CN111239213B - 一种共价有机骨架材料原位修饰电极及电化学生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共价有机骨架材料原位修饰电极及电化学生物传感器，属于电化学检测领域。本发明以ABA和En作为连接体，在玻碳电极表面原位生长共价有机骨架材料TpBD，从而构建得到原位共价修饰TpBD的电极，并通过引入磁性纳米粒子作为信号探针载体，基于适体和黄曲霉毒素M1之间的特异性结合作用，以制备的TpBD键合的玻璃碳电极作为工作电极，构建电化学生物传感器。本发明电化学生物传感器能够高选择性和高灵敏测定黄曲霉毒素M1，检测限为0.15ng/mL，且具有良好的稳定性，在室温下保存15天后，仍可保留初始信号的76％，可广泛应用在电化学领域中。

Description

一种共价有机骨架材料原位修饰电极及电化学生物传感器

技术领域

本发明属于电化学检测领域，具体涉及一种共价有机骨架材料原位修饰电极及电化学生物传感器。

背景技术

COFs是由C、H、O、N、B、Si等轻质元素组成的有机构成单元通过强烈的共价键连接形成的结晶多孔有机骨架材料。自从其在2005年被首次合成以来，作为一种新型多孔纳米材料，由于其卓越的物理和化学特性，如低密度、高热稳定性和化学稳定性、高机械强度、孔径可调及大的π-π共轭体系，在气体储存、催化、吸附、分离及光电传感等领域表现出超好的应用性能，且在生物医学平台，包括药物传递、杀菌、生物成像、治疗等极具发展前景。

近年来，COFs作为一种电极材料在电化学领域的应用逐渐引起了关注。如Zhang等将TAPB-DMTP-COFs@金纳米粒子复合物滴涂在电极表面，并以壳聚糖为固定剂将复合物固定在电极表面，构建了一种电化学传感器用于检测绿原酸；Zhang等在TB-Au-COFs(TB为电子介体甲苯胺蓝)表面修饰心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)抗体并作为信号放大分子，将其滴涂在孵育有cTnⅠ抗体-cTnⅠ的电极表面，构建了电化学免疫传感器，用于对cTnⅠ的灵敏检测。

然而目前COFs在电化学传感器中的应用都是采用滴涂的方式固定在电极表面，这种方法的缺点是对吸附材料的量的控制受到局限，并且稳定性差，容易造成COFs材料的脱落，这极大地降低了传感器的稳定性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过特定方法在电极表面原位生长共价有机骨架材料TpBD，并通过引入磁分离过程，制备了一种用于检测乳制品中黄曲霉毒素M1的电化学生物传感器。

本发明的第一个目的是提供一种电化学生物传感器，所述电化学生物传感器的制备方法包括如下步骤：

(1)制备工作电极：

电极预处理：预先利用氧化铝粉末对玻碳电极(GCE)进行抛光，然后进行超声清洗；将处理好的电极置于对氨基苯甲酸缓冲液中进行电聚合，结束后将其放置于乙二胺溶液中，得到表面修饰有氨基的玻碳电极；

电极表面原位生长TpBD：将表面修饰有氨基的工作电极置于含1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)的溶液中，室温反应1-2h后取出电极，清洗除去游离的Tp单体，得到修饰有单体Tp的电极(记为Tp-GCE)；然后将所得Tp-GCE置于含有1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)和联苯胺(BD)的溶液中，室温下进行反应，得到表面键合有共价有机骨架材料TpBD的玻碳电极(记为TpBD-GCE)；

(2)制备信号探针修饰的磁纳米粒子：首先将羧基化磁纳米粒子活化，然后加入氨基修饰的目标物质相应的适配体，基于羧基与氨基间的作用将适配体链修饰在磁珠上，磁分离后，加入修饰有电活性分子二茂铁的信号探针，根据碱基互补配对原则，将信号探针结合在适配体链上，得到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液；

(3)向步骤(2)所得的信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物溶液中加入目标物质样品，目标物质与适配体结合而将信号探针竞争下来；

