CN104655701A - 一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微电极及其制备,特别是一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极及其制备方法。锥形玻璃微电极管腔内填充有膜后灌充液,锥形玻璃微电极管尖端部注有Pb2+液态离子交换剂LIX,锥形玻璃微电极管内安装有Ag/AgCl丝导线,锥形玻璃微电极管的管口用环氧树脂密封并固定Ag/AgCl丝。本发明通过非损伤微测系统可以实现对样品表面微观区域Pb2+浓度、流速及其运动方向等信息的实时、动态、无损检测,为生物和非生物材料表面Pb2+的微观过程和机制研究提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种微电极及其制备,特别是一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极及其制备方法。
背景技术
深入了解重金属离子的植物根际微界面过程不仅有助于揭示超积累植物吸收重金属的微观过程和机制,对控制重金属经土壤-作物系统向食物链传递延伸同样具有重要的现实意义。受技术手段和条件限制,主要是从离子的静态累积角度对这一过程进行描述和阐述。相关研究通常是以整个根部器官或组织作为研究对象并通过化学分析方法(如原子吸收、原子发射及其衍生方法)测定植物或外部溶液重金属静态浓度变化来间接认知。这些技术操作相对简单、易行,但同时也存在其局限性,主要表现在两方面:其一,破坏性取样,即先将植物组织研磨处理后再通过化学分析的方法检测离子浓度,不能反映活体植物吸收重金属的特性;其二,时空分辨率低,其测定的是一定时间内整个根系对离子的吸收情况,不能精确地测定短时间内植物根系微区离子被吸收的情况。尽管后来人们相继开发出一些用于活体检测的方法:同位素示踪技术、膜片钳技术和荧光显微成像技术等,并获得了一些有关离子分布和运动的信息,但这些方法普遍具有时间分辨率差的问题。基于上述方法获取的研究结果,一定程度上反应了植物吸收重金属离子的规律,却无法真实反映活体条件下的动态作用过程机制。受检测技术手段、研究方法和技术条件限制,缺乏对根系界面过程活体、实时、动态信息的了解,因此难以对植物吸收、释放及转运重金属离子的微观过程机制形成更深入理解和统一认识。
利用微电极进行测量的非损伤微测技术(Non-Invasive Micro-TestTechnology,NMT)[1],是在计算机的控制下,利用离子/分子选择电极以不接触被测材料的非损伤方式测量进出被测样品的离子/分子浓度(μΜ级)、流速(10-12mole·S-1·cm-2)及其三维运动方向的信息,从而克服了由于对样品的破坏性而造成的测试结果无法合理解释甚至造成研究假象的问题。同时,以其独特的时间(0.5s)和空间(2-5μm)分辨率,正好适合于细胞内外离子/分子活性变化的测定,在时间和空间尺度上都具有无法替代的优势。
非损伤微测系统微电极的种类有玻璃电极、金属电极、碳丝电极等,可以测量的离子和分子有H+、Ca2+、K+、Na+、Mg2+、Cl-、NH4 +、NO3 -及O2、H2O2、CO2、NO等[2-11],被测样品可以是单细胞、多细胞、组织器官等生命材料,也可以是金属材料、颗粒材料、膜材料等非生命材料。随着离子/分子选择电极种类的不断增多以及电子线路系统和计算机硬件软件的逐步完善,非损伤微测技术逐渐被广泛应用到生命科学、基础医学、药学以及金属腐蚀研究等诸多领域。有学者开始将其应用于重金属离子,然而目前开发的能成熟应用于非损伤微测系统的重金属离子选择性微电极仅有Cd2+的一种,限制了该技术在环境科学领域的应用和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极及其制备方法。
为了实现上述任务,本发明采取如下的技术解决方案:
一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极,包括锥形玻璃微电极管1,锥形玻璃微电极管1腔内填充有膜后灌充液2,锥形玻璃微电极管1尖端部注有Pb2+液态离子交换剂LIX 5,锥形玻璃微电极管1内安装有Ag/AgCl丝导线3,锥形玻璃微电极管1的管口用环氧树脂密封并固定Ag/AgCl丝3。
