CN110726766B - 一种应用于非损伤微测系统的Zn2+选择性微电极及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微电极，特别是一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极及其制备方法。电极包括锥形玻璃微电极管，锥形玻璃微电极管腔内填充有膜后灌充液，锥形玻璃微电极管尖端部注有Zn²⁺液态离子交换剂LIX，电极通过Ag/AgCl丝与非损伤微测系统连接。本发明通过非损伤微测系统可以实现对被测样品表面微观区域Zn²⁺浓度、流速及其运动方向等信息的实时、动态、无损检测，为生物和非生物材料表面Zn²⁺的微观过程和机制研究提供新的方法。

Description

一种应用于非损伤微测系统的Zn2+选择性微电极及其制备 方法

技术领域

本发明涉及一种微电极，特别是一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极及其制备方法。

背景技术

各种离子进出植物细胞的过程对于维持其自身活性至关重要，深入研究营养离子和胁迫离子在植物根际的微观过程及交互作用机制将有助于揭示植物适应逆境胁迫的生理机制，同时也可为农作物的安全生产技术创新提供科学依据。

对于植物吸收、转运金属离子的研究通常是以整个植物的器官或组织作为研究对象并通过化学分析其含量的方法^[1-3]。这些传统分析技术操作相对简单、易行，但同时也存在其局限性，主要表现在两方面：其一，对样本的破坏性，即先将植物组织干燥研磨处理后再通过化学分析的方法检测离子浓度，不能反映活体植物吸收金属离子的特性；其二，分析的时空分辨率低，其反映的是一定时间内整个根系对某种离子吸收浓度的平均值，无法实时测定植物根系微区离子的动态吸收过程。后来出现的同位素示踪、荧光显微成像技术和膜片钳技术等，虽然也在一定程度上可以对活体植物进行离子分布和运动规律的检测，但是这些方法普遍具有时间分辨率差的缺点。

非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique，NMT)是一种实时、动态测定活体材料的新技术，它通过测定进出材料的离子或分子的流速反映生命活动的规律，是生理功能研究的最佳工具之一^[4,5]。非损伤微测技术具有独特的分析时间(0.5s)和空间(2-5μm)分辨率，通过它可以实现对植物根际离子或分子微观过程的活体、实时、动态检测，能够对植物吸收、释放及转运离子或分子的根际过程机制形成更深入的理解和统一认识。

随着分析化学微传感器技术的不断发展，目前可以搭载非损伤微测系统使用的微电极有玻璃电极、碳丝电极和金属电极等类型；可以检测的离子或分子主要有H⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cl^-、NH₄ ⁺、NO₃ ^-、Cd²⁺、 Pb²⁺、Cu²⁺及O₂、H₂O₂、CO₂、NO等^[6-16]；被测样品不仅仅局限于植物，也可以应用于细胞、动物等生命样品和金属材料、颗粒材料和膜材料等非生命样品。然而，目前已开发的可应用于非损伤微测系统的重金属离子选择性微电极种类并不多，仅有Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺三种。Zn作为一种植物生长的必需元素，其在高浓度时同样对植物产生明显的毒害作用^[17]。由于Zn²⁺选择性电极所使用的离子载体普遍存在灵敏性低、对其他离子选择性差、响应时间长的问题，无法用于非损伤微测系统Zn²⁺选择性微电极的开发及应用。因此，亟需开发、表征、优化一种新型Zn²⁺选择性电极来满足非损伤微测系统对离子流检测的要求，并成功搭载于该系统实现对活体植物进行Zn²⁺离子流的实时、动态监测。Zn²⁺离子选择微电极的研发将极大帮助研究人员深入认识植物体与Zn²⁺的交互作用过程与机制。

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发明内容

本发明的目的在于提供一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极及其制备方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极，包括锥形玻璃微电极管1，锥形玻璃微电极管1腔内填充有膜后灌充液2，锥形玻璃微电极管1通过Ag/AgCl丝导线3与非损伤微测系统连接，所述锥形玻璃微电极管1尖端部注有Zn²⁺液态离子交换剂LIX5。

所述Zn²⁺液态离子交换剂LIX为按质量百分比计，10％5,6-苯并

-4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六碳-5-烯、10 ％四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸钠和80％2-硝基苯基辛基醚。

