CN103808775A

CN103808775A - 一种连续检测肝素的方法及其装置

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Publication number: CN103808775A
Application number: CN201410092144.4A
Authority: CN
Inventors: 秦伟; 雷佳宏; 丁家旺; 陈燕
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: CN103808775B

Abstract

本发明涉及肝素检测，具体来说涉及一种连续、快速检测肝素的方法及其装置。利用外加恒电流的作用促进鱼精蛋白在聚离子敏感膜内的扩散，使电极在线再生，对肝素进行连续检测。将膜相中含有鱼精蛋白的聚离子敏感膜电极置于流动注分析系统中，当肝素样品随载液流入检测池，鱼精蛋白与肝素的特异性作用使电极产生电位信号；利用鱼精蛋白在外加恒电流作用下的快速更新实现电极的在线再生，从而实现对肝素的连续检测。本发明采用流动注射分析仪控制，使操作简便，易于实现自动化。

Description

一种连续检测肝素的方法及其装置

技术领域

本发明涉及肝素检测，具体来说涉及一种连续、快速检测肝素的方法及其装置。

背景技术

在临床中，肝素的检测是通过测定活化凝血时间（ACT）或者活化部分凝血活酶时间（APTT）而间接实现的。血小板的数量和功能会影响ACT的准确性与可靠性；APTT虽然排除了血小板的影响，但不适用于全血测定。聚离子敏感膜电极特异性强、灵敏度高，已被用于全血样品中肝素的测定。然而，聚离子敏感膜电极产生的类稳态电位响应，是水相中待测聚离子在膜相中的离子交换剂协助作用下被萃取进入膜相、并向膜本体扩散的过程；此过程不可逆，电极无法重复使用，使其应用受到限制。采用脉冲电流调控模式或计时电位模式，虽然能够使电极重复使用，却未能用于流动分析之中，不利于连续检测；另外，氯离子的存在也会对电极产生较大的干扰。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种连续、快速检测肝素的方法及其装置。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种连续检测肝素的方法，将敏感膜中含有鱼精蛋白的聚离子敏感膜电极置于流动注分析系统中，并施加外加恒电流，当待测样品随载液流入检测池中，聚离子敏感膜中的鱼精蛋白与肝素的特异性作用使电极产生电位信号，根据电位变化得到样品溶液中肝素的浓度，同时外加恒电流能够促进鱼精蛋白向聚离子敏感膜内扩散，使电极在线再生，从而实现对肝素的连续检测。

具体检测过程：

（a）将敏感膜中含有鱼精蛋白的聚离子敏感膜电极固定于检测池中，利用电化学工作站测定聚离子敏感膜电极在外加恒电流作用下的电极电位，待电位稳定后得到基线电位；

（b）转换样品阀，使肝素标准溶液随载液流入测量池，肝素与鱼精蛋白相互作用使电极敏感膜表面的鱼精蛋白含量降低，同时水相中的钠离子交换进入膜相并占据阳离子交换位点，引起电位信号变化；肝素标准溶液流出检测池后，电极敏感膜表面的鱼精蛋白在外加恒电流的作用下逐渐恢复至初始状态，电极电位也随之恢复，并产生峰形电位信号；

（c）电极电位恢复后，重复（b）过程，可对肝素进行连续检测；

（d）根据加入肝素标准溶液后产生的峰形电位信号的峰高，对肝素浓度绘制标准曲线；

（e）将实际样品按照（b）所述方法通入检测池进行检测，得到样品的峰形电位信号；通过对照标准工作曲线即得到实际样品浓度。

所述外加恒电流的目的在于促进鱼精蛋白向聚离子敏感膜内的扩散，其大小受到所选用的膜材料及其比例和内充液中鱼精蛋白的浓度的影响。本发明所提供的检测方法中，外加恒电流的大小为0-100A。

所述聚离子敏感膜电极由聚氯乙烯管、内充液和插于其中的内参比电极组成；其中，所述聚氯乙烯管底部设有聚离子敏感膜，所述内充液为含有鱼精蛋白的Tris缓冲溶液，所述内参比电极为银丝。

