CN106680337A - 肝素的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及肝素的定量检测方法，包括：1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；2)将多肽修饰于所述金电极表面；3)将巯基己醇修饰于所述金电极表面，用于对未修饰上多肽的金电极表面进行占位；4)将所述金电极插入待测液中进行反应，并采集相应电化学阻抗谱，计算阻抗值；5)根据阻抗值与肝素浓度的对应关系，获得待测液中肝素的浓度；其中，所述多肽序列为CGSGRKRLQVQLSIRT。本案提出的对肝素的检测方法具有灵敏度高、特异性好、抗干扰、成本低的特点，检测限为0.01μg/mL，通过设计的特异性多肽与电化学技术的结合，可以实现肝素生物传感的应用。

Description

肝素的定量检测方法
技术领域
本发明涉及一种肝素的定量检测方法，特别涉及一种基于特异性多肽修饰的对肝素的电化学检测方法。
背景技术
肝素是一种天然存在的含高电荷密度的聚阴离子的生物大分子，是糖胺聚糖(GAG)家族中最结构复杂的成员。肝素通过与凝血酶抑制剂如抗凝血酶III(ATIII)的相互作用而在血液凝固级联中起静脉内抗凝剂作用。因此，肝素被认为是临床中广泛使用的预防和治疗剂，特别是作为医学上用于手术的抗凝血剂。传统的血液中的肝素浓度检测方法(例如aPTT技术、抗Xa测定法或血栓粘度计(TEG))存在一些难题，如成本昂贵，灵敏度低，有些不能提供精确定量的信息等。
近年来，电化学技术发展迅速，具有许多优点，如高灵敏度、快速响应和使用价格低廉的仪器和试剂。而与此同时，多肽由于其对特异性分析物具有强的结合力、高生物相容性和在水溶液中的高溶解度而被广泛用于生物传感器。因此本发明开发出了一种选择性高、敏感性高的检测肝素的新方法。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种肝素的定量检测方法，采用电化学的方法，在金电极上修饰多肽后，浸入待测试样品中，样本中的肝素会与之结合，并且发生电化学阻抗谱(EIS)的响应，可通过电化学工作站读出交流阻抗信息，经分析，其与肝素浓度在一定的浓度范围内存在线性关系，检测限为0.01μg/mL，远低于临床需要的肝素水平。此外，特异性多肽的结合显示出很高的亲和力，并且不受其他生物分子的干扰。所提出的方法也适用于人类全血中的肝素测量。
为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：
一种肝素的定量检测方法，其包括：
1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；
2)将多肽修饰于所述金电极表面；
3)将巯基己醇修饰于所述金电极表面，用于对未修饰上多肽的金电极表面进行占位；
4)将所述金电极插入待测液中进行反应，并采集相应电化学阻抗谱，计算阻抗值；
5)根据阻抗值与肝素浓度的对应关系，获得待测液中肝素的浓度；
其中，所述多肽序列为CGSGRKRLQVQLSIRT。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，对金电极进行预处理包括：
将金电极在修饰前浸泡于水虎鱼洗液中，以除去电极表面吸附的杂质；其中，以体积比为计，所述水虎鱼洗液的组成为98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，对金电极进行预处理还包括：将金电极用碳化硅砂纸打磨至呈镜面光滑，随后将金电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，对金电极进行预处理还包括：将金电极用0.5M H2SO4溶液清洗，随后用氮气干燥以待后续的修饰。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，将多肽修饰于所述金电极表面具体包括：将经预处理的金电极与100μM多肽溶液在常温下反应16小时；其中，所述多肽溶液中包括有20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，将巯基己醇修饰于所述金电极表面具体包括：将已修饰有多肽的金电极在1mM巯基己醇(MCH)溶液中浸泡30分钟，随后用双蒸水彻底冲洗并在氮气流中干燥待用。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，所述交流阻抗电化学法采用三电极系统，其中，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极；交流阻抗所用缓冲液为含有KCl、[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的水溶液。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，所述KCl的浓度为1M。
优选的是，所述的肝素的定量检测方法，其中，所述[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的浓度之和为5mM。
本发明的有益效果是：本案提出的对肝素的检测方法具有灵敏度高、快速、成本低的特点，检测限为0.01μg/mL，通过设计的特异性多肽与电化学技术的结合，可以实现肝素生物传感的应用。
附图说明
图1为本案肝素的电化学检测示意图。
图2为金电极不同修饰阶段的交流阻抗图：(a)裸金电极；(b)多肽修饰后；(c)在与肝素相互作用后；(d)在肝素酶处理后。
图3为血样的TEG测试结果：(a)普通杯，(b)肝素酶杯。
图4为结合肝素后的多肽修饰电极的Nyquist图，(a-f)：0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL。
图5为肝素浓度相对应的阻抗值的标准曲线，图中误差条表示三次独立测量的相对标准偏差。
图6为肝素检测量(10.0μg/mL)相对于其他过量的干扰生物分子(包括葡萄糖、ADP、DNA、BSA)的选择性对比图：(a)为电化学阻抗谱图，(b)为电阻值的直方图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案列出一实施例的肝素的定量检测方法，具体可包括：
1)实验中使用金电极作为工作电极。电极在修饰前需在新配置的水虎鱼洗液(98％H2SO4：30％H2O2＝3:1)中浸泡5分钟，除去电极表面吸附的杂质。
2)用蒸馏水洗干净后，将电极用碳化硅砂纸(3000目)打磨到镜面光滑。然后，将电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗各5分钟。接着，在使用前先在氮气氛内干燥。
3)处理过的电极用0.5M H2SO4溶液进行电化学清洗。然后，将电极用氮气干燥以进一步修饰。
4)将经预处理的电极与100μM多肽溶液(20mM HEPES和10mM TCEP，pH 7.0)在室温下反应16小时。多肽序列为CGSGRKRLQVQLSIRT。将修饰的电极进一步在1mM MCH中浸泡30分钟，用于对未修饰上多肽的金电极表面进行占位，从而可以防止电极界面上的物理吸附。然后，用双蒸水彻底冲洗并在氮气流中干燥用于以下实验。
5)将多肽修饰的电极在室温下浸入100μL具有不同浓度的肝素中。多肽可以将肝素定位在电极表面上。反应3小时后，用双蒸水小心冲洗电极，除去非特异性吸附的肝素。
6)所有电化学实验均使用计算机控制的CHI 660D电化学工作站(CHInstruments，中国)进行。使用三电极系统，其中工作电极是与铂对电极和饱和甘汞参比电极结合的金电极(直径2mm)。EIS的缓冲液为含有1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液(5mM[Fe(CN)6]3-/4-表示[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的浓度之和为5mM)。
此外，本案还使用了血栓弹力图仪测试分析肝素来作为对照方法：收集静脉血样品并预先注射到柠檬酸钠抗凝剂管中。将1mL血液样品加入到标准高岭土试剂中，充分混合，并静置4分钟用于活化。然后，仪器的两个通道装载普通杯(测试类型为CK-柠檬酸化高岭土)和肝素酶杯(测试类型为具有肝素酶的CKH-柠檬酸化高岭土)。接着，加入20μL CaCl2试剂和340μL活化血液样品，然后开始弹力测量，测量时间约30分钟。测试结果参见图3。
图2中的EIS用于表征多步表面修饰阶段电极的电化学性质，包括在电极上修饰多肽，肝素的组装和进一步的肝素酶处理。随着电化学频率的增加，典型的阻抗谱通常包含与扩散状态和电子转移过程相对应的线性部分和半圆部分。半圆部分越大，阻抗越大。如图2所示，在裸电极(曲线a)上没有观察到阻抗谱的明显半圆区域，由于空间位阻和正电荷的平衡，在多肽修饰的电极(曲线b)上出现一个微小半圆区域。具有明显扩大的半圆形区域的曲线c表示多肽修饰的电极可以特异性吸附肝素，这证明结合的肝素在电极的界面上有效地阻碍电荷转移。在肝素通过肝素酶降解后观察到阻抗谱的大幅减少(曲线d)。
图3通过TEG的实验验证在肝素酶的作用下，样本中的肝素会发生降解，从而抵消肝素对血液凝固的影响。该实验结果可用于验证图2中肝素酶降解肝素从而使阻抗值恢复为原有水平这一现象。
图4表明通过多肽修饰电极的肝素结合反应，可以通过电化学阻抗值读数来评估不同的肝素水平。图4显示了不同浓度肝素的典型的nyquist图。阻抗值随着肝素浓度的增加而增加。
图5表明阻抗值在0.05至10.0μg/mL的范围内显示与肝素浓度的对数呈线性关系。回归方程为y＝256.2x+1298.13(R2＝0.995，重复次数n＝3)，其中y是阻抗值，x是肝素浓度的对数。检测限为0.01μg/mL，不仅优于现有技术中的方法，而且远低于手术后和长期治疗的肝素治疗剂量的最大水平。
图6通过使用一些过量的干扰生物分子(包括葡萄糖，ADP，DNA和BSA)来验证所提出的多肽方法的特异性。在肝素测定和对照实验之间存在显着的电化学信号差异。因此，实验结果表明多肽-肝素的结合是有效和可靠的，而所有对照分子的阻抗可以忽略不计，证实了所提出方法的高选择性。(ADP：二磷酸腺苷。BSA：牛血清白蛋白。)
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
多肽序列为：CGSGRKRLQVQLSIRT

