CN109813787A - 一种MnO2/Fe2O3@无定形碳复合材料、核酸适体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料、核酸适体传感器及其制备方法和应用。该复合材料的制备包括：1)将可溶性二价锰盐、可溶性铁氰酸盐、柠檬酸盐在溶剂中反应，制备锰铁普鲁士蓝类似物；2)将锰铁普鲁士蓝类似物、吡咯、氧化剂在溶剂中进行氧化聚合反应，得到聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物；3)将聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物在保护气氛下进行煅烧处理，即得。该方法所得复合材料中的双金属氧化物颗粒和无定形碳之间具有协同作用，不仅提高了基底材料的电化学活性，而且与核酸适体链之间具有较强的结合力，可以通过生物识别力增强核酸适体链与PTK7之间形成的G‑四链体的稳定性。

Description

一种MnO2/Fe2O3@无定形碳复合材料、核酸适体传感器及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料、核酸适体传感器及其制备方法和应用。

背景技术

膜蛋白是血浆和细胞器膜的重要组成部分，在许多生理功能中也起着关键作用，如离子调节、能量传递、分子识别和细胞通讯。人类的大量疾病与膜蛋白的变化也密切相关。蛋白酪氨酸激酶-7(PTK7)是一种细胞膜蛋白，它在调节脊椎动物的神经发育和平面细胞极性以及胚胎发育过程中的细胞运动中起重要作用。此外，PTK7与人类疾病直接相关，如急性髓细胞白血病、结肠癌、胃癌和肺癌。因此，灵敏和准确地检测活细胞上的这种膜蛋白对于了解其在细胞癌变过程中的作用以及进一步研究其在癌症诊断中的作用是至关重要的。为了研究它们在癌细胞以及临床诊断中的作用，目前已经提出了许多检测膜蛋白的方法。然而，许多常规技术，例如，酶联免疫吸附测定和质谱尽管对膜蛋白可以灵敏准确地检测，但预处理步骤繁琐，例如需要分离，纯化和浓缩等。因此，这些方法不适合原位检测。

核酸适体链是单链DNA或RNA，它与目标检测物之间有强亲和力，能发生特异性结合。与抗体相比，核酸适体链长度可控、易于合成且便于化学修饰，因此在诊断和治疗领域具有较大的应用潜力。另外，它不仅具有良好的热稳定性和可重复使用性，还与其相应的靶向目标物的结合具有高度的特异性。并且它们在合成过程中还很容易和各种配体结合进行化学修饰，与稳定性较差的抗体相比，合成成本也较低。特异性识别PTK7的核酸适体链SGC8DNA已经开发出来，它能代替抗体作为生物传感器的识别器，实现特异性检测白血病细胞。由于核酸适体链的这些特性，目前已经开发出许多基于适体链的生物传感器，利用生物传感器与比色、荧光、发光和电化学方法相结合来定量检测蛋白质。在这些生物传感器中，电化学适体传感器具有成本低、操作简便、灵敏度高、选择性好等优点。然而，将核酸适体链与靶向目标物之间的特异性结合转化为可测量的电化学信号是电化学适体传感器研究的关键。为了得到测量信号可用电化学活性标签标记核酸适体链，如二茂铁衍生物，亚甲蓝以及钌络合物。然而，核酸适体链标记是一个复杂而耗时的过程，而且它可能影响核酸适体链与目标靶向物之间的结合力。因此，制备无标记核酸适体链(氧化还原部分不直接与寡核苷酸连接)引起了研究者们极大的关注。开发具有高度生物亲和力的单链核酸适体检测平台非常容易。然而，对于许多基于纳米材料所构筑的适体传感器而言，当核酸适体链与靶向目标物结合时，由于适体链与纳米基底材料之间的吸附作用较弱，癌症标记物和核酸适体链之间形成的G-四链体很容易从基底上脱落。

普鲁士蓝(PB)是一种“人工过氧化物酶”，其中铁是金属离子中心，这种独特的结构和组成使PB具备其他无机材料所没有的优异性能。目前也有将PB及其衍生物构筑为电化学传感平台，用于化学和生物小分子的检测，如公开号为CN101315344A的中国专利申请公开了一种聚吡咯包裹普鲁士蓝纳米粒子胶体溶液的制备方法，具体为：在油/表面活性剂/水的微乳液体系中加入一定量的FeCl₃溶液，剧烈搅拌使完全分散；然后加入吡咯单体，使之反应生成聚吡咯和FeCl₂；反应一段时间后加入K₄FeCN₆溶液，继续搅拌2～12小时，使之反应完全，依次用乙醇、水反复离心洗涤除去杂质，最后用水分散得到聚吡咯包裹的普鲁士蓝纳米粒子的胶体溶液。基于该聚吡咯包裹普鲁士蓝纳米粒子的生物传感器被证明对H₂O₂能够产生电化学响应，可用于H₂O₂等小分子的检测，但没有将它应用到检测癌症标记物领域中。

目前，PB和普鲁士蓝类似物(PBAs)在生物医学和生物传感领域的应用尚处于起步阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，以解决现有基底材料与核酸适体链的结合活性差，核酸适体链与癌症标记物特异性结合后容易从基底上脱落的问题。

本发明的第二个目的在于提供上述制备方法得到的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料，以解决现有基底材料不能有效吸附核酸适体链与癌症标记物的复合物的问题。

本发明的第三个目的在于提供一种基于MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的核酸适体传感器的制备方法，以解决现有检测酪氨酸激酶的方法不适合原位检测的问题。

本发明的第四个目的在于提供一种上述制备方法得到的核酸适体传感器，以解决现有检测酪氨酸激酶的方法不适合原位检测的问题。

本发明的第五个目的在于提供一种核酸适体传感器的应用，以解决现有生物传感器在检测酪氨酸激酶时存在的灵敏度低的问题。

为实现上述目的，本发明的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法所采用的技术方案是：

一种MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将可溶性二价锰盐、可溶性铁氰酸盐、柠檬酸盐在溶剂中反应，制备锰铁普鲁士蓝类似物；