(4)将步骤(1)所得的TpBD-GCE工作电极浸入到步骤(3)的溶液中，形成电化学生物传感器。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的氧化铝为0.3和/或0.05μm的氧化铝粉末。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的超声处理是利用硝酸、乙醇和水的混合体系进行处理。其中硝酸由体积比为1：3的浓硝酸和水配制得到。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的电聚合是在0.4V～1.2V的电位区间内，采用循环伏安法，以10mV/s的扫描速度进行。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的缓冲液为PBS缓冲液(10mmol/L，pH7.4；10mmol/L KCl为支持电解质)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的电聚合试剂为对氨基苯甲酸(ABA)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)是将1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)溶于乙醇中，并将表面修饰有氨基的工作电极置于该溶液中，室温搅拌2h原位生长Tp，得到修饰Tp的工作电极(记为Tp-GCE)。

在本发明的一种实施方式中，含Tp的溶液中Tp的浓度为15mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)是将所得Tp-GCE置于含有1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)和联苯胺(BD)的溶液中；其中Tp与BD的摩尔比为Tp:BD为1:1.5，室温下进行反应，得到表面键合有有机骨架材料TpBD的玻碳电极。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的羧基化的磁纳米粒子是对商业化的羧基磁纳米粒子进行活化处理。具体是利用含NaCl(0.3M)的PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)对羧基-磁纳米粒子进行清洗，清洗后分散在PBS中；然后加入含有EDC和NHS的盐酸咪唑溶液，室温孵育。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的信号探针与适配体通过碱基互补配对进行结合。

本发明的第二个目的是将共价修饰的电极应用于电化学检测领域中。

本发明的第三个目的是提供一种检测黄曲霉毒素M1含量的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)构建上述的电化学-生物传感器，将不同浓度的黄曲霉毒素M1加入到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液中，磁分离后，取上清液；将制备的TpBD-GCE工作电极浸入上清液中，取出后采用差分脉冲伏安法在PBS缓冲液中进行电化学测试；以所得峰电流值与黄曲霉毒素M1的浓度构建线性关系，即得黄曲霉毒素M1的标准曲线；

(b)利用未知黄曲霉毒素M1含量的待测样品测得相应的峰电流值，根据步骤(1)所得的标准曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素M1的含量。

在本发明的一种实施方式中，用于检测AFM1的氨基修饰的适配体为5’-NH₂-C₆-GATACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT。

在本发明的一种实施方式中，用于检测AFM1的信号探针为5’-ATG TGG AAA ATCT-3’Ferrocene。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(a)中是将不同浓度的黄曲霉毒素M1加入到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液中，37℃孵育1h；然后磁分离、取上清液，将TpBD-GCE工作电置于清液中室温反应0.5-3h，取出，使用差分脉冲伏安法在0.1M PBS缓冲液中进行电化学测试，电位范围为0V～0.4V。

本发明有益效果：

本发明电化学生物传感器的稳定性较好，在铁氰化钾溶液中连续扫描50圈，发现信号几乎没有变化；并且室温放置15天后，传感器保持初始信号的76％。

本发明电化学生物传感器具有较好的检测灵敏度。本发明电化学生物传感器用于检测AFM1，能够在0.5ng/mL～80ng/mLAFM1浓度范围内，将峰电流与AFM1的浓度构建线性模型，相关系数为0.981，检测限为0.15ng/mL(S/N＝3)；对AFM1进行加标回收试验，回收率在80.74％～111.22％(n＝3)之间，表明该电化学传感器对AFM1检测是非常准确可靠的。此外，还能够实现对AFM1高选择性的检测。

附图说明

图1：(A)为玻碳电极表面原位生长TpBD的示意图；(B)为基于TpBD-GCE的AFM1电化学生物传感器示意图。

图2：(A)、(B)分别为GCE，ABA-GCE，En-ABA-GCE，Tp-GCE和TpBD-GCE分别在1mM[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中的CV图和EIS图；(C)为GCE在10mM pH 7.4的PBS(含1.0Mm ABA和10.0mMKCl)中的CV图。

图3：为GCE、ABA溶液、ABA-GCE、En溶液、En-ABA-GCE、Tp-GCE和TpBD-GCE的拉曼光谱图；以及TpBD的SEM图，右上角为GCE的SEM图。

图4：(A)为基于TpBD-GCE作为工作电极构建的电化学生物传感器对不同浓度的AFM1的DPV响应；(B)为AFM1标准曲线；(C)为传感器对AFM1的特异性对比图，干扰物为环丙沙星、葡萄糖、AFB1和OTA，干扰物浓度为1μg/mL。

图5：(A)为TpBD-GCE在0.1M[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中连续扫描50圈；(B)为TpBD-GCE在室温下的天数稳定性。

