CN104965073A - 检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器及其制备 - Google Patents

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柳建设
王兆慧
赵慧慧
朱玲玉
陈名明
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Abstract

本发明提供了检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器及其制备。所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，其特征在于，包括电极以及固定在电极上的布洛芬适配体。其制备方法包括将裸电极抛光后，依次置于硝酸溶液，无水乙醇和蒸馏水中超声，晾干得到修饰后的电极，将含有布洛芬适配体的溶液滴涂于所述的修饰后的电极上，在室温下孵化，最后将电极于室温下浸泡在巯基乙醇溶液中过夜组装，进行非特异性位点封闭，清洗后，得到检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器。本发明为布洛芬的检测提供了一种全新的方法，拓展了无标记电化学阻抗分析方法的应用，具有制作过程简单，检测限低，稳定性好等优点。

Description

检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器及其制备
技术领域
本发明涉及属于电化学分析和环境检测技术领域，尤其涉及一种检测布洛芬的电化学适配体生物传感器，以及该传感器的制备与检测方法。
背景技术
近几年，人们开始关注药品和个人护理用品(pharmaceuticals and personal careproducts，PPCPs)这类微量污染物对人类健康和生态环境的影响，并发展成全世界的热点问题。药品和个人护理用品(PPCPs)包括各种处方药和非处方药(中药、固醇激素、消炎药、抗生素、类止痛剂、镇定剂、降压药等各种药物)、个人护理及护肤化妆品、香料、保健品、染发剂、诊断剂、消毒剂、清洁剂和其它在生产制造中添加的组分如防腐剂等，涵盖范围十分广泛。目前，在西方发达国家和第三方检测报告中已经开始尝试对部分PPCPs药品的环境含量作限量要求，从而引起人们对由PPCPs引起的水体污染及其迁移转化及去除的关注。国外已有研究表明，部分PPCPs药物能够对人类及其他生物具有生殖、神经等方面的毒理学效应或具有致癌的可能性。
布洛芬的化学名称为2-(-4-异丁基苯基)丙酸，分子式为C13H18O2，分子量为206.3。该药具有抗炎、镇痛、解热作用，是一种临床常用的非甾体抗炎药物，也是PPCPs中的一种。环境中的布洛芬浓度通常为ng/L～μg/L，因此要想研究它们引起的水体污染及其迁移转化及去除方法，就需要建立有效的富集方法和灵敏的分析检测方法。依靠传统仪器检测虽然具有检测灵敏度高，检测结果稳定性好等优点，但是大型仪器通常价格较为昂贵，并且需要具备相关知识的专业操作人员，同时存在检测成本高昂等缺点，限制了大型仪器的大规模检测和现场快速检测。基于免疫分析的酶联免疫吸附法可以解决大型仪器的检测成本高和不能够用于现场检测的缺点，但由于酶联免疫吸附法在检测过程中需要多步的反复洗涤和分离的过程，以及需要具有一定专业知识的人进行操作，一定程度上也限制了该方法的广泛推广使用。而电化学免疫传感器由于其特异性和灵敏性而无需复杂的前处理过程，因此是一种非常适用于现场快速检测的分析方法。
发明内容
本发明的目的就是针对现有检测布洛芬技术的灵敏度不高、操作复杂等不足而提供一种基于布洛芬适配体传感器的电化学分析方法，通过于Au-S的结合，提高了电极导电性和负载适配体的能力，实现了对布洛芬的高灵敏、高选择性检测，具有制备方法简单，操作简便，耗时短等优点。
为了达到上述目的，本发明提供了一种检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，其特征在于，包括电极以及固定在电极上的布洛芬适配体。
优选地，所述的布洛芬适配体为长度为76bp的单链DNA探针，其5′端修饰了巯基(-SH)。
更优选地，所述的布洛芬适配体的序列为：
5′-SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3′。
优选地，所述的电极为玻碳电极或金电极。
本发明还提供了上述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：将裸电极抛光后，依次置于硝酸溶液，无水乙醇和蒸馏水中超声3-8min，晾干得到修饰后的电极，将含有布洛芬适配体的溶液滴涂于所述的修饰后的电极上，在室温下孵化30min-6h，最后将电极于室温下浸泡在巯基乙醇(MCH)溶液中过夜组装，进行非特异性位点封闭，清洗后，得到检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器。
优选地，所述的含有布洛芬适配体的溶液由将布洛芬适配体加入到pH为6.8的Tris-HCl缓冲溶液中得到，布洛芬适配体的浓度为1μmol/L。
本发明还提供了一种应用上述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器检测环境水样中的布洛芬的方法，其特征在于，包括：采用三电极体系，以上述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，进行电化学阻抗检测；将权利要求1-6中任一项所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器放入不同浓度的布洛芬标准液中，分别孵育后，再进行电化学阻抗检测；以阻抗的变化绘制标准曲线，利用该标准曲线测定环境水样中的布洛芬的含量。
本发明所述的检测方法的原理是：在有布洛芬存在的情况下，本发明中所述适配体与布洛芬特异性结合，引起所述适配体的空间构象及其在金电极表面取向的变化，进一步影响电解液中电化学活性指示剂铁氰化钾与电极界面的电子转移速率，即表现为电子转移阻抗变化，通过电化学活性指示剂铁氰化钾显示的阻抗值与布洛芬浓度的对数之间的线性关系，建立布洛芬的快速电化学传感器检测技术。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种对目标布洛芬非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、修饰方便快速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好等优点。
(2)本发明基于本发明所述的适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将样品中布洛芬目标物的存在转变为电信号进行快速检测。它将电化学方法的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不受样品中脂血、溶血情况干扰。
(3)本发明解决了现有布洛芬检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点。本发明采用可特异性识别布洛芬的核酸适配体应用于电化学传感器，大大提高了检测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性，是一种检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。
(4)本发明依据不同浓度的布洛芬与适配体结合后传感器界面的电流变化与核酸适配体产物的量成正比来测定布洛芬分子的浓度，为布洛芬的检测提供了一种全新的方法，拓展了无标记电化学阻抗分析方法的应用，具有制作过程简单，检测限低，稳定性好等优点。
附图说明
图1为电化学核酸适配体传感器快速检测布洛芬的制备流程示意图。
图2为布洛芬适配体修饰电极在不同浓度布洛芬标准溶液中检测的电化学阻抗图。
图3为布洛芬标准品溶液检测得到的标准曲线图。
图4为布洛芬电化学核酸适配体传感器检测不同物质的特异性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，包括金电极以及固定在电极上的布洛芬适配体。所述的布洛芬适配体为长度76bp的单链DNA探针，其5′端修饰了巯基(-SH)具体序列为：
5′-SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3′。
