CN109187703B - 一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于离子选择性微电极技术领域，具体涉及一种基于非损伤微测技术（NMT）的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法，通过向微电极玻璃管内灌入长约1cm的连续无气泡灌充液，灌充液由1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾溶液组成；再在显微镜下从尖端吸入一段长约40‑50µm的权利要求1所述的铜离子交换剂，并确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡。采用此配方制作的微电极成功地用于了测定植物根尖表面的铜离子流速。本发明建立了一种可用于NMT技术的Cu²⁺交换剂配方，在此基础上此制作的离子选择性玻璃微电极具有稳定的斜率和较高的选择性系数，可用于NMT技术测定活体样品表面的铜离子流速。

Description

一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根 尖铜离子流速