所述聚离子敏感膜电极使用前在含有鱼精蛋白的Tris缓冲溶液中活化1-24h。

所述聚离子敏感膜是由聚合物基体材料、增塑剂、离子载体和亲脂性盐组成，其重量份数比为20-40:40-80:0.1-10:0.1-10。

所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚（o-NPOE）、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子载体为二壬基萘磺酸；亲脂性盐为四（十二烷基）-四（4-氯苯基）硼酸铵。

一种连续检测肝素的方法的专用装置，专用装置流动分析系统由载液池、样品池、蠕动泵、样品阀、检测池、电位测量装置和废液池组成；载液池与样品阀之间设有第一蠕动泵，样品池与样品阀之间设有第二蠕动泵；样品阀通过管路与检测池相连，电位测量装置插入检测池中；检测池通过管路与第一废液池相连，样品阀通过管路与第二废液池相连。

所述样品阀为六通阀，并设有能够定量载入样品溶液的定量环。所述检测池为喷壁式流通池。

电化学工作站通过导线分别连接外参比电极、聚离子敏感膜电极和辅助电极，外参比电极、聚离子敏感膜电极与辅助电极插入待检测池中；所述外参比参比电极为Ag/AgCl（3M KCl）电极，辅助电极为铂丝电极。

作用原理：聚离子敏感膜表面的鱼精蛋白与样品溶液中的肝素结合，形成的络合物进入水相，同时水相中的钠离子交换进入敏感膜的膜相，占据阳离子交换位点，可引起电位的变化；在外加恒电流的作用下，由内充液中渗透进入敏感膜的膜相的鱼精蛋白分子可以克服在膜相中迁移速率慢的缺点，快速地向敏感膜表面补充，使电极恢复至初始状态，从而实现对肝素的连续检测。

本方法与现有技术相比，具有如下优点：

1.本发明中用于识别肝素的鱼精蛋白大量存在于电极的内充液之中，可以使敏感膜中消耗的鱼精蛋白得到及时地补充；外加恒电流可以促进鱼精蛋白在膜相中的扩散，从而促进电极的恢复，使电极能够用于连续测定。

2.本发明中将聚离子敏感膜电极放置于流动分析系统中，采用流动注射分析仪控制，使操作简便，易于实现自动化。

附图说明

图1为本发明实施例提供的检测装置示意图，其中1为载液池，2为样品池，3-1、3-2为蠕动泵，4为样品阀，5为检测池，6为聚离子敏感膜电极，7为外参比电极，8为辅助电极，9为电化学工作站，10-1、10-2为废液池。

图2为为本发明实施例提供的检测装置中样品阀的示意图（其中4为样品阀，11为定量环，1为载液池，2为样品池，5为检测池，10-2为第二废液池）。

图3为本发明实施例提供的检测装置中电极的示意图（其中6为聚离子敏感膜电极，12为聚离子敏感膜，13为内充液，14为内参比电极）。

图4为本发明实施例提供的测定不同浓度肝素标准溶液的电位响应曲线。

图5为本发明实施例提供的法测定不同浓度肝素标准溶液的标准工作曲线。工作曲线方程为–ΔE=10.80C–0.84，其中ΔE单位为mV,C单位为U mL^-1。

图6为本发明实施例提供的测定不同浓度硫氰根离子和水杨酸根离子的电位响应。

图7为本发明实施例提供的利用本发明检测方法在一个月内对1.0UmL^-1肝素标准溶液的电位响应。

具体实施方式

实施例1

以本发明提供的检测方法测定缓冲溶液中的标准肝素样品为例。

检测装置：

如图1所示，流动分析系统包括载液池1、样品池2、第一蠕动泵3-1、第二蠕动泵3-2、样品阀4、检测池5和第一废液池10-1、第二废液池10-2；载液池1和检测池5通过管路连通；检测池5上设有电位测量装置，并且检测池5与第一废液池10-1相连；载液池1和检测池5之间设有样品阀4；样品池2与样品阀4之间通过管路连通，并且样品阀4与第二废液池10-2相连。