图6：不同Tp预处理时间对有机骨架材料共价修饰电极的影响。

具体实施方式

黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素(OTA)标准品购自J&K科学有限公司(中国北京)；AFM1-氨基适配体(5’-NH₂-C₆-GAT ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT)、信号探针(5’-ATG TGG AAA ATC T-3’Ferrocene)和羧基化磁珠(羧酸化磁纳米粒子)购自上海生工(中国上海)；对氨基苯甲酸(ABA)、乙二胺(En)、三(羟甲基)氨基甲烷和乙二胺四乙酸购自阿拉丁(中国上海)；联苯胺(BD)和1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp)购自麦克林(中国上海)；环丙沙星、葡萄糖、二甲基甲酰胺和乙醇等普通化学试剂购自国药试剂(中国上海)。

CHI 660C电化学工作站、玻碳电极、饱和甘汞电极、铂电极、麂皮均购自上海辰华仪器有限公司；Milli-Q Integral Cabinet 3超纯水系统(密里博公司，美国)；扫描电子显微镜(日立株式会社，日本)；共聚焦显微拉曼光谱仪(HORIBA Jobin Yvon S.A.S公司，法国)。

实施例1电化学生物传感器的制备

(1)工作电极的制备：

电极预处理：首先用0.3和0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上对玻碳电极(GCE)进行抛光处理，并用硝酸(浓硝酸：水，1：3，v/v)、乙醇和超纯水分别依次超声清洗30s、1min和1min后取出，氮气吹干备用。将处理好的电极置于含1.0mmol/L对氨基苯甲酸(ABA)的PBS(10mmol/L，pH 7.4；10mmol/L KCl为支持电解质)缓冲液中，在0.4V～1.2V的电位区间内，采用循环伏安法，以10mV/s的扫描速度电聚合2圈，乙醇清洗，氮气吹干，标记为ABA-GCE；接着将ABA-GCE浸入含0.1g/mL EDC、0.1g/mL NHS、2％(V/V)1,2-乙二胺(En)的PBS溶液(pH7.0)，静置30min后取出，乙醇清洗，氮气吹干，得到表面修饰有乙二胺的玻碳电极，标记为En-ABA-GCE，为TpBD的生长提供氨基基团。

电极表面原位生长TpBD：取1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp，0.30mmol)溶于20mL乙醇中，将En-ABA-GCE悬空置于该溶于中，室温搅拌2h原位生长Tp，得到修饰有TpBD单体Tp的Tp-En-ABA-GCE(记为Tp-GCE)，然后将电极取出，乙醇清洗表面未通过共价键结合的Tp；接下来将合成TpBD的单体1,3,5-三醛基间苯三酚(Tp，0.30mmol)和联苯胺(BD，0.45mmol)分别溶解于10mL乙醇，然后室温下在50mL烧杯中搅拌混合，并将上一步原位生长了Tp的玻碳电极悬于该溶液中，室温搅拌30min后得到修饰有TpBD的玻碳电极，反应结束后，将TpBD-En-ABA-GCE在二甲基甲酰胺和超纯水中浸泡，获得TpBD键合的GCE(记为TpBD-GCE)。

(2)制备DNA探针修饰的磁纳米粒子：

在磁纳米粒子上修饰核酸链之前，先用300μL含NaCl(0.3M)的PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)对60μL羧基-磁纳米粒子进行三次彻底清洗，然后分散到120μL PBS中备用。将EDC(0.4M)和NHS(0.1M)溶解于盐酸咪唑(0.1M,pH 6.8)，然后取500μL加入上述磁纳米溶液中，室温孵育30min以活化磁纳米粒子的羧基。活化后的磁纳米粒子用PBS洗两次，重新溶解于120μL PBS中；

然后，加入300μL氨基修饰的适配体链(1μM)，37℃反应12h。用PBS洗两次，获得的适配体/磁纳米粒子，重新分散于120μL PBS中。最后加入300μL信号探针，室温反应1h后用PBS彻底清洗，重新分散于120μL PBS中，得到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液。

(3)向步骤(2)所得的信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物溶液中加入黄曲霉毒素M1，黄曲霉毒素M1与适配体结合而将信号探针竞争下来；