所述膜后灌充液由10mM Zn(NO₃)₂和0.1mM KCl组成，pH调到7.0。

所述锥形玻璃微电极管1尖端开口直径为4～5μm。

一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的制备方法，由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成尖端直径为4～5μm的锥形玻璃微电极管，锥形玻璃微电极管内壁进行硅烷化使其变为疏水性，疏水处理后从玻璃微电极管后端注入膜后灌充液，尖端灌充Zn²⁺液态离子交换剂LIX(liquid ion exchanger)，Ag/AgCl导线安装于微电极管内，在管尾部用环氧树脂固定Ag/AgCl丝和密封玻璃管，即制得Zn²⁺选择性微电极。

所述将Ag/AgCl丝导线插入膜后灌充液中使其一端直至接近锥形玻璃微电极管的尖端，然后用环氧树脂在锥形玻璃微电极管的管口固定 Ag/AgCl丝和密封锥形玻璃微电极管，并使Ag/AgCl导线另一端一端露出锥形玻璃微电极管尾部，即制得Zn²⁺选择性微电极。

所述膜后灌充液的灌充长度为10～15mm；所述LIX的灌充长度为 100～120μm。

所述非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极，包括锥形玻璃微电极管1，锥形玻璃微电极管1腔内填充有膜后灌充液2，锥形玻璃微电极管1尖端部注有Zn²⁺液态离子交换剂LIX5，锥形玻璃微电极管1内安装有Ag/AgCl 丝导线3，锥形玻璃微电极管1的管口用环氧树脂4密封并固定Ag/AgCl 丝3。

所述将Ag/AgCl丝导线插入膜后灌充液中使其一端直至接近锥形玻璃微电极管的尖端，电极通过固定装置与非损伤微测系统连接，即制得 Zn²⁺选择性微电极。

其中Ag/AgCl导线的制备步骤如下：

取一根适当长的银丝，用砂纸打磨以除去其表面的氧化层；

取一根贵金属丝或碳棒接到电源的阴极上，将打磨过的银丝接到电源的阳极上，在1.5V的直流电压下，在饱和氯化钾溶液中电镀2s即可制成Ag/AgCl丝。

一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的应用，所述Zn²⁺选择性微电极适用于实时、动态、无损测定样品表面微观区域内Zn²⁺的浓度、流速及运动方向的信息。

在待测样品的固液界面上采用所述选择性微电极测定其表面微观区域内Zn²⁺的浓度、流速及运动方向的信息。

一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的检测方法，采用所述选择性微电极在待测样品固液界面的微观区域内，通过微电极尖端灌充的离子交换剂实现对Zn²⁺的选择性识别，测定微观区域内设定距离的两点之间的电位差，而后通过Fick第一扩散定律获得离子的移动速率，继而实现获取待测样品表面Zn²⁺的浓度、流速及运动方向的信息。

本发明所具有的优点：

本发明的微电极尖端直径在4～5μm之间，可以满足细胞、组织的离子流检测要求；该微电极在10^-4.3～10^-1M Zn²⁺浓度检测范围内具有很好的线性关系R²＝0.999，能斯特斜率为26.5mV/decade；微电极的响应时间t95％小于1s。由此本发明的Zn²⁺选择性微电极，可以实现对样品表面微观区域Zn²⁺浓度、流速及其运动方向等信息的实时、动态、无损检测，为生物和非生物材料表面Zn²⁺的微观过程和机制研究提供新的方法。

附图说明

图1为本发明实施例提供的Zn²⁺选择性微电极的结构示意图，其中， 1.微电极管；2.灌充液；3.Ag/AgCl导线；4.环氧树脂盖；5.Zn²⁺液态离子交换剂LIX；

图2为本发明实施例提供的Zn²⁺选择性微电极的测定线性响应范围图；

图3为本发明实施例提供的伴矿景天根际微区不同位置的Zn²⁺流速图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式参见图1，锌离子选择性微电极，包括一个玻璃微电极管1，在玻璃微电极管1的腔内填充有膜后灌充液2，玻璃微电极管1的尖端部注有Zn²⁺液态离子交换剂LIX5，玻璃微电极管1内安装有Ag/AgCl 导线3，在玻璃微电极管1的尾部用环氧树脂4固定Ag/AgCl丝3和密封玻璃微电极管1。