2)将锰铁普鲁士蓝类似物、吡咯、氧化剂在溶剂中进行氧化聚合反应，得到聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物；

3)将聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物在保护气氛下进行煅烧处理，即得。

本发明提供的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，通过制备锰铁普鲁士蓝类似物(MnFe PBA)、聚吡咯(PPy)的包覆、煅烧等步骤制备复合材料，复合材料中的双金属氧化物颗粒(MnO₂和Fe₂O₃)和无定形碳之间具有协同作用，不仅提高了基底材料的电化学活性，而且与核酸适体链之间具有较强的结合力，最为重要的是，其可以通过生物识别力增强核酸适体链与PTK7之间形成的G-四链体的稳定性，避免G-四链体从基底材料上脱落，从而用于构筑高灵敏性的适体传感器。

MnFe PBA的空腔结构有助于结合核酸适体链和PTK7，进而提高它们形成的G-四链体在水溶液中的稳定性。为更进一步优化对核酸适体链和PTK7的结合力，优选的，步骤1)中，可溶性二价锰盐中锰元素、可溶性铁氰酸盐中铁元素的摩尔比(2-4)：1。

柠檬酸盐起到调节产物尺寸大小的作用，为更好的实现产物的尺寸调控，优选的，可溶性铁氰酸盐中每mmol铁元素对应柠檬酸盐的用量为0.5-2.5g。

为有效避免颗粒的大量聚集，进一步改善MnFe PBA的电催化性能，优选的，步骤2)中，每毫克锰铁普鲁士蓝类似物对应吡咯的用量为0.2-0.7μL。为促进原料的充分转化并最大程度降低不良煅烧产物的产生，优选的，所述煅烧处理的温度为350-450℃，时间为1-3h。

本发明的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料所采用的技术方案是：

一种由上述制备方法制备得到的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料。

本发明提供的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料，由双金属氧化物、无定形碳形成核壳结构，壳层为无定形碳层，其多孔结构可以促进传质，并为电化学反应提供所需的电荷转移通路；该复合材料不仅具有良好的电化学活性，还与核酸适体链之间具有较强的结合力，可利用其自身的生物识别力增强核酸适体链与PTK7之间形成的G-四链体的稳定性，防止G-四链体从基底上脱落。

本发明的核酸适体传感器的制备方法所采用的技术方案是：

一种核酸适体传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)将可溶性二价锰盐、可溶性铁氰酸盐、柠檬酸盐在溶剂中反应，制备锰铁普鲁士蓝类似物；

2)将锰铁普鲁士蓝类似物、吡咯、氧化剂在溶剂中进行氧化聚合反应，得到聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物；

3)将聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物在保护气氛下进行煅烧处理，得到MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料；

4)将MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料分散于溶剂中，得到分散液；使用分散液对贵金属电极进行修饰，得到修饰电极，然后在修饰电极上固定靶向酪氨酸激酶的核酸适体，即得。

本发明提供的核酸适体传感器的制备方法，利用MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料固定核酸适体，构筑检测酪氨酸激酶的电化学适体传感器，该电化学适体传感器不仅具有较高的电化学活性，还能稳定核酸适体链与PTK7之间形成的G-四链体，具有灵敏度高、检测限低、选择性好、稳定性高的特点。

从成本及获得良好电信号方面综合考虑，优选的，贵金属电极上MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的修饰量为1-2μg/mm²。

本发明的核酸适体传感器所采用的技术方案是：

一种由上述核酸适体传感器的制备方法得到的核酸适体传感器。

本发明的核酸适体传感器，灵敏度高、检测限低、选择性好、稳定性高，可有效应用于PTK7的电化学检测。

本发明的核酸适体传感器的应用所采用的技术方案是：

上述核酸适体传感器在检测酪氨酸激酶中的应用。

本发明提供的核酸适体传感器，对核酸适体和PTK7之间形成的G-四链体具有良好的稳定性和吸附作用，对PTK7的检测灵敏度高、选择性好，可用于该类膜蛋白的原位检测，简化PTK7的检测流程，提高检测效率，应用前景良好。

附图说明

图1为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的基底材料MnO₂/Fe₂O₃@aC(ⅳ)与MnFe PBA(ⅰ)、MnO₂@Fe₂O₃(ⅱ)、MnFe PBA@PPy(ⅲ)的XRD图；

图2为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的基底材料MnO₂/Fe₂O₃@aC(ⅳ)与MnFe PBA(ⅰ)、MnO₂@Fe₂O₃(ⅱ)、MnFe PBA@PPy(ⅲ)的FT-IR图；

图3为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的基底材料MnO₂/Fe₂O₃@aC(ⅳ)与MnFe PBA(ⅰ)、MnO₂@Fe₂O₃(ⅱ)、MnFe PBA@PPy(ⅲ)的拉曼光谱图；

图4为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的基底材料MnO₂/Fe₂O₃@aC(ⅳ)与MnFe PBA(ⅰ)、MnO₂@Fe₂O₃(ⅱ)、MnFe PBA@PPy(ⅲ)的XPS全谱图；

图5为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的基底材料MnO₂/Fe₂O₃@aC(d)与MnFe PBA(a)、MnO₂@Fe₂O₃(b)、MnFe PBA@PPy(c)中的Mn 2p、Fe 2p和C 1s高分辨XPS能谱图；

图6为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的MnFePBA@PPy材料在不同倍率下的SEM图；

图7为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的MnO₂/Fe₂O₃@aC材料在不同倍率下的SEM图；

图8为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的MnFePBA@PPy材料的TEM图和HT-TEM图；

图9为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所涉及的MnO₂/Fe₂O₃@aC材料的TEM图和HT-TEM图；