如图2所示，所述样品阀为六通阀，其中两个接口用于连接定量环11，另外四个接口分别连接载液池1、检测池5、样品池2和第二废液池10-2。初始状态（如图2A）下，载液在第一蠕动泵3-1驱动作用下，流经样品阀4并进入检测池5，最终进入第一废液池10-1；样品溶液在第二蠕动泵3-2驱动作用下进入样品阀4并充满定量环11，最终进入第二废液池10-2。进样状态（如图2B）下，转动样品阀，则定量环11中的样品溶液随载液进入检测池5；进样结束后，将样品阀转回初始状态，即完成一次进样。

所述电位测量装置由聚离子敏感膜电极6、外参比电极7、辅助电极8和电化学工作站9构成；其中，聚离子敏感膜电极6、外参比电极7和辅助电极8分别插入检测池5中，另一端由导线连接至电化学工作站9。

如图3所示，聚离子敏感膜电极6由聚离子敏感膜12、内充液13和内参比电极14构成。

所述外参比电极为Ag/AgCl(3M KCl)电极，辅助电极为铂丝电极，内参比电极为银丝电极。

聚离子敏感膜电极的制备：

分别称取12.0mg二壬基萘磺酸，12.0mg四（十二烷基）-四（4-氯苯基）硼酸铵，60.0mg聚氯乙烯，122.0mg邻-硝基苯辛醚，溶入3mL四氢呋喃溶液中，搅拌均匀，室温下在平底小烧杯（直径3.6cm）中放置12h，待四氢呋喃完全挥发干后即得到有弹性的聚合物敏感膜。

将所述聚合物敏感膜用打孔器切割成直径为0.6cm的均匀圆形切片，利用四氢呋喃将切片黏附于聚氯乙烯管底部，得到聚离子敏感膜电极。电极内部注入含有50mM Tris-HCl（pH=7.4）、50.0mg L^-1的鱼精蛋白和0.12M NaCl的混合溶液作为内充液；电极初次使用前需在含有50mMTris-HCl（pH=7.4）、50.0mg L^-1的鱼精蛋白和0.12M NaCl的混合溶液中活化12h；电极不用时需在4℃下保存。

实施步骤：

（a）将载液池内含有0.12M NaCl的Tris-HCl（50mM,pH=7.4）缓冲溶液以1.8mL min^-1的流速通过流动分析系统中的样品阀和检测池，流入废液池；利用电化学工作站在聚离子敏感膜电极上施加大小为20nA的阳极电流，并测定电极电位，待电位稳定后得到基线电位；

（b）将样品池内含有已知浓度的肝素标准溶液泵入样品阀并充满500μL定量环，转换样品阀，使定量环中的肝素标准溶液随载液流入测量池，记录肝素标准溶液流经检测池前后的电极电位变化，得到样品的电位信号；

（c）电极电位恢复后，重复（b）过程，对已知浓度的肝素标准溶液进行连续检测；

（d）根据加入肝素标准溶液后产生的电位信号（如图4），对肝素浓度绘制标准曲线（如图5）。

如图4，本发明提供的检测方法能够对肝素样品进行连续电位检测，且电极恢复快速。

实施例2

以本发明提供的检测方法对硫氰根离子的抗干扰能力测试为例。

以含有0.12M NaCl的Tris-HCl（50mM,pH=7.4）缓冲溶液配制10^-7-10^-3M的硫氰根离子（SCN^-）标准溶液。

内充液为50mM Tris-HCl（pH=7.4）、50.0mg L^-1的鱼精蛋白和0.12M NaCl的混合溶液。

采用实施例1所述的检测装置和聚离子敏感膜电极，按照实施例1所述的实施步骤对10^-7-10^-3M的硫氰根离子标准溶液进行电位测定，根据加入硫氰根离子标准溶液后产生的电位信号，对硫氰根离子的对数浓度绘制标准曲线（如图6）。