上述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器的制备方法为：如图1所示，将裸金电极用0.05μm的氧化铝粉末仔细打磨抛光成镜面，并先后于硝酸溶液(由市售浓硝酸和水按照体积比1∶1配制而成)，无水乙醇和蒸馏水中超声各5min。最后将电极在室温下晾干。将布洛芬适配体离心后加入pH为6.8的Tris-HCl缓冲溶液溶解为1μmol/L，用移液枪取10μL滴涂于修饰好的电极上，在室温下孵化4h，最后将电极于室温下浸泡在浓度为1mmol/L的MCH溶液中过夜组装，进行非特异性位点封闭，用pH为6.8的Tris-HCl缓冲溶液冲洗，得到检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器。
用交流阻抗法对电极的修饰过程进行表征，并对电化学核酸适配体生物传感器对布洛芬的阻抗值响应进行测试。实验采用三电极体系，检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将所述的电化学核酸适配体生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的Fe(CN)6 3-/4电解液(Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的摩尔比为1∶1，Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol/L，含0.1mol/LKCl)中，在CHI 760d电化学工作站上，进行电化学阻抗检测，初始电位为0.22V，振幅为±5mV，频率为0.1-1.0×105Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图及其阻抗值Ret0；
将交流阻抗分析后的电化学核酸适配体生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1.0ng/mL的布洛芬水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的布洛芬，然后置于浓度为5mmol/L的Fe(CN)6 3-/4电解液(Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的摩尔比为1∶1，Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol/L，含0.1mol/L KCl)中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，振幅为±5mV，频率为0.1-1.0×105Hz，得到浓度为1.0ng/mL的布洛芬标准液的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret1；
同理，将上述电化学核酸适配体生物传感器依次放入浓度5.0×10-4mol L-1到5.0×10-9mol L-1的布洛芬标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn(n为2-7之间的整数)，并计算各标准液相对初始的适配体电化学生物传感器的阻抗变化值ΔRet即各标准液对应的阻抗值Retn(n为2-7之间的整数)减去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0；以浓度为5.0×10-4mol L-1到5.0×10-9mol L-1的布洛芬标准液浓度的对数为横坐标，以这6种标准液对应的阻抗变化值ΔRet为纵坐标作图，建立标准曲线。所有的电化学测量均在室温下进行。采用线性回归法得到方程，如图3所示，在5.0×10-4～5.0×10-9mol L-1范围内，ΔRet与布洛芬的浓度对数呈现良好的线性关系，回归方程为：ΔRet＝1067.9logC+4850.2，相关系数R2＝0.9757，整个实例方法的检出限(S/N＝3)为0.0002ng/mL。
图2记录了上述各浓度的布洛芬标准液的交流阻抗Nyquist图谱，其中，曲线a-f分别对应5.0×10-9mol L-1到5.0×10-4mol L-1的浓度的布洛芬标准液，可以发现，随着布洛芬浓度的增大，代表电子传递阻抗的半圆直径增大。借助Nyquist图谱进行等效电路拟合：在发生氧化还原电子传递的反应体系中，拟合电路模型为恒相位元件修正的Randle等效电路。等效电路各元件包括Rs、Zw、Ret和CPE，分别代表电解液电阻、Warburg阻抗、氧化还原对的电子传递电阻和恒相位元件电容。其中CPE和Ret的大小则由电极/电解质界面介电性质和绝缘性质决定，其中变化明显的是Ret的值，随着布洛芬浓度的增大，Ret值逐步增加。
使用上述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器对实际水样中布洛芬进行检测：
对含布洛芬的样品溶液进行定量检测：首先，实际水样取自中国上海市松江区广富林路的生活小区内，经0.22μm的滤膜过滤后，水样采用pH为6.8的Tris-HCl缓冲液稀释25倍，得到样品溶液；
然后采用将上述的电化学核酸适配体生物传感器用超纯水冲洗后浸入待测样品水溶液中，在室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的布洛芬，然后置于浓度为5mmol/L的Fe(CN)6 3-/4电解液(Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的摩尔比为1∶1，Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol/L，含0.1mol/L KCl)中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，振幅为±5mV，频率为0.1-1.0×105Hz，得到样品溶液的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret1。
借助上述的传感器灵敏度曲回归方程ΔRet＝1067.9logC+4850.2，相关系数R2＝0.9757，进行计算得出水样中布洛芬的含量为8.25ng/L。
对比例1：电化学核酸适配体方法对萘普生的检测
采用与实施例1相同的方法制备检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器。用交流阻抗法对电极的修饰过程进行表征，并对电化学免疫传感器对萘普生的阻抗值响应进行测试。实验采用三电极体系，电化学免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，以5mmol/L Fe(CN)6 3-/4电解质溶液(Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的摩尔比为1∶1，Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol/L，含0.1mol/L KCl)为测试底液，在CHI 760d电化学工作站上，进行电化学阻抗检测。起始电压为0.2V，振幅为±5mV，频率在0.1～10000Hz范围内进行电化学交流阻抗表征，并记录EIS曲线图。
首先，将免疫传感器分别置于1.0ng/mL的布洛芬、萘普生水溶液中，测定其EIS响应值。结果如附图4，说明萘普生电阻响应值ΔRet远低于布洛电阻响应值ΔRet，说明在此实验条件下，萘普生不能引起布洛芬适配体构象变化，即此方法可以应用于特异性识别萘普生和布洛芬的混合物。
对比例2电化学核酸适配体方法对氟比洛芬的检测
采用与实施例1相同的方法制备检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器。用交流阻抗法对电极的修饰过程进行表征，并对电化学免疫传感器对氟比洛芬的阻抗值响应进行测试。实验采用三电极体系，电化学免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，以5mmol/L Fe(CN)6 3-/4电解质溶液(Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的摩尔比为1∶1，Fe(CN)6 3-和Fe(CN)6 4-的总浓度为5mmol/L，含0.1mol/L KCl)为测试底液，在CHI 760d电化学工作站上，进行电化学阻抗检测。起始电压为0.2V，振幅为±5mV，频率在0.1～10000Hz范围内进行电化学交流阻抗表征，并记录EIS曲线图。首先，将免疫传感器分别置于1.0ng/mL的布洛芬、氟比洛芬水溶液中，测定其EIS响应值。结果如附图4说明氟比洛芬电阻响应值ΔRet远低于布洛芬萘普生电阻响应值ΔRet，接近空白溶液响应值ΔRet，萘普生不能引起布洛芬适配体的构象变化，即此方法可以特异性识别萘普生和氟比洛芬的混合物。