图10为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器检测PTK7的CV曲线图；

图11为对比例1的MnFe PBA@PPy-基电化学适体传感器检测PTK7的EIS图；

图12为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器检测PTK7的EIS图；

图13为对比例2的PPy-基电化学适体传感器检测PTK7的EIS图；

图14为对比例3的CN_x-基电化学适体传感器检测PTK7的EIS图；

图15为对比例4的MnFe PBA-基电化学适体传感器检测PTK7的EIS图；

图16为对比例5的MnO₂@Fe₂O₃-基电化学适体传感器检测PTK7的EIS图；

图17为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器检测PTK7过程的△R_ct值变化图；

图18为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器对PTK7浓度梯度检测的EIS图；

图19为图18中△R_ct与PTK7的浓度关系图，插图为ΔR_ct与logC_PTK7的线性拟合图(n＝3)；

图20为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器检测PTK7的选择性测试图；

图21为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器检测PTK7的再现性测试图；

图22为本发明的核酸适体传感器的制备方法实施例1所得电化学适体传感器检测PTK7的稳定性测试图。

具体实施方式

本发明中，用于识别白血病细胞的核酸适体SGC8是包含41个寡核苷酸的长序列，序列中含有适体序列和触发序列，其中触发序列一端与适体序列结合，另一端暴露在外侧与膜蛋白结合。SGC8核酸适体链可以与PTK7结合且具有高亲和力(K_d＝0.8±0.09nM)和较低的解离速率(ko_ff＝5.16s-¹)，这表明SGC8-PTK7结合后形成的复合物解离速度缓慢。

但是，与短序列相比，长序列核酸适体链在构筑的检测平台上的固定较为困难。实验结果表明，SGC8核酸适体与PTK7的结合力较强，但它们之间形成的复合物与传感器基底材料的相互作用力较弱，因此复合物很容易从基底材料上脱落。本发明制备的基底材料不仅具有双金属氧化物和无定形碳纳米结构，还具有大的比表面积和较多的官能团。这些特征可促进SGC8核酸适体链的固定，还增强了SGC8-PTK7在水溶液中形成的G-四链体的稳定性。

另外，本发明的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料具有良好的电化学活性，因此可通过电化学技术(包括电极修饰、SGC8核酸适体的固定以及SGC8-PTK7复合物形成)研究构筑的电化学适体传感器每个过程的变化(尤其是SGC8-PTK7结合后引起的电化学变化)。

在制备核酸适体传感器的相应步骤中，步骤1)为MnFe PBA的合成步骤。可溶性二价锰盐为氯化锰、硝酸锰、硫酸锰等，所述可溶性铁氰酸盐为铁氰化钾。

反应时，为简化物料的混合过程，提高原料的混匀程度，优选的，步骤1)中，将可溶性二价锰盐、柠檬酸盐分散在溶剂中，形成溶液A；将可溶性铁氰酸盐分散在溶剂中，形成溶液B；将溶液B加入溶液A中进行所述反应。柠檬酸盐可以为柠檬酸钾、柠檬酸钠等。为进一步调节反应物的水溶性，使产物尺寸分布更加均匀，优选的，步骤1)中，反应时还加入聚乙烯吡咯烷酮，柠檬酸盐、聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(1-2)。反应过程也可选择不加入聚乙烯吡咯烷酮，得到产物尺寸分布稍差的反应产物。

为促进形成尺寸均匀的复合材料，优选的，步骤1)中，所述反应是将原料混合均匀后静置，静置的时间至少为24h。

步骤2)为吡咯的氧化聚合过程，氧化聚合过程所使用氧化剂、反应条件可参考相关现有技术，为促进氧化聚合反应均匀、稳定进行，优选的，所述氧化剂为FeCl₃，每微升吡咯对应FeCl₃的用量为5-8mg。

步骤4)为电极修饰过程，电极修饰一般包括贵金属电极的活化、修饰材料的吸附过程。贵金属电极的活化包括依次进行抛光处理、活化处理、电化学清洗步骤。为达到更佳的活化效果，活化处理一般是在活化液中进行超声处理。活化液为硫酸和双氧水组成的混合液，一般控制硫酸和双氧水的体积比为(7-9):(1-3)即可。超声处理的条件一般可控制为超声频率40Hz，超声时间15min。活化处理后用水冲洗并干燥，然后在0.5M硫酸溶液中，在-0.2～1.6V的扫描范围内进行循环伏安法测试，即完成电化学清洗。

将分散液滴加在活化的贵金属电极表面，再经干燥，即可完成分散液中修饰材料在电极表面的吸附。当然，其他修饰方式，如涂、蘸、刷、浸泡等方式也可满足要求。

针对PTK7，可使用的现有核酸适体为SGC8，将修饰电极浸入SGC8溶液中，即完成相应的固定过程。SGC8溶液由核酸适体SGC8和PBS配制而成，浓度可控制为10-200nM。浸入SGC8溶液的时间可控制为30-80min，之后用PBS进行冲洗去除未结合的核酸适体即可。

下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。

以下实施例中，吡咯，四水氯化锰(MnCl₂·4H₂O)，铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])，亚铁氰化钾(K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O)和柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)购自国药集团化学试剂有限公司。PVP-K30购自尚昆生物技术有限公司(中国上海)。所有化学品均为分析级，无需进一步纯化即可使用。

核酸适体SGC8 5’-ATCT AACT GCTG CGCC GCCG GCAA AATA CTGT ACGG TTAGA-3’购自尚昆生物技术有限公司(中国上海)，PTK7购自索莱宝生物技术有限公司(中国上海)。

核酸适体传感器的制备方法的具体实施例：

实施例1

本实施例的核酸适体传感器的制备方法，采用以下步骤：

1)将118.7mg MnCl₂·4H₂O、0.25g Na₃C₆H₅O₇·2H₂O和0.3g PVP-K30分散于30mL去离子水中形成溶液A；将66.0mg K₃[Fe(CN)₆]分散于20mL去离子水中形成溶液B。将溶液B加入溶液A中并在室温下搅拌10min，然后常温静置24h，将得到的沉淀物用去离子水离心洗涤3次后在60℃真空干燥，得到锰铁普鲁士蓝类似物(表示为MnFe PBA)。MnCl₂·4H₂O、K₃[Fe(CN)₆]的摩尔比3：1。