Claims (9)

1.一种肝素的定量检测方法，其特征在于，包括：
1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；
2)将多肽修饰于所述金电极表面；
3)将巯基己醇修饰于所述金电极表面，用于对未修饰上多肽的金电极表面进行占位；
4)将所述金电极插入待测液中进行反应，并采集相应电化学阻抗谱，计算阻抗值；
5)根据阻抗值与肝素浓度的对应关系，获得待测液中肝素的浓度；
其中，所述多肽序列为CGSGRKRLQVQLSIRT。
2.如权利要求1所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，对金电极进行预处理包括：
将金电极在修饰前浸泡于水虎鱼洗液中，以除去电极表面吸附的杂质；其中，以体积比为计，所述水虎鱼洗液的组成为98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1。
3.如权利要求2所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，对金电极进行预处理还包括：将金电极用碳化硅砂纸打磨至呈镜面光滑，随后将金电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗。
4.如权利要求3所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，对金电极进行预处理还包括：将金电极用0.5M H2SO4溶液清洗，随后用氮气干燥以待后续的修饰。
5.如权利要求1所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，将多肽修饰于所述金电极表面具体包括：将经预处理的金电极与100μM多肽溶液在常温下反应16小时；其中，所述多肽溶液中包括有20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和10mM的三(2-羧乙基)膦。
6.如权利要求1所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，将巯基己醇修饰于所述金电极表面具体包括：将已修饰有多肽的金电极在1mM巯基己醇溶液中浸泡30分钟，随后用双蒸水彻底冲洗并在氮气流中干燥待用。
7.如权利要求1所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，所述交流阻抗电化学法采用三电极系统，其中，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极；交流阻抗所用缓冲液为含有KCl、[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的水溶液。
8.如权利要求7所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，所述KCl的浓度为1M。
9.如权利要求7所述的肝素的定量检测方法，其特征在于，所述[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的浓度之和为5mM。
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