所述锥形玻璃微电极管1尖端直径为4~5μm。
所述膜后灌充液由1.0mM PbCl2和1.0mM Na2EDTA组成,pH调到7。
所述的Pb2+液态离子交换剂LIX按质量百分比计5-15%二硫化四丁基秋兰姆、2-10%四苯硼酸钠、3-5%四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵和70-80%2-硝基苯基辛基醚。
一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极的制备方法,由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成尖端直径为4~5μm的锥形玻璃微电极管,锥形玻璃微电极管内壁进行硅烷化使其变为疏水性,疏水处理后从玻璃微电极管后端注入膜后灌充液,尖端灌充Pb2+液态离子交换剂LIX(liquid ionexchanger),Ag/AgCl导线安装于微电极管内,在管尾部用环氧树脂固定Ag/AgCl丝和密封玻璃管,即制得Pb2+选择性微电极。
所述膜后灌充液的灌充高度为锥形玻璃微电极管长度的1/4~1/2;所述LIX的灌充高度为80~120μm。
所述将Ag/AgCl丝导线插入膜后灌充液中使其一端直至接近锥形玻璃微电极管的尖端,然后用环氧树脂在锥形玻璃微电极管的管口固定Ag/AgCl丝和密封锥形玻璃微电极管,并使Ag/AgCl导线另一端一端露出锥形玻璃微电极管尾部,即制得Pb2+选择性微电极。
Ag/AgCl导线3的制备步骤如下:
取一根适当长的银丝,用砂纸打磨以除去其表面的氧化层;
取一根贵金属丝或碳棒接到电源的阴极上,将打磨过的银丝接到电源的阳极上,在1.5V的直流电压下,在饱和氯化钾溶液中电镀2s即可制成Ag/AgCl丝。
一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极的应用,所述Pb2+选择性微电极适用于实时、动态、无损测定样品表面微观区域内Pb2+的浓度、流速及运动方向的信息。
具体是,在待测样品的固液界面上采用所述选择性微电极测定其表面微观区域内Pb2的浓度、流速及运动方向的信息。
一种应用于非损伤微测系统的Pb2选择性微电极的检测方法,其特征在于:采用所述选择性微电极在待测样品的固液界面上微观区域内,通过微电极尖端灌充的离子交换剂实现对Pb2+的选择性识别,测定微观区域内设定距离的两点之间的电位差,而后通过Fick第一扩散定律获得离子的移动速率,继而实现测定待测样品内Pb2+的浓度、流速及运动方向的信息。
本发明所具有的优点:
本发明的Pb2+选择性微电极,可以实现对样品表面微观区域Pb2+浓度、流速及其运动方向等信息的实时、动态、无损检测,为生物和非生物材料表面Pb2+的微观过程和机制研究提供了一种新方法。其微电极尖端直径在4~5μm之间,可以满足细胞、组织的离子流检测要求;尖端LIX灌充长度为80~120μm;该微电极在10-6M~10-1M Pb2+浓度检测范围内具有很好的线性关系R2=0.9996,能斯特斜率为26.08mV/dec;微电极的响应时间t95%小于1s。
附图说明
图1为本发明实施例提供的Pb2+选择性微电极的结构示意图,其中的标号分别为:1.微电极管;2.灌充液;3.Ag/AgCl导线;4.环氧树脂;5.Pb2+液态离子交换剂LIX。
图2为本发明实施例提供的Pb2+选择性微电极的测定线性响应范围图。
图3为本发明实施例提供的香蒲(Typha latifolia)根尖微区不同位置的Pb2+离子流速图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
Pb2+选择性微电极由图1所示,包括锥形玻璃微电极管1,在玻璃微电极管1的腔内填充有膜后灌充液2,玻璃微电极管1的尖端部注有Pb2+液态离子交换剂5,玻璃微电极管(1)内安装有Ag/AgCl丝导线3,在玻璃微电极管1的尾部用环氧树脂4固定Ag/AgCl丝3和密封玻璃微电极管1。
玻璃微电极管1为单层管,膜后灌充液由1.0mM PbCl2和1.0mMNa2EDTA组成,pH调到7。
铅离子选择性微电极,其尖端为4~5μm,线性响应范围为10-1~10-6M,斜率为26.08mV/-log[Pb2+],检测下限为10-6M。
Pb2+选择性微电极的制备方法,包括下列步骤:
(1)拉制微电极管:按照常规的拉制方式,将硼硅酸盐玻璃毛细管(外径1.5mm,内径1.05mm,长度5cm)固定在加热线圈的中间位置,加热使其自由落下,再将玻璃管的尖端朝上,固定在夹子上,再次加热使其尖端直径在4μm的范围内。在使用前,微电极管需通过显微镜检查其外形,特别是管口是否平整。管口不规整以及管口不是圆形的微电极管都不能使用。
(2)硅烷化:在硅烷化过程中,首先在150℃下预干燥1h以上,除去微电极管内残存的水分和杂质;然后将微电极放置在带盖的玻璃器皿中,向玻璃器皿内倒入2mL 5%的二甲基二氯硅烷(国药集团化学试剂有限公司,北京)作为硅烷试剂,溶剂使用正己烷,在150℃下烘烤30min,使其蒸气进入并附着在微电极的尖端。硅烷化处理过的微电极应保存在干燥、无尘的避光容器里。
(3)注入灌充液:用接上细管的l.0mL注射器将1.0mM PbCl2和1.0mM Na2EDTA,pH调到7的灌充液从管后端缓慢推入经硅垸化的微电极管内,产生20.0mm灌充液柱。在显微镜下观察电极内是否有气泡,若存在气泡,须将电极尖端朝下放置一段时间,直至气泡完全从微电极管中消失。
(4)灌充Pb2+液态离子交换剂LIX:在双目显微镜下,首先用尖端开口为50~60μm的玻璃毛细管蘸取少许Pb2+LIX,尖端充满即得到了盛装Pb2+LIX的玻璃毛细管即LIX载体。从尾部采用注射器给其一定压力,使LIX液面凸出。再在显微镜下将此LIX载体与上述待灌充的微电极管尖端放置于同一水平面相对,小心将待灌充微电极管尖端与LIX的凸液面相接触,LIX逐渐渗入到微电极管尖端。当LIX在微电极管尖端的长度达到80μm时灌充即完成。
(5)如图1所示,将Ag/AgCl丝导线3插入灌充液中直至接近玻璃微电极管1的尖端,然后用环氧树脂4在玻璃微电极管1的管口固定Ag/AgCl丝3和密封玻璃微电极管1,并使Ag/AgCl导线3一端露出玻璃微电极管1尾部,即制得Pb2+选择性微电极。Ag/AgCl导线3的制备步骤如下:
取一根适当长的银丝,用砂纸打磨以除去其表面的氧化层;
取一根贵金属丝或碳棒接到电源的阴极上,将打磨过的银丝接到电源的阳极上,在1.5V的直流电压下,在饱和氯化钾溶液中电镀2s即可制成Ag/AgCl丝。
上述灌充液由1.0mM的PbCl2和1.0mM Na2EDTA,pH调到7。Pb2+液态离子交换剂LIX按质量百分比计,10%(w/w)的二硫化四丁基秋兰姆、8%(w/w)的四苯硼酸钠、3%(w/w)的四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵和79%(w/w)的2-硝基苯基辛基醚。
对上述获得的Pb2+选择性微电极检测范围测试:
离子选择性微电极在一定检测范围内其电位与离子浓度的对数之间呈线性关系,这样能够根据测量得到的微电极电位计算出被测离子浓度。为检测Pb2+选择性微电极的检测范围,配制系列的Pb(NO3)2标准溶液,背景溶液为简化营养液(含0.1mM Ca(NO3)2,0.1mM MgSO4,0.1mM KNO3、1.0mM NaNO3、0.3mM MES)作为测试液。该溶液是植物根系离子流测试中所使用的实际测试液,与作物的营养液成分一致,能够模拟离子选择性微电极的使用环境。溶液pH值为6.0,使用NaOH和HCl调节,MES即吗啉乙磺酸作为pH缓冲液。从而得到不同Pb2+浓度对数与微电极电位之间的对应关系,用以评价微电极性能。离子选择性微电极的性能测试过程在NMT系统(YG-MS-001,美国扬格公司)上完成。
利用上述获得微电极对Pb2+浓度分别为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1M的Pb(NO3)2标定液进行了电位测量。使用同一支微电极通过3次重复测量取其平均值,得到不同Pb2+浓度对数与微电极电位之间的对应关系如图2所示。图2中,Pb2+选择性微电极在Pb2+浓度为10-6~10-1M范围内的能斯特响应斜率为26.08mV/dec,微电极电位与Pb2+浓度对数间的线性相关系数R2=0.9996,说明在该范围内有很好的线性关系,从而能够通过测量微电极电位准确地得到其相应的离子浓度。因此该Pb2+选择性微电极能够满足测量植物细胞、组织、器官微区内的Pb2+浓度及动态变化的需要。
Pb2+选择微电极能斯特响应测试:
微电极电位E与标定液Pb2+浓度C之间的关系可由能斯特方程E=k±slgC(式1)来描述。式中E为微电极与参比电极之间的电压,mV;C为标定溶液中Pb2+浓度,M;s为能斯特斜率,mV/dec;k为能斯特截距,mV。
其中能斯特斜率s理论值的计算公式为s=2.303RT/nF(式2),式中,R为气体常数,8.314J/(K·mol);T为绝对温度,K;F为法拉第常数,9.6487×104C/mol;n为被测离子的化合价,对于二价Pb2+,n=2。在25℃时,Pb2+的能斯特斜率s理论值为29.5mV/dec。
将微电极中的Ag/AgCl导线连接NMT系统(YG-MS-001,美国扬格公司)微电极前置放大器,参考电极与微电极放大器和数据采集系统的地端连接。标定液为Pb2+浓度分别为0.05,0.1和0.5mM的Pb(NO3)2溶液,将微电极和参考电极分别浸入到这三种标定液中,通过NMT采集软件读取并记录微电极的对地电位,即微电极与参考电极的电位差变化。将不同标定液中电极电位代入式(1)中可以得到电极的能斯特斜率。本研究在室温25℃下,使用Pb2+浓度分别为0.05,0.1和0.5mM的测试液作为标定液,测得微电极电位分别为331.34、337.89和358.48mV,代入式(1)可得能斯特斜率为27.54mV/dec,与理论值29.5mV/dec相比,转换率达到93%,符合离子选择性微电极的转化率≥90%的工作要求。试验得到的能斯特斜率与s理论值越接近,说明其性能越好。
实施例2
Pb2+选择性微电极的制备方法,包括下列步骤:
(1)拉制微电极管:按照常规的拉制方式,将硼硅酸盐玻璃毛细管(外径1.5mm,内径1.05mm,长度5cm)固定在加热线圈的中间位置,加热使其自由落下,再将玻璃管的尖端朝上,固定在夹子上,再次加热使其尖端直径在5μm的范围内。在使用前,微电极管需通过显微镜检查其外形,特别是管口是否平整。管口不规整以及管口不是圆形的微电极管都不能使用。
(2)硅烷化:在硅烷化过程中,首先在150℃下预干燥1h以上,除去微电极管内残存的水分和杂质;然后将微电极放置在带盖的玻璃器皿中,向玻璃器皿内倒入2mL 5%的二甲基二氯硅烷(国药集团化学试剂有限公司,北京)作为硅烷试剂,溶剂使用正己烷,在150℃下烘烤30min,使其蒸气进入并附着在微电极的尖端。硅烷化处理过的微电极应保存在干燥、无尘的避光容器里。
(3)注入灌充液:用接上细管的l.0mL注射器将1.0mM PbCl2和1.0mM Na2EDTA,pH调到7的灌充液从管后端缓慢推入经硅垸化的微电极管内,产生25.0mm灌充液柱。在显微镜下观察电极内是否有气泡,若存在气泡,须将电极尖端朝下放置一段时间,直至气泡完全从微电极管中消失。
(4)灌充Pb2+液态离子交换剂LIX:在双目显微镜下,首先用尖端开口为50~60μm的玻璃毛细管蘸取少许Pb2+LIX,尖端充满即得到了盛装Pb2+LIX的玻璃毛细管即LIX载体。从尾部采用注射器给其一定压力,使LIX液面凸出。再在显微镜下将此LIX载体与上述待灌充的微电极管尖端放置于同一水平面相对,小心将待灌充微电极管尖端与LIX的凸液面相接触,LIX逐渐渗入到微电极管尖端。当LIX在微电极管尖端的长度达到100μm时灌充即完成。
(5)如图1所示,将Ag/AgCl丝导线3插入灌充液中直至接近玻璃微电极管1的尖端,然后用环氧树脂4在玻璃微电极管1的管口固定Ag/AgCl丝3和密封玻璃微电极管1,并使Ag/AgCl导线3一端露出玻璃微电极管1尾部,即制得Pb2+选择性微电极。
上述灌充液由1.0mM的PbCl2和1.0mM Na2EDTA,pH调到7。Pb2+液态离子交换剂LIX按质量百分比计,15%(w/w)的二硫化四丁基秋兰姆、5%(w/w)的四苯硼酸钠、5%(w/w)的四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵和75%(w/w)的2-硝基苯基辛基醚。
利用上述获得的电极测定了香蒲(Typha latifolia)根表Pb2+离子流速轮廓。香蒲幼苗浸泡在0.1mM Pb(NO3)2溶液中静置10min后,根摄入Pb2+趋于平衡。按上述方法利用标定好的Pb2+离子选择性微电极进行香蒲根尖(距离根尖0~1000μm)不同部位Pb2+离子流速的测定。如图3所示,负值表示Pb2+由溶液向根流入。从图3可以看出从根尖位置Pb2+流速开始升高,在距根尖0.2~0.3mm处Pb2+内流速度达到最高,但距根尖0.3mm位置后Pb2+流速迅速下降,并趋向于稳定。