2)将130mg FeCl₃和40mg MnFe PBA分散于5mL去离子水中，形成均匀的悬浮液。随后将20μL吡咯加入溶液中，在室温搅拌下反应30min，离心收集产物，用乙醇和水洗涤数次后在60℃真空干燥，得到锰铁普鲁士蓝/聚吡咯复合材料(表示为MnFe PBA@PPy)。

3)将锰铁普鲁士蓝/聚吡咯复合材料置于管式炉中，在氮气气氛下以1℃/min的速率升温至400℃进行煅烧，煅烧时间为2h，冷却至室温后，将所得粉末用Milli-Q水(超纯水)洗涤数次，最后在60℃真空干燥10h，得到MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料(表示为MnO₂/Fe₂O₃@aC)。

4)裸金电极(AE)的预处理：使用0.05μm氧化铝抛光液对AE(直径为3mm)进行抛光处理，将抛光处理后的电极浸泡在硫酸、双氧水组成的活化液中超声处理15min(超声频率40Hz)，活化液由硫酸、双氧水按体积比7:3组成，硫酸的质量浓度为98％，双氧水的质量浓度为30％；超声处理后，在CHI760E电化学工作站(中国上海辰华)上进行循环伏安法测试，完成电化学清洗；扫描范围为-0.2～1.6V，测试溶液为0.5M H₂SO₄；电化学清洗后得到活化AE；

将1.0mg的MnO₂/Fe₂O₃@aC分散在1.0mL去离子水中，然后超声处理30min，形成浓度为1.0mg/mL的均匀悬浮液备用；将悬浮液滴在活化AE表面并在室温条件下干燥12h，得到MnO₂/Fe₂O₃@aC修饰的AE(修饰电极，表示为MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE，修饰量为1.415μg/mm²)。

5)将核酸适体SGC8和PBS(0.1M，pH＝7.4)配制浓度为100nM的核酸适体溶液，将MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE浸入核酸适体溶液中30min，并用PBS进行冲洗以去除未结合的核酸适体，即得核酸适体传感器(表示为Apt/MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE)。

实施例2

本实施例的核酸适体传感器的制备方法，与核酸适体传感器的制备方法实施例1基本相同，区别仅在于，步骤1)中，MnCl₂·4H₂O的用量为79.16mg，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O的用量为100mg，PVP-K30的用量为250mg，K₃[Fe(CN)₆]的用量为66mg；步骤2)中，FeCl₃、MnFe PBA、吡咯的用量分别为48mg，40mg，8μL；步骤3)中，煅烧温度为350℃，时间为3h。

实施例3

本实施例的核酸适体传感器的制备方法，与核酸适体传感器的制备方法实施例1基本相同，区别仅在于，步骤1)中，MnCl₂·4H₂O的用量为158.32mg，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O的用量为500mg，PVP-K30的用量为500mg，K₃[Fe(CN)₆]的用量为66mg；步骤2)中，FeCl₃、MnFe PBA、吡咯的用量为196mg，40mg，28μL。步骤3)中，煅烧温度为450℃，时间为1h。

本发明的核酸适体传感器的具体实施例1-3，分别对应以上核酸适体传感器的制备方法实施例1-3所得产物。

本发明的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的具体实施例1-3，分别对应以上核酸适体传感器的制备方法实施例1-3的步骤3)所得产物。

本发明的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法的具体实施例1-3，分别与以上核酸适体传感器的制备方法实施例1-3的步骤1)-步骤3)相同。

本发明的核酸适体传感器在检测酪氨酸激酶中的应用的具体实施例，在以下实验例中进行说明。

对比例1-5

对比例1-5的核酸适体传感器，分别以MnFe PBA@PPy、PPy、CN_x、MnFePBA、MnO₂@Fe₂O₃为电极修饰材料制备修饰电极。

具体的，在核酸适体传感器的制备方法实施例1中，步骤1)得到MnFe PBA，不经步骤2)直接按步骤3)的方法进行煅烧，得到MnO₂@Fe₂O₃；步骤2)中，不添加MnFe PBA，合成得到PPy，PPy按步骤3)的方法进行煅烧，得到CN_x。步骤2)得到MnFe PBA@PPy。

在以上电极修饰材料的基础上，参考步骤4)得到修饰电极(分别表示为MnFe PBA@PPy/AE、PPy/AE、CN_x/AE、MnFe PBA/AE、MnO₂@Fe₂O₃/AE)，参考步骤5)得到相应的核酸适体传感器，分别表示为Apt/MnFe PBA@PPy/AE、Apt/PPy/AE、Apt/CN_x/AE、Apt/MnFe PBA/AE、Apt/MnO₂@Fe₂O₃/AE。

以下实验例以核酸适体传感器的制备方法实施例1涉及的相应产物进行说明。

实验例1晶体和化学结构表征

本实验例对电极修饰材料的晶体和化学结构进行表征。

1.1XRD分析

对MnFe PBA、MnO₂@Fe₂O₃、MnFe PBA@PPy、MnO₂/Fe₂O₃@aC四种电极修饰材料进行XRD分析，结果如图1所示。分析仪器为Rigaku D/Max-2500型X射线衍射仪(XRD)。

MnFe PBA和MnFe PBA@PPy材料中17.5°、24.9°、35.5°、39.8°、44.2°、51.1°和57.6°的衍射峰分别对应着面心立方KMn(Fe(CN)₆)·(H₂O)₂结构(JCPDS:89-8979)的(002)、(022)、(004)、(024)、(242)、(044)和(260)晶面。