玻璃微电极管1为单层管，膜后灌充液由10mM Zn(NO₃)₂和0.1mM KCl组成，pH调到7。

该Zn²⁺选择性微电极，其尖端为4～5μm，线性响应范围为10^-1～10^-4.3 M，斜率为26.5mV/decade，检测下限为10^-4.3M。

实施例1

Zn²⁺选择性微电极由图1所示，包括玻璃微电极管1，在玻璃微电极管1的腔内填充有膜后灌充液2，玻璃微电极管1的尖端部注有Zn²⁺液态离子交换剂LIX 5，玻璃微电极管1内安装有Ag/AgCl导线4，在玻璃微电极管1的尾部用环氧树脂4固定Ag/AgCl丝3和密封玻璃微电极管1。玻璃微电极管1为单层管，膜后灌充液由10mM Zn(NO₃)₂和0.1mM KCl 组成，pH为7。Zn²⁺液态离子交换剂LIX按质量百分比计10％(w/w)的 5,6-苯并-4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六碳-5-烯、10 ％(w/w)的四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸钠和80％(w/w)的2-硝基苯基辛基醚而成。

Zn²⁺选择性微电极的制备方法，包括下列步骤：

1)拉制微电极管：按照常规的拉制方式，将硼硅酸盐玻璃毛细管 (外径1.5mm，内径1.05mm，长度5cm)固定在加热线圈的中间位置，加热使其自由落下，再将玻璃管的尖端朝上，固定在夹子上，再次加热使其尖端直径在4μm的范围内。在使用前，微电极管需通过显微镜检查其外形，特别是管口是否平整。管口不规整以及管口不是圆形的微电极管都不能使用。

2)硅烷化：在硅烷化过程中，首先在150℃下预干燥1h以上，除去微电极管内残存的水分和杂质；然后将微电极放置在带盖的玻璃器皿中，向玻璃器皿内倒入2mL 5％的二甲基二氯硅烷(国药集团化学试剂有限公司，北京)作为硅烷试剂，溶剂使用正己烷，在150℃下烘烤30 min，使其蒸气进入并附着在微电极的尖端。硅烷化处理过的微电极应保存在干燥、无尘的避光容器里。

3)注入灌充液：用接上细管的l.0mL注射器将组成为10mM Zn(NO₃)₂和0.1mM KCl，pH为7的灌充液从管后端缓慢推入经硅垸化的微电极管内，产生15.0mm灌充液柱。在显微镜下观察电极内是否有气泡，若存在气泡，须将电极尖端朝下放置一段时间，直至气泡完全从微电极管中消失。

4)灌充Zn²⁺液态离子交换剂LIX：在双目显微镜下，首先用尖端开口为50～60μm的玻璃毛细管蘸取少许Zn²⁺LIX，尖端充满即得到了盛装Zn²⁺LIX的玻璃毛细管即LIX载体。从尾部采用注射器给其一定压力，使LIX液面凸出。再在显微镜下将此LIX载体与上述待灌充的微电极管尖端放置于同一水平面相对，小心将待灌充微电极管尖端与LIX的凸液面相接触，LIX逐渐渗入到微电极管尖端。当LIX在微电极管尖端的长度达到100μm时灌充即完成。

Zn²⁺液态离子交换剂LIX按质量百分比计10％(w/w)的5,6-苯并 -4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六碳-5-烯、10％ (w/w)的四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸钠和80％(w/w)的2-硝基苯基辛基醚而成。

5)如图1所示，将Ag/AgCl导线3插入灌充液中直至接近微电极管1的尖端，然后用环氧树脂4在微电极管1的管口固定Ag/AgCl丝3 和密封玻璃微电极管1，并使Ag/AgCl导线3一端露出微电极管1尾部，即制得Zn²⁺选择性微电极。

Ag/AgCl导线3的制备步骤如下：

1)取一根适当长的银丝，用砂纸打磨以除去其表面的氧化层；

2)取一根贵金属丝或碳棒接到电源的阴极上，将打磨过的银丝接到电源的阳极上，在1.5V的直流电压下，在饱和氯化钾溶液中电镀2s即可制成Ag/AgCl丝。

Zn²⁺选择性微电极检测范围测试：

离子选择性微电极在一定检测范围内其电位与离子浓度的对数之间呈线性关系，这样能够根据测量得到的微电极电位计算出被测离子浓度。为检测Zn²⁺选择性微电极的检测范围，配制系列的Zn(NO₃)₂标准溶液，背景溶液为简化营养液(含0.1mM Ca(NO₃)₂,0.1mMMgSO₄,0.1mM KNO₃、1.0mM NaNO₃、0.3mM MES)作为测试液。该溶液是作物根系离子流测试中所使用的实际测试液，与作物的营养液成分一致，能够模拟离子选择性微电极的使用环境。溶液pH值为6.0，使用NaOH和HCl 调节，MES即吗啉乙磺酸作为pH缓冲液。从而得到不同Zn²⁺浓度对数与微电极电位之间的对应关系，用以评价电极性能。离子选择性微电极的性能测试过程在NMT系统(YG-MS-001，美国扬格公司)上完成。