Claims (7)

1.一种检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，其特征在于，包括电极以及固定在电极上的布洛芬适配体。
2.如权利要求1所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，其特征在于，所述的布洛芬适配体为长度为76bp的单链DNA探针，其5′端修饰了巯基。
3.如权利要求1所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，其特征在于，所述的布洛芬适配体的序列为：
5′-SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3′。
4.如权利要求1所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器，其特征在于，所述的电极为玻碳电极或金电极。
5.权利要求1-4中任一项所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：将裸电极抛光后，依次置于硝酸溶液，无水乙醇和蒸馏水中超声3-8min，晾干得到修饰后的电极，将含有布洛芬适配体的溶液滴涂于所述的修饰后的电极上，在室温下孵化30min-6h，最后将电极于室温下浸泡在巯基乙醇溶液中过夜组装，进行非特异性位点封闭，清洗后，得到检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器。
6.如权利要求5所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的含有布洛芬适配体的溶液由将布洛芬适配体加入到pH为6.8的Tris-HCl缓冲溶液中得到，布洛芬适配体的浓度为1μmol/L。
7.一种应用权利要求1-6中任一项所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器检测环境水样中的布洛芬的方法，其特征在于，包括：采用三电极体系，以权利要求1-6中任一项所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，进行电化学阻抗检测；将权利要求1-6中任一项所述的检测布洛芬的电化学核酸适配体生物传感器放入不同浓度的布洛芬标准液中，分别孵育后，再进行电化学阻抗检测；以阻抗的变化绘制标准曲线，利用该标准曲线测定环境水样中的布洛芬的含量。
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