(4)将步骤(1)所得的TpBD-GCE工作电极浸入到步骤(3)的溶液中，构成电化学生物传感器。

对制备过程中得到的TpBD-GC工作电极进行表征：

首先采用三电极体系：以修饰电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极，用循环伏安法(CV)和电化学阻抗法(EIS)，以1mM[Fe(CN)₆]^3-/4-(含0.1M KCl)为电解液，对TpBD-GCE组装过程中电极表面状态的变化进行表征，电化学阻抗(EIS)参数为：频率为0.01Hz～100KHz，信号振幅为5mV。结果如图2所示，裸GCE表面光滑，电子传导能力较快，氧化还原峰电流分别为23.33和-23.39μA，氧化还原峰电位差(ΔEp)为117mV，Ret为1412Ω；通过循环伏安发在电极表面组装上ABA，ABA氨基在0.82V左右发生单电子氧化转变为相应的阳离子自由基而产生不可逆的氧化峰(图2C)，从而通过C-N键连接在电极表面，电极表面电子传递受阻，导电性能降低，响应电流随之减小，氧化还原峰形较差，Ret为7185Ω，这可能是由于铁氰化物阴离子与带负电的ABA-GCE表面的静电排斥作用造成的；继续在ABA-GCE表面修饰En后，发现En-ABA-GCE的峰电流分别增加为22.16和-21.15μA，ΔEp变为182mV，Ret为3169Ω，这是由于铁氰化物阴离子与正电的En-ABA-GCE之间的静电吸引；最后，在电极表面原位生长COFs-TpBD后(记为COFs-TpBD/GCE)，氧化还原电流略微下降，ΔEp变为332mV，Ret为4830Ω，这可能是由于虽然COFs-TpBD的导电性能较差，且在有机溶剂中浸泡时间较长，但COFs-TpBD大的比表面积，以及其孔状结构加快了电极与[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液间的电子转移速率，表明COFs-TpBD成功修饰到电极表面。

采用拉曼光谱扫描对电极修饰过程进行了进一步的表征。从图3(左)可见，玻碳电极表面在～1600cm^-1和～1300cm^-1处有两个明显的峰，分别为G峰和D峰(D-峰和G-峰均是C原子晶体的Raman特征峰，分别在1300cm^-1和1580cm^-1附近，D-峰代表的是C原子晶的缺陷，G-峰代表的是C原子sp²杂化的面内伸缩振动)；修饰上对氨基苯甲酸分子后，ABA-GCE中1144cm^-1处的谱峰归属于对氨基苯甲酸中氨基的面外不对称摇摆振动，而C-H面外摇摆振动的谱峰(876cm^-1)消失，说明苯环不是以平躺的方式吸附在电极表面，而是通过氨基以直立的方式连接在玻碳电极表面。但是在继续修饰上乙二胺后我们发现在整个扫描范围内En-ABA-GCE表面没有任何峰(En溶液也没有任何峰)，但其强度高于ABA-GCE和GCE中的所有峰，这可能是由于En在电极表面形成一层膜而造成的；在Tp-GCE表面，在1641cm^-1处明显的峰归属于C＝O基团的对称伸缩振动，1442cm^-1处的峰属于C-C环面内变形振动，此外，1288cm^-1处的峰是来源于C＝O伸缩振动和H-C-H对称弯曲振动，表明在电极表面成功修饰Tp单体；COFs-TpBD/GCE中，1182cm^-1处的特征峰与C-N伸缩振动有关，1597cm^-1处强的峰属于C＝O键的对称伸缩振动，C＝C环伸缩振动位于1386cm^-1，这些结果进一步佐证了TpBD被成功修饰在电极表面。

此外还采用扫描电镜(SEM)对GCE和TpBD-GCE修饰电极形貌进行了表征，结果如图3(右)所示。与裸玻GCE相比(插图)，TpBD-GCE表面有球状、棒状TpBD，这与文献报道是一致的，表明TpBD被成功修饰到GCE表面。

实施例2电化学传感器的优化

(1)电极预处理条件优化：

对氨基苯甲酸修饰条件对所得共价骨架材料构建具有较大的影响。循环伏安法扫描速度为10mV/s，优化电聚合圈数。当电聚合圈数为1圈的话，聚合上的对氨基苯甲酸太少。当电聚合圈数为2圈时，对氨基苯甲酸能够充分聚合在电极表面，能够有效用于后续有机骨架构建。

(2)原位生长TPBD的条件优化：

考虑到玻碳电极(聚四氟乙烯材质玻碳电极使用温度一般不超60℃)不适合置于120℃高温条件下进行原位生长TpBD，所以，为了克服高温限制、实现电极在室温下原位构建骨架材料，申请进行了探究。在实验探索过程中，发现在电极表面连接上氨基之后，先通过Tp的醛基与电极表面的氨基进行共价连接单体Tp，Tp原位生长的时间对所得共价骨架材料构建具有较大的影响。