MnO₂@Fe₂O₃的XRD图谱中12.5°、29.39°和32.2°的衍射峰分别对应着MnO₂(JCPDS:72-1982)的(110)、(220)和(310)晶面。23.6°和32.9°的两个较弱的衍射峰分别对应着Fe₂O₃(JCPDS:88-3582)的(012)和(104)晶面。

MnO₂/Fe₂O₃@aC材料中28.7°和41.1°处的衍射峰分别对应着MnO₂(JCPDS:72-1982)的(310)和(420)晶面。由于Fe₂O₃含量较低，所以没有观察到明显的特征衍射峰。

1.2FT-IR分析

对MnFe PBA、MnO₂@Fe₂O₃、MnFe PBA@PPy、MnO₂/Fe₂O₃@aC四种电极修饰材料进行FT-IR分析，结果如图2所示。分析仪器为Bruker TENSOR27型FTIR，扫描范围为400-4000cm-¹。

MnFe PBA和MnFe PBA@PPy在3364和1609cm-¹两处的峰对应着O-H的拉伸振动和弯曲振动，这是由物理吸附在材料表面的水分子引起的。2147和2079cm-¹处的峰是六氰基高铁酸盐(MHCFs，M-过渡金属阳离子)的特征吸收谱带，分别对应着MnFe PBA和MnFe PBA@PPy中Fe^II-C≡N-Mn^III和Fe^III-C≡N-Mn^I的拉伸振动。593和450cm-¹处的吸收峰分别对应着MnFePBA和MnFePBA@PPy中Mn-C的拉伸振动和Mn-C≡N的弯曲振动。在MnFe PBA@PPy复合材料的FT-IR光谱图中还观察到1578cm-¹处的吸收峰，对应着PPy中C＝C键的对称拉伸振动；1400cm-¹处的吸收峰对应着C-N的拉伸振动；1285cm-¹处的吸收峰对应着C-H的平面振动。另外，1050和937cm-¹两处的吸收峰分别对应着N-H的面内变形振动和C-H的面外振动，这些结果都表明PPy掺杂在复合材料中。968和794cm-¹处的吸收峰也证明了PPy的存在。这些特征吸收峰的存在表明，MnFe PBA和PPy的成功复合。

在MnFe PBA高温煅烧后，611cm-¹处吸收峰对应着金属氧化物的金属氧(M-O)振动，而1380cm-¹处的强吸收峰对应着N-C＝O基团。

MnO₂/Fe₂O₃@aC复合材料的FT-IR光谱图中明显观察到在2850、2930和2970cm-¹处的吸收峰对应着CH_x基团；1670cm-¹处出现的吸收峰对应着C＝O基团，也表明碳相关基团的氧化。同时，吡咯特征吸收峰的消失也证明了吡咯环的分解。

1.3拉曼光谱分析

对MnFe PBA、MnO₂@Fe₂O₃、MnFe PBA@PPy、MnO₂/Fe₂O₃@aC四种电极修饰材料进行拉曼光谱分析，结果如图3所示。分析仪器为Renishaw InVia型拉曼光谱仪，其固态激光器的激发波长是532nm，扫描范围为200-3000cm-¹。

MnFe PBA的拉曼光谱图中，在2080cm-¹处的吸收峰对应着ν(CN)的拉伸振动，2116cm-¹处的吸收峰对应着Fe(II)-CN-Mn(III)的振动状态，207cm-¹处的吸收峰对应着Fe-CN-Fe的变形振动。

MnO₂@Fe₂O₃的拉曼谱图中，在470和570cm-¹两处的吸收峰，分别对应着Fe-O和Mn-O的对称拉伸振动。

在MnFe PBA@PPy的拉曼谱图中，1333和1570cm-¹处的明显特征吸收峰，分别对应着PPy的C＝C拉伸和C≡N的反对称拉伸振动。

在MnO₂/Fe₂O₃@aC的拉曼谱图中，470和570cm-¹两处的弱吸收峰分别对应材料中的Fe-O和Mn-O的对称拉伸振动。

拉曼光谱的分析结果表明，MnO₂@Fe₂O₃、MnO₂/Fe₂O₃@aC中的金属氧化物是由MnFePBA和MnFe PBA@PPy在高温煅烧后生成的。

1.4 XPS分析

对MnFe PBA、MnO₂@Fe₂O₃、MnFe PBA@PPy、MnO₂/Fe₂O₃@aC四种电极修饰材料进行XPS分析，结果如图4-图5和表1所示。分析仪器为Thermo FisherESCALAB 250Xi光电子能谱仪。

在如图4所示的XPS全谱图中，所有电极修饰材料都含有Fe 2p(708.7eV)，Mn 2p(641.4eV)，O 1s(532eV)，C 1s(284.8eV)，和N 1s(397.7eV)。

表1电极修饰材料中每种元素的原子百分比

表1的结果显示，MnFe PBA材料中，Mn 2p和Fe 2p的原子含量分别为3.97％和4.94％，与MnO₂@Fe₂O₃中的Mn 2p(21.31％)和Fe 2p(27.37％)相比要低得多。相比之下，在煅烧前后，C 1s和N 1s的原子含量分别从66.52％下降到21.35％和21.45％下降到1.41％，这说明原始MnFe PBA中的氰基在高温下分解，进而导致N 1s原子含量的下降。而MnFe PBA@PPy和MnO₂/Fe₂O₃@aC复合材料中Mn 2p、Fe 2p、O 1s、和C 1s的原子含量百分比没有显著变化，只是从12.01％到7.72％略有下降，表明氰基和PPy的分解。

利用XPSPEAK1进一步分析各元素的高分辨XPS图谱，确定电极修饰材料中元素的价态，MnFe PBA、MnO₂@Fe₂O₃、MnFe PBA@PPy、MnO₂/Fe₂O₃@aC四种电极修饰材料的Mn 2p、Fe2p和C 1s的高分辨XPS图谱如图5所示(横纵坐标的说明与图4一致)。

