～20min，得到二茂铁基共价有机框架修饰电极。
2.如权利要求1所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法，其特征在于：步骤二中所述金电极的预处理工艺为：金电极依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉抛光，然后将金电极放置于去离子水、乙醇和水体积比为1:1的乙醇溶液、去离子水中各超声5min，再将金电极浸泡在H2SO4:H2O2体积比为7:3的溶液中活化20min，活化后将金电极放置在0.5M H2SO4溶液中用循环伏安法扫描，扫描区间为-0.2～+1.5V，扫速100mV/s，扫描50圈，最后用大量水冲洗电极至中性，用N2吹干金电极表面。
3.如权利要求1所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法，其特征在于：所述Tro4单链探针与目标肌钙蛋白特异性结合，其序列为: 5’-CGTG CAGT ACGC CAAC CTTTCTCA TGCG CTGC CCCT CTTA-3’。
4.如权利要求1所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的制备方法，其特征在于：步骤四中修饰电极2滴涂Tro4单链探针后，随后的恒温反应的反应条件为在12μL对巯基苯硼酸、12μL硼酸二茂铁-六羟基三亚苯混合液中富集60min。
5.如权利要求1至4任一项制备方法所得二茂铁基共价有机框架修饰电极的电化学检测肌钙蛋白的方法，其特征在于：
步骤一：将所得二茂铁基共价有机框架修饰电极用超纯水淋洗，在某一浓度肌钙蛋白富集30～90分钟后，在混合磷酸盐缓冲液中测得的差分脉冲曲线；
步骤二：将肌钙蛋白浓度依次递增，得到多个差分脉冲曲线，将多个差分脉冲曲线的峰电流I p与对应的肌钙蛋白的浓度作图，得出差分脉冲曲线峰电流I p与肌钙蛋白浓度的线性关系；
步骤三：检测测试样时，测得相同条件下的差分脉冲曲线的峰电流I p，利用步骤二所得线性关系定量分析测试样中的肌钙蛋白含量。
6.如权利要求5所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的电化学检测肌钙蛋白的方法，其特征在于：将二茂铁基共价有机框架修饰电极用超纯水淋洗，加所需测含量的肌钙蛋白富集30～90分钟后，在混合磷酸盐缓冲液中测得的差分脉冲曲线，当肌钙蛋白浓度在100fg/mL～10ng/mL的浓度范围内时，其差分脉冲曲线的峰电流I p与肌钙蛋白浓度对数lgC 肌钙蛋白呈良好的线性关系，线性回归方程为I p(10-9A)=-2.60-0.081lg(C肌钙蛋白/g/mL)，相关性系数为r=0.997，能在此浓度范围内对肌钙蛋白进行定量分析。
7.如权利要求5所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的电化学检测肌钙蛋白的方法，其特征在于：该方法的检测下限为100fg/mL。
8.如权利要求5所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的电化学检测肌钙蛋白的方法，其特征在于：步骤一中将所得二茂铁基共价有机框架修饰电极用超纯水淋洗，加某一浓度肌钙蛋白富集30～90分钟后，得到修饰电极4，将此修饰电极4作为工作电极，银氯化银作为参比电极和铂丝对电极构成三电极体系，在混合磷酸盐缓冲液中进行微分脉冲伏安检测，测得差分脉冲曲线。
9.如权利要求5所述的二茂铁基共价有机框架修饰电极的电化学检测肌钙蛋白的方法，其特征在于：混合磷酸盐缓冲液为1～20mmol/L、pH为5.0～9.0的磷酸盐缓冲溶液。
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