具体实验时，先以导电玻璃板作为电极基底为例，采用与实施例1同样的方法进行原位生长TpBD，仅将Tp预先作用的时间进行调整，结合图6可见，在室温60，90min原位生长Tp时，电极表面连接上较少的Tp；而150、180min时，基底表面Tp负载较厚，连接有较多的Tp单体，会阻碍电子在电极表面的转移。同样的，在后续电极表面修饰时，选择室温预先120min负载Tp构建的电极分布均匀，性能较佳；作用时间过低或者时间过高，电极表面无法获得均匀分布的共价骨架材料。

经过不断优化探索，发现适用于电极进行共价TpBD修饰的方法，克服了传统方法中高温体系对电极共价修饰的限制。

实施例3一种利用电化学生物传感器检测黄曲霉毒素M1的方法

参照实施例1中方法，构建得到针对黄曲霉毒素M1的含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液。其中，AFM1-氨基适配体(5’-NH₂-C₆-GAT ACT GCT AGA GAT TTT CCACAT)、信号探针(5’-ATG TGG AAA ATC T-3’Ferrocene)。

将不同浓度的黄曲霉毒素M1加入到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液中，37℃孵育1h。磁分离、取上清液，然后将TpBD-GCE置于清液中室温反应1h，以获得的电极作为工作电极，使用差分脉冲伏安法在0.1M PBS缓冲液中进行电化学测试，电位范围为0V～0.4V。

采用差分脉冲伏安法(DPV)检测不同浓度的AFM1以评价构建的电化学生物传感器的灵敏度。结果如图4A，随着AFM1浓度的增加，DPV信号逐渐增加。在0.5ng/mL～80ng/mL范围内，峰电流与AFM1的浓度成正相关关系(图4B)，相关系数为0.981，检测限为0.15ng/mL(S/N＝3)。

此外，特异性是生物传感器的一个重要特性。通过对环丙沙星、葡萄糖、AFB1和OTA等干扰物的研究，对该传感器的特异性进行了评价，DPV结果如图4C。只有样品中含有目标物AFM1时峰电流明显增加，否则，电流响应与空白电流(无AFM1)相比几乎无变化。该结果表明构建的电化学生物传感器对AFM1的检测具有较好的选择性。

电化学生物传感器检测AFM1的原理如下：

在玻碳电极表面原位生长TpBD的原理和将其用于电化学检测AFM1的原理如图1。为了在电极表面原位生长TpBD，ABA和En的组装起着关键的作用。如图1A，首先采用循环伏安法在电极表面共价固定ABA，ABA的羧基端暴露于电极表面与En反应，为TpBD的生长提供氨基基团。然后通过席夫碱反应在电极表面连接Tp单体，然后将获得的Tp-GCE插入Tp、BD和乙醇的混合溶液中室温搅拌以连接TpBD。

同时，为了实现对AFM1的检测，引入磁分离过程。首先通过适配体5’端的氨基与羧基磁珠间的反应在磁纳米粒子表面锚定AFM1适配体，接着适配体与修饰有电活性分子二茂铁的信号探针通过Watson-Crick碱基配对原则发生部分连接。当存在AFM1时，适配体与AFM1发生特异性结合，信号探针被置换下来悬浮于溶液中。磁分离后，基于核酸链与TpBD间的π-π相互作用，信号探针被吸附到TpBD-GCE表面，通过差分脉冲伏安法测定二茂铁信号。

实施例4电化学生物传感的稳定性测定

为研究所实施例1所得电化学生物传感器的稳定性，首先将TpBD-GCE在含0.1MKCl的1mM[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中连续扫描50圈，发现信号几乎没有变化，表明TpBD在电极表面具有很好的结合稳定性。然后将TpBD-GCE在室温下保存1、3、5、7、9、11、13、15天，参照实施例3中的方法，采用循环伏安法用于测定100ng/mL AFM1。

结果如图5所示，15天后，传感器保持初始信号的76％，表明构建的生物传感器具有很好的稳定性。

实施例5电化学生物传感的准确性测定：加标奶样中AFM1的分析

参照实施例3中方法对脱脂乳、奶粉和果汁乳三种样品中的AFM1进行了检测。首先对牛奶样品进行了检测，未获得阳性结果。在牛奶样品中加入三种不同浓度的AFM1后，回收率在80.74％～111.22％(n＝3)之间(表1)，表明该电化学传感器对实际样品中的AFM1检测是准确可靠的。