四种电极修饰材料中，锰离子的主要价态都是Mn²⁺，Mn³⁺和Mn⁴⁺。MnFePBA和MnFePBA@PPy中的Mn²⁺含量高于MnO₂@Fe₂O₃和MnO₂/Fe₂O₃@aC，表明在高温煅烧过程中部分Mn²⁺被氧化成高价态，即Mn³⁺或Mn⁴⁺。

同时，在MnFe PBA和MnFe PBA@PPy中铁元素的价态有Fe⁰和Fe²⁺两种，煅烧后形成的MnO₂@Fe₂O₃和MnO₂/Fe₂O₃@aC复合材料中铁元素被氧化成高价态的Fe²⁺和Fe³⁺。

从结合能的角度分析，MnFe PBA的C 1s的高分辨XPS图谱中，285.6和284.6eV的峰对应着C＝N和C-C基团，而MnO₂@Fe₂O₃和MnFe PBA@PPy两种材料中出现C＝C、C＝O、N-C＝O以及COO基团的吸收峰。这些结果表明，高温煅烧和PPy层的包覆导致碳组分的复杂。在MnO₂/Fe₂O₃@aC复合材料中碳组分的组成相对简单，只有C-C基团且含量较低。

实验例2表面形貌分析

本实验例用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)对MnFe PBA@PPy和MnO₂/Fe₂O₃@aC复合材料进行表面形貌表征和纳米结构分析。采用JSM-6490LV型FE-SEM观察样品的形貌。采用型号为JEOL JSM-6490LV的透射电子显微镜(TEM)观察样品的形貌及其内部结构。

在图6所示的MnFe PBA@PPy的SEM图(图6a、图6b的放大倍数分别为5000倍、50000倍)中，可以看出，MnFe PBA@PPy复合材料是由平均大小为100nm的小粒子组成的纳米立方体状，由于MnFe PBA表面包裹着PPy层，复合材料的尺寸达到1.2μm。经高温煅烧后形成的MnO₂/Fe₂O₃@aC复合材料的表面形态仍保持为纳米盒状(图7，图7a、图7b的放大倍数分别为10000倍、50000倍)。但是，由于高温下的PPy层分解，纳米盒的尺寸降低到了0.6μm。

在图8所示的MnFe PBA@PPy的TEM图中，可以看出，MnFe PBA@PPy由具有中空结构的小颗粒(MnFe PBA)组成且外层包裹着PPy。HT-TEM图中的晶格间距为0.252nm，对应着KMn(Fe(CN)₆)·(H₂O)₂的(002)晶面(图8b)。

在图9所示的MnO₂/Fe₂O₃@aC的TEM图中，可以看出，PPy层被转化为无定形碳(图9a)，0.304nm的晶格间距对应着碳的(002)晶面(图9b)，测量得到碳层厚度约为4nm，0.694nm的晶格间距对应着MnO₂的(110)晶面。

实验例3核酸适体传感器的性能分析

本实验例利用CV和EIS技术分析构建的核酸适体传感器的电化学性能。利用CHI760E电化学工作站(中国上海辰华)进行电化学测试，该电化学工作站采用三电极系统，对电极为铂，参比电极为(Ag/AgCl，饱和KCl)，工作电极为本发明涉及的核酸适体传感器。电化学测试时，测试数据为重复三次测试的平均值(n＝3)。

CV测试时的扫描范围为-0.2V～0.8V，扫描速率为50mV·s-¹。通过CV监测构筑核酸适体传感器的每一步骤及检测PTK7过程中的电信号变化，所得CV曲线如图10所示。检测PTK7前所使用的电解质溶液由K₃[Fe(CN)₆]、K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O、KCl溶解于PBS(0.1M，pH＝7.4)中配置而成，其中[Fe(CN)₆]³-、[Fe(CN)₆]⁴-的浓度均为5mM，KCl的浓度为0.1M。PTK7溶液由PTK7和PBS配制而成，PTK7的浓度为0.001ng/mL，核酸适体传感器在PTK7溶液中的孵育时间为1h。

图10中，各CV曲线都有一对明确峰值，这对应着[Fe(CN)₆]³-^/4-氧化还原探针的电子转移。将MnO₂/Fe₂O₃@aC修饰到AE上后(即MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE)，观察到氧化还原峰值电流明显降低。这是由于电极修饰后导致电导率降低，进而影响电极表面与电解质溶液界面的电子转移。固定核酸适体链后形成Apt/MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE，氧化还原峰值电流进一步降低，这是因为靶向PTK7核酸适体链中含有带负电荷的磷酸基团，与[Fe(CN)₆]³-^/4-之间存在静电排斥力，这种排斥效应阻碍了[Fe(CN)₆]³-^/4-靠近电极表面，减缓电子转移速率，因此其氧化还原峰值电流下降。随后，利用构筑的电化学传感器检测PTK7后形成PTK7/Apt/MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE，因Apt和PTK7之间的特异性结合造成电子传递电阻较高，因而导致峰值电流明显降低。另外，由图10也可以看出，峰值电位与峰值电流变化呈现相反的趋势，进一步证实了电极被成功修饰以及传感器的成功构筑。

EIS测试时的频率范围为0.01～100MHz，利用ZVIEW2软件对EIS数据进行了模拟分析，EIS模拟的等效电路包括电解质电阻(Rs)、电荷转移电阻(R_ct)、恒相元(CPE)和Warburg阻抗(W_o)。EIS测试时的电解液组成与CV测试相同。

基于MnFe PBA@PPy、PPy、CN_x、MnFe PBA、MnO₂@Fe₂O₃以及MnO₂/Fe₂O₃@aC材料构筑的电化学适体传感器(即核酸适体传感器)检测PTK7的EIS响应如图11-16所示。R_ct对应着半圆的直径，由[Fe(CN)₆]³-^/4-(氧化还原探针)在电极界面上的电子转移动力学控制。