利用上述获得微电极对Zn²⁺浓度分别为10^-6、10^-5、10^-4.3、10^-4、10^-3、10^-2和10^-1M的Zn(NO₃)₂标定液进行了电位测量。使用同一支微电极通过3次重复测量取其平均值，得到不同Zn²⁺浓度对数与微电极电位之间的对应关系如图2所示。图2中，Zn²⁺选择性微电极在Zn²⁺浓度为10^-4.3～ 10^-1M范围内的能斯特响应斜率为26.5mV/dec，微电极电位与Zn²⁺浓度对数间的线性相关系数R²＝0.999，说明在该范围内有很好的线性关系，从而能够通过测量微电极电位准确地得到其相应的离子浓度。因此该 Zn²⁺选择性微电极能够满足测量植物细胞、组织、器官微区内的Zn²⁺浓度及动态变化的需要。

Zn²⁺选择微电极能斯特响应测试：

微电极电位E与标定液Zn²⁺浓度C之间的关系可由能斯特方程 E＝k±slgC(式1)来描述。式中E为微电极与参比电极之间的电压，mV； C为标定溶液中Zn²⁺浓度，M；s为能斯特斜率，mV/decade；k为能斯特截距，mV。

其中能斯特斜率s理论值的计算公式为s＝2.303RT/nF(式2)，式中， R为气体常数，8.314J/(K·mol)；T为绝对温度，K；F为法拉第常数， 9.6487×10⁴C/mol；n为被测离子的化合价，对于二价Zn²⁺，n＝2。在25 ℃时，Zn²⁺的能斯特斜率s理论值为29.5mV/dec。

将微电极中的Ag/AgCl导线连接NMT系统(YG-MS-001，美国扬格公司)微电极前置放大器，参考电极与微电极放大器和数据采集系统的地端连接。标定液为Zn²⁺浓度分别为0.1,0.5和1mM的Zn(NO₃)₂溶液，将微电极和参考电极分别浸入到这三种标定液中，通过NMT采集软件读取并记录微电极的对地电位，即微电极与参考电极的电位差变化。将不同标定液中电极电位代入式(1)中可以得到电极的能斯特斜率。本研究在室温25℃下，使用Zn²⁺浓度分别为0.1、0.5和1mM的测试液作为标定液，测得微电极电位分别为154.23、163.25和181.14mV，代入式(1) 可得能斯特斜率为26.7mV/decade，与理论值29.5mV/decade相比，转换率达到91％，符合离子选择性微电极的转化率≥90％的工作要求。试验得到的能斯特斜率与s理论值越接近，说明其性能越好。

实施例2

Zn²⁺选择性微电极的制备方法，包括下列步骤：

1)拉制微电极管：按照常规的拉制方式，将硼硅酸盐玻璃毛细管 (外径1.5mm,内径1.05mm,长度5cm)固定在加热线圈的中间位置，加热使其自由落下，再将玻璃管的尖端朝上，固定在夹子上，再次加热使其尖端直径在5μm的范围内。在使用前，微电极管需通过显微镜检查其外形，特别是管口是否平整。管口不规整以及管口不是圆形的微电极管都不能使用。

2)硅烷化：在硅烷化过程中，首先在150℃下预干燥1h以上，除去微电极管内残存的水分和杂质；然后将微电极放置在带盖的玻璃器皿中，向玻璃器皿内倒入2mL 5％的二甲基二氯硅烷(国药集团化学试剂有限公司，北京)作为硅烷试剂，溶剂使用正己烷，在150℃下烘烤30 min，使其蒸气进入并附着在微电极的尖端。硅烷化处理过的微电极应保存在干燥、无尘的避光容器里。

3)注入灌充液：用接上细管的l.0mL注射器将由10mM Zn(NO₃)₂和0.1mM KCl组成，pH为7的灌充液从管后端缓慢推入经硅垸化的微电极管内，产生15mm灌充液柱。在显微镜下观察电极内是否有气泡，若存在气泡，须将电极尖端朝下放置一段时间，直至气泡完全从微电极管中消失。