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Claims (10)
1.一种应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极,包括锥形玻璃微电极管(1),其特征在于:锥形玻璃微电极管(1)腔内填充有膜后灌充液(2),锥形玻璃微电极管(1)尖端部注有Pb2+液态离子交换剂LIX(liquidion exchanger)(5),锥形玻璃微电极管(1)内安装有Ag/AgCl丝导线(3),锥形玻璃微电极管(1)的管口用环氧树脂密封并固定Ag/AgCl丝(3)。
2.按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极,其特征在于:所述锥形玻璃微电极管(1)尖端直径为4~5μm。
3.按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极,其特征在于:所述膜后灌充液由1.0mM PbCl2和1.0mM Na2EDTA组成,pH调到7.0。
4.按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极,其特征在于:所述的Pb2+液态离子交换剂LIX按质量百分比计5-15%二硫化四丁基秋兰姆、2-10%四苯硼酸钠、3-5%四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵和70-80%2-硝基苯基辛基醚。
5.一种按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极的制备方法,其特征在于:由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成尖端直径为4~5μm的锥形玻璃微电极管,锥形玻璃微电极管内壁进行硅烷化使其变为疏水性,疏水处理后从玻璃微电极管后端注入膜后灌充液,尖端灌充Pb2+液态离子交换剂LIX,Ag/AgCl导线安装于微电极管内,在管尾部用环氧树脂固定Ag/AgCl丝和密封玻璃管,即制得Pb2+选择性微电极。
6.按权利要求5所述应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极的制备方法,其特征在于:所述膜后灌充液的灌充长度为锥形玻璃微电极管长度的1/4~1/2;所述LIX的灌充高度为80~120μm。
7.按权利要求5所述应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极的制备方法,其特征在于:所述将Ag/AgCl丝导线插入膜后灌充液中使其一端直至接近锥形玻璃微电极管的尖端,然后用环氧树脂在锥形玻璃微电极管的管口固定Ag/AgCl丝和密封锥形玻璃微电极管,并使Ag/AgCl导线另一端露出锥形玻璃微电极管尾部,即制得Pb2+选择性微电极。
8.一种权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2+选择性微电极的应用,其特征在于:所述Pb2+选择性微电极适用于实时、动态、无损测定样品表面微观区域内Pb2+的浓度、流速及运动方向的信息。
9.按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2选择性微电极的应用,其特征在于:在待测样品的固液界面上采用所述选择性微电极测定其表面微观区域内Pb2+的浓度、流速及运动方向的信息。
10.一种权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Pb2选择性微电极的检测方法,其特征在于:采用所述选择性微电极在待测样品固液界面的微观区域内,通过微电极尖端灌充的离子交换剂实现对Pb2+的选择性识别,测定微观区域内设定距离的两点之间的电位差,而后通过Fick第一扩散定律获得离子的移动速率,继而实现获取待测样品表面Pb2+的浓度、流速及运动方向的信息。
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