MnFe PBA@PPy基电化学适体传感器检测PTK7的EIS图如11所示，拟合处理后AE的R_ct为52.3Ω，这说明电解质溶液[Fe(CN)₆]³-^/4-在AE表面的电子转移速度较快。当AE表面被MnFe PBA@PPy修饰后，MnFe PBA@PPy/AE的R_ct只略微增加到70Ω，表明MnFe PBA@PPy具有较高的电化学活性。固定Apt以及随后的PTK7检测中，不仅使AE界面增加了带负电荷的核酸适体，而且还占据了传感器基底材料的活动位点，这都影响AE界面电子转移能力的降低以及R_ct的增加。以上结果也与理论预测一致，证明了用于PTK7检测的电化学适体传感器被成功构筑。

MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器检测PTK7的EIS响应如图12所示，Apt的固定以及PTK7的检测导致了R_ct的增加。基于不同材料构筑的电化学适体传感器的R_ct虽然有类似的变化趋势，但变化值不同，这一结果也表明不同的电化学适体传感器检测PTK7具有不同的检测效率。

R_ct值的变化可以表示结合层吸附量的多少，不同电化学适体传感器所引起R_ct值的变化也表明了PTK7的检测效率。为方便比较，图17示出了基于6种材料所构筑的电化学适体传感器检测PTK7时每一步R_ct值的变化。使用电极修饰材料进行AE修饰后引起的△R_ct值变化表示为△R_ct＝R_ct,materials-R_ct,AE，6种材料中，MnFe PBA/AE所引起的△R_ct最大(达到0.32kΩ)，说明MnFe PBA的电化学活性较差。当MnFe PBA煅烧后形成MnO₂@Fe₂O₃，其△R_ct下降至0.02kΩ，说明材料的电子转移电阻较小，也说明MnO₂和Fe₂O₃的共存可明显提高纳米材料的电化学活性。当PPy与MnFe PBA复合后形成MnFe PBA@PPy材料，相应的△R_ct值最小(为18Ω)，其优异的电化学活性促进了界面的电子转移，显然，PPy层的存在可以增强电子转移并进一步促进Apt的固定。但是MnFe PBA@PPy煅烧后，MnO₂/Fe₂O₃@aC/AE的△R_ct值反而增大至0.09kΩ，这是因为PPy经过煅烧形成无定形碳，破坏了PPy的共轭结构，因此导致MnO₂/Fe₂O₃@aC的电化学活性下降。

当修饰后的电极固定Apt后，Apt/MnFe PBA/AE、Apt/MnO₂@Fe₂O₃/AE的△R_ct值变化较大，表明其固定的Apt较多。但基于MnFe PBA材料构筑的适体传感器检测PTK7的△R_ct值变化较小(约为0.06kΩ)，表明其活性较低；基于MnO₂@Fe₂O₃材料构筑的电化学适体传感器检测PTK7时引起的△R_ct值变化较大。这些结果证实，Apt与常规电化学适体传感器基底材料(如MnFe PBA)之间的结合力较弱，Apt与PTK7结合形成的G-四链体很容易从基底材料上脱落。而MnO₂和Fe₂O₃纳米材料可以通过范德华力吸附单链DNA(ssDNA)探针。所以，以MnO₂@Fe₂O₃为传感器基底材料可以稳定Apt与PTK7之间形成的G-四链体。

图17表明，MnFe PBA@PPy具有良好的电化学活性，但是在Apt的固定和PTK7的检测过程中引起的△R_ct值变化都较小。煅烧后的MnFe PBA@PPy却呈现出不同的趋势，MnO₂/Fe₂O₃@aC基底材料在固定Apt后引起的△R_ct值不是很大，约0.18kΩ，小于MnFe PBA和MnO₂@Fe₂O₃为基底材料的情形，但在检测PTK7后引起的△R_ct变化最大，约为0.4484kΩ，表明其具有较高的检测效率。

实验例4核酸适体传感器的灵敏度测试

利用EIS研究基于MnO₂/Fe₂O₃@aC构筑的电化学适体传感器检测PTK7的检出限(LOD)。将电化学适体传感器依次浸泡在不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、5和10ng/mL)的PTK7溶液(PTK7溶液使用PBS配制而成，KCl浓度为0.1M)中1h，之后进行EIS测试，测试结果如图18所示。

结果表明，R_ct值随着PTK7浓度的增大而增大。图19中，将ΔR_ct与PTK7浓度的对数作图，拟合线性关系后计算得到检测灵敏度。在100fg/mL至10.0ng/mL浓度范围内，ΔR_ct与PTK7浓度的对数值之间有良好的线性关系，回归方程为ΔR_ct(kΩ)＝0.528+0.319log C_PTK7(pg/mL)，相关系数R²为0.991，由此可计算出LOD＝44fg/mL(3.83pM)，相对标准差(RSD)为3.5％。与其他文献报道中的检测PTK7适体传感器相比，基于MnO₂/Fe₂O₃@aC构筑的电化学适体传感器具有更低的检出限和更宽的线性检测范围(表2)。

表2不同适体传感器的灵敏度比较

(文献1：Li,W.；Wang,L.；Wang,Y.；Jiang,W.Binding-induced nicking sitereconstruction strategy for quantitative detection of membrane protein onliving cell.Talanta 2018,189,383-388.

文献2：Lin,S.；Gao,W.；Tian,Z.；Yang,C.；Lu,L.；Mergny,J.；Leung,C.；Ma,D.Luminescence switch-on detection of protein tyrosine kinase-7using a G-quadruplex-selective probe.Chem.Sci.2015,6,4284-4290.

文献3：Liu,Z.；Chen,W.；Han,Y.；Ouyang,J.；Chen,M.；Hu,S.；Deng,L.；Liu,Y.Alabel-free sensitive method for membrane protein detection based on aptamerand AgNCs transfer.Talanta 2017,175,470-476.