4)灌充Zn²⁺液态离子交换剂LIX：在双目显微镜下，首先用尖端开口为50～60μm的玻璃毛细管蘸取少许Zn²⁺LIX，尖端充满即得到了盛装Zn²⁺LIX的玻璃毛细管即LIX载体。从尾部采用注射器给其一定压力，使LIX液面凸出。再在显微镜下将此LIX载体与上述待灌充的微电极管尖端放置于同一水平面相对，小心将待灌充微电极管尖端与LIX的凸液面相接触，LIX逐渐渗入到微电极管尖端。当LIX在微电极管尖端的长度达到100μm时灌充即完成。

Zn²⁺液态离子交换剂LIX按质量百分比计10％(w/w)的5,6-苯并 -4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六碳-5-烯、10％ (w/w)的四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸钠和80％(w/w)的2-硝基苯基辛基醚而成。

5)如图1所示，将Ag/AgCl导线3插入灌充液中直至接近微电极管1的尖端，然后用环氧树脂4在微电极管1的管口固定Ag/AgCl丝3 和密封玻璃微电极管1，并使Ag/AgCl导线3一端露出微电极管1尾部，即制得Zn²⁺选择性微电极。

利用上述获得的电极测定了伴矿景天(Sedum plumbizincicola)根表 Zn²⁺离子流速。伴矿景天幼苗浸泡在0.1mM Zn(NO₃)₂溶液中静置20min 后,根摄入Zn²⁺趋于平衡。按上述方法利用标定好的Zn²⁺离子选择性微电极进行伴矿景天根尖(距离根尖0～1300μm)不同部位Zn²⁺离子流速的测定。如图3所示，负值表示Zn²⁺由溶液向根流入，正值表示Zn²⁺由根向溶液流出。从图3可以看出距根尖0.1、0.2mm处Zn²⁺内流速度最高，同时距根尖0、0.5mm处的Zn²⁺内流微弱，但在距根尖0.5mm位置后 Zn²⁺呈外排趋势，并趋向于稳定。

Claims (8)

1.一种应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极，包括锥形玻璃微电极管(1)，锥形玻璃微电极管(1)腔内填充有膜后灌充液(2)，锥形玻璃微电极管(1)通过Ag/AgCl丝导线(3)与非损伤微测系统连接，其特征在于：所述锥形玻璃微电极管(1)尖端部注有Zn²⁺液态离子交换剂LIX(5)；

膜后灌充液由10mM Zn(NO₃)₂和0.1mM KCl组成，pH调到7.0；

所述Zn²⁺液态离子交换剂LIX为按质量百分比计，10％5,6-苯并-4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六碳-5-烯、10％四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸钠和80％2-硝基苯基辛基醚。

2.按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极，其特征在于：所述锥形玻璃微电极管(1)尖端开口直径为4～5μm。

3.一种按权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的制备方法，其特征在于：由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成尖端直径为4～5μm的锥形玻璃微电极管，锥形玻璃微电极管内壁进行硅烷化使其变为疏水性，疏水处理后从玻璃微电极管后端注入膜后灌充液，尖端灌充Zn²⁺液态离子交换剂LIX(liquid ion exchanger)，Ag/AgCl导线安装于微电极管内，在管尾部用环氧树脂固定Ag/AgCl丝和密封玻璃管，即制得Zn²⁺选择性微电极。

4.按权利要求3所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的制备方法，其特征在于：将Ag/AgCl丝导线插入膜后灌充液中使其一端直至接近锥形玻璃微电极管的尖端，然后用环氧树脂在锥形玻璃微电极管的管口固定Ag/AgCl丝和密封锥形玻璃微电极管，并使Ag/AgCl导线另一端露出锥形玻璃微电极管尾部，即制得Zn²⁺选择性微电极。

5.按权利要求3或4所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的制备方法，其特征在于：所述膜后灌充液的灌充长度为10～15mm；所述LIX的灌充长度为100～120μm。

6.一种权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的应用，其特征在于：所述Zn²⁺选择性微电极适用于实时、动态、无损测定样品表面微观区域内Zn²⁺的浓度、流速及运动方向的信息。

7.按权利要求6所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的应用，其特征在于：在待测样品的固液界面上采用所述选择性微电极测定其表面微观区域内Zn²⁺的浓度、流速及运动方向的信息。

8.一种权利要求1所述的应用于非损伤微测系统的Zn²⁺选择性微电极的检测方法，其特征在于：采用所述选择性微电极在待测样品固液界面的微观区域内，通过微电极尖端灌充的离子交换剂实现对Zn²⁺的选择性识别，测定微观区域内设定距离的两点之间的电位差，而后通过Fick第一扩散定律获得离子的移动速率，继而实现获取待测样品表面Zn²⁺的浓度、流速及运动方向的信息。

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