本发明提供的检测方法对亲脂性的硫氰根离子具有较好的抗干扰能力，有望应用于复杂血样中的肝素检测。

实施例3

以本发明提供的检测方法对水杨酸根离子的抗干扰能力测试为例。

以含有0.12M NaCl的Tris-HCl（50mM,pH=7.4）缓冲溶液配制10^-7-10^-3M的水杨酸根离子（Sal^-）标准溶液。

采用实施例1所述的检测装置和聚离子敏感膜电极，按照实施例1所述的实施步骤对10^-7-10^-3M的水杨酸根离子标准溶液进行电位测定，根据加入水杨酸根离子标准溶液后产生的电位信号，对水杨酸根离子的对数浓度绘制标准曲线（如图6）。

本发明提供的检测方法对亲脂性的水杨酸根离子具有较好的抗干扰能力，有望应用于复杂血样中的肝素检测。

实施例4

以本发明提供的检测方法在一个月内的稳定性为例。

以含有0.12M NaCl的Tris-HCl（50mM,pH=7.4）缓冲溶液配制1.0U mL^-1的肝素标准溶液。

采用实施例1所述的检测装置和聚离子敏感膜电极进行电位测定。

将在含有50mM Tris-HCl（pH=7.4）、50.0mg L^-1的鱼精蛋白和0.12M NaCl的混合溶液中活化12h的聚离子敏感膜电极保存于4℃条件下，于0-30天时使用保存的电极对1.0U mL^-1肝素标准溶液进行电位测定。

实施步骤：

（b）将样品池内1.0U mL^-1的肝素标准溶液泵入样品阀并充满500μL定量环，转换样品阀，使定量环中的肝素标准溶液随载液流入测量池，记录肝素标准溶液流经检测池前后的电极电位变化，得到样品的电位信号；

（c）电极电位恢复后，重复（b）过程，对1.0U mL^-1的肝素标准溶液进行连续多次测定；

（d）根据加入1.0U mL^-1肝素标准溶液后产生的电位信号，对电极保存时间绘制标准曲线（如图7）。

本发明提供的检测方法中的聚离子敏感膜电极具有较好的稳定性，在一个月内电位响应不会发生明显变化。

Claims

1.一种连续检测肝素的方法，其特征在于：将敏感膜中含有鱼精蛋白的聚离子敏感膜电极置于流动注分析系统中，并施加外加恒电流，当待测样品随载液流入检测池中，聚离子敏感膜中的鱼精蛋白与肝素的特异性作用使电极产生电位信号，根据电位变化得到样品溶液中肝素的浓度，同时外加恒电流能够促进鱼精蛋白向聚离子敏感膜内扩散，使电极在线再生，从而实现对肝素的连续检测。

2.按权利要求1所述的连续检测肝素的方法，其特征在于：

具体检测过程：

3.按权利要求1或2所述的连续检测肝素的方法，其特征在于：所述聚离子敏感膜电极由聚氯乙烯管、内充液和插于其中的内参比电极组成；其中，所述聚氯乙烯管底部设有聚离子敏感膜，所述内充液为含有鱼精蛋白的Tris缓冲溶液，所述内参比电极为银丝。

4.按权利要求3所述的连续检测肝素的方法，其特征在于：所述聚离子敏感膜电极使用前在含有鱼精蛋白的Tris缓冲溶液中活化1～24h。

5.一种权利要求1所述的连续检测肝素的方法的专用装置，其特征在于：专用装置流动分析系统由载液池、样品池、蠕动泵、样品阀、检测池、电位测量装置和废液池组成；载液池与样品阀之间设有第一蠕动泵，样品池与样品阀之间设有第二蠕动泵；样品阀通过管路与检测池相连，电位测量装置插入检测池中；检测池通过管路与第一废液池相连，样品阀通过管路与第二废液池相连。

6.按权利要求5所述的连续检测肝素的方法的专用装置，其特征在于：所述样品阀为六通阀，并设有能够定量载入样品溶液的定量环；所述检测池为喷壁式流通池。

7.按权利要求5所述的连续检测肝素的方法的专用装置，其特征在于：电化学工作站通过导线分别连接外参比电极、聚离子敏感膜电极和辅助电极，外参比电极、聚离子敏感膜电极与辅助电极插入待检测池中；所述外参比参比电极为Ag/AgCl（3M KCl）电极，辅助电极为铂丝电极。