文献4：Miao,X.；Li,Z.；Zhu,A.；Feng,Z.；Tian,J.；Peng,X.Ultrasensitiveelectrochemical detection of protein tyrosine kinase-7by gold nanoparticlesand methylene blue assisted signal amplification.Biosens.Bioelectron.2016,83,39-44.

文献5：Wang,Y.；Wu,Z.；Liu,S.；Chu,X.Structure-switching aptamertriggering hybridization chain reaction on the cell surface for activatabletheranostics.Anal.Chem.2015,87,6470-6474.

文献6：Bábelová,L.；Sohová,M.E.；Poturnayová,A.；Buríková,M.；Bizík,J.；Hianik,T.Label-free electrochemical aptasensor for jurkat cells detection asa potential diagnostic tool for leukemia.Electroanal.2018,30,1487-1495.

文献7：Khoshfetrat,S.M.；Mehrgardi,M.A.Amplified detection of leukemiacancer cells using an aptamer-conjugated gold-coated magnetic nanoparticleson a nitrogen-doped graphene modified electrode.Bioelectrochemistry 2017,114,24-32.)

表2中，基于负载AgNC的聚合物构筑荧光适体传感器检测PTK7。通过带正电荷的AgNC与SGC8Apt的结合检测PTK7，检出限为372fM。由此可得，本发明的MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器不仅构筑方法方便，而且在检测目标分析物时表现出极高的灵敏度。

实验例5核酸适体传感器的选择性、再现性和稳定性测试

本实验例评估MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器检测PTK7的特异性，选择与PTK7性质类似组分作为干扰物，干扰物包括IgG，VEGF，CEA，HER2，MUC1和PSA，其浓度均为1.0pg/mL(为PTK7最低检测浓度的10倍)。图20的结果表明，检测PTK7(0.1pg/mL)时产生的ΔR_ct值变化较大，而检测其他干扰物时(1.0pg/mL)所引起的信号变化可忽略的，这主要是由于Apt与PTK7之间有特异性的相互作用力。这些结果表明，构筑的MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器检测PTK7具有良好的选择性。

为了评估MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器是否能够满足长期测试的要求，进行了重现性和稳定性测试。

重现性测试方法是在相同条件下同时用5根电极分别检测0.1pg/mL的PTK7溶液，测试结果如图21所示。结果表明，ΔR_ct变化值的差异较小(RSD＝4.31％，n＝3)，表明相应核酸适体传感器的重现性良好。

稳定性测试方法是将电极储存在4℃冰箱并且连续测试15天后对比ΔR_ct值，结果如图22所示。结果表明，在15天后测得的ΔR_ct值约为第一天ΔR_ct值的94.6％。该结果表明构筑的MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器检测PTK7具有优异的稳定性。

实验例6核酸适体传感器的实际应用检测

本实验例评估构筑的电化学适体传感器的实际应用性。用稀释100倍的人血清样品(得自郑州大学第一附属医院，稀释溶剂为0.01M PBS溶液)配制不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2、5和10ng/mL)的PTK7溶液(PTK7溶液中KCl的浓度为0.1M)。

用MnO₂/Fe₂O₃@aC基电化学适体传感器测定PTK7溶液中目标分析物的浓度(根据图19中的线性方程进行计算)，结果如表3所示。

表3 MnO₂/Fe₂O₃@aC电化学适体传感器的实际样品测定

表3的测定结果表明，与PTK7的实际添加量相比，测定值的RSD在2.25％和4.12％之间，回收率在95.5％-102.6％之间，表明该适体传感器在实际样品测试中的具有良好适用性。

另外，基于MnO₂/Fe₂O₃@aC构筑的电化学适体传感器可以通过改变相应的核酸适体链检测其他癌症标记物或目标分析物。相应电化学适体传感器可应用于小分子及其它不同蛋白质的检测，可为扩大PBs或PBAs在医学诊断领域中的应用提供一种新的方法。

Claims (10)

1.一种MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将可溶性二价锰盐、可溶性铁氰酸盐、柠檬酸盐在溶剂中反应，制备锰铁普鲁士蓝类似物；

2)将锰铁普鲁士蓝类似物、吡咯、氧化剂在溶剂中进行氧化聚合反应，得到聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物；

3)将聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物在保护气氛下进行煅烧处理，即得。

2.如权利要求1所述的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，可溶性二价锰盐中锰元素、可溶性铁氰酸盐中铁元素的摩尔比(2-4)：1。

3.如权利要求1所述的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，其特征在于，可溶性铁氰酸盐中每mmol铁元素对应柠檬酸盐的用量为0.5-2.5g。

4.如权利要求1所述的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，其特征在于，步骤2)中，每毫克锰铁普鲁士蓝类似物对应吡咯的用量为0.2-0.7μL。

5.如权利要求1所述的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法，其特征在于，所述煅烧处理的温度为350-450℃，时间为1-3h。

6.一种由权利要求1所述的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的制备方法制得的MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料。

7.一种核酸适体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将可溶性二价锰盐、可溶性铁氰酸盐、柠檬酸盐在溶剂中反应，制备锰铁普鲁士蓝类似物；

2)将锰铁普鲁士蓝类似物、吡咯、氧化剂在溶剂中进行氧化聚合反应，得到聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物；

3)将聚吡咯包覆的锰铁普鲁士蓝类似物在保护气氛下进行煅烧处理，得到MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料；

4)将MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料分散于溶剂中，得到分散液；使用分散液对贵金属电极进行修饰，得到修饰电极，然后在修饰电极上固定靶向酪氨酸激酶的核酸适体，即得。

8.如权利要求7所述的核酸适体传感器的制备方法，其特征在于，贵金属电极上MnO₂/Fe₂O₃@无定形碳复合材料的修饰量为1-2μg/mm²。

9.一种由权利要求7所述的核酸适体传感器的制备方法制得的核酸适体传感器。

10.一种如权利要求9所述的核酸适体传感器在检测酪氨酸激酶中的应用。