表1通过构建的传感器测定牛奶样品(n＝3)中的AFM1

Claims (10)

1.一种电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器的制备方法包括如下步骤：

(1)制备工作电极：

电极预处理：预先利用氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，然后进行清洗；将处理好的电极置于对氨基苯甲酸缓冲液中进行电聚合，结束后将其放置于乙二胺溶液中，在EDC和NHS存在下进行反应，得到表面修饰有氨基的玻碳电极；

电极表面原位生长TpBD：将表面修饰有氨基的工作电极置于含1,3,5-三醛基间苯三酚的溶液中，室温下进行反应，反应结束后取出电极，清洗除去游离的1,3,5-三醛基间苯三酚单体，得到修饰有单体1,3,5-三醛基间苯三酚的电极Tp-GCE；然后将所得Tp-GCE置于含有1,3,5-三醛基间苯三酚和联苯胺的溶液中，室温下进行反应，得到表面键合有共价有机骨架材料TpBD的玻碳电极，记为TpBD-GCE工作电极；

(2)制备信号探针修饰的磁纳米粒子：首先将羧基化磁纳米粒子活化，然后加入氨基修饰的目标物质相应的适配体，基于羧基与氨基间的作用将适配体链修饰在磁珠上，磁分离后，加入修饰有电活性分子二茂铁的信号探针，根据碱基互补配对原则，将信号探针结合在适配体链上，得到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液；

(3)向步骤(2)所得的信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物溶液中加入目标物质样品，目标物质与适配体结合而将信号探针竞争下来；

(4)将步骤(1)所得的TpBD-GCE工作电极浸入到步骤(3)的溶液中，形成电化学生物传感器。

2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述步骤(1)中是将表面修饰有氨基的工作电极置于含1,3,5-三醛基间苯三酚的溶液中，室温下反应2h后取出电极。

3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述步骤(1)中含1,3,5-三醛基间苯三酚的溶液中1,3,5-三醛基间苯三酚的浓度为15mmol/L。

4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述步骤(1)中的电聚合试剂为对氨基苯甲酸。

5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述步骤(1)中的电聚合是在0.4V～1.2V的电位区间内，采用循环伏安法，以10mV/s的扫描速度进行。

6.根据权利要求5所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电聚合的扫描圈数为2圈。

7.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述步骤(1)中的清洗为超声处理；具体是利用硝酸、乙醇和水的混合体系进行处理。

8.一种共价有机骨架材料原位修饰的电极，其特征在于，所述电极的制备方法包括如下步骤：

(1)电极预处理：预先利用氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，然后进行超声清洗；将处理好的电极置于对氨基苯甲酸缓冲液中进行电聚合，结束后将其放置于乙二胺溶液中，在EDC和NHS存在下进行反应，得到表面修饰有氨基的玻碳电极；

(2)电极表面原位生长TpBD：将表面修饰有氨基的工作电极置于含1,3,5-三醛基间苯三酚的溶液中，室温下进行反应，反应结束后取出电极，清洗除去游离的1,3,5-三醛基间苯三酚单体，得到修饰有单体1,3,5-三醛基间苯三酚的电极Tp-GCE；然后将所得Tp-GCE置于含有1,3,5-三醛基间苯三酚和联苯胺的溶液中，室温下进行反应，得到表面键合有共价有机骨架材料TpBD的玻碳电极。

9.权利要求1-7任一所述的电化学传感器或者权利要求8所述的电极在电化学检测领域中的应用。

10.一种检测黄曲霉毒素M1含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(a)构建权利要求1-7任一所述的电化学生物传感器，将不同浓度的黄曲霉毒素M1加入到含有信号探针/适配体/磁纳米粒子复合物的溶液中，磁分离后，取上清液；将制备的TpBD-GCE工作电极浸入上清液中，取出后采用差分脉冲伏安法在PBS缓冲液中进行电化学测试；以所得峰电流值与黄曲霉毒素M1的浓度构建线性关系，即得黄曲霉毒素M1的标准曲线；

(b)利用未知黄曲霉毒素M1含量的待测样品测得相应的峰电流值，根据步骤(1)所得的标准曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素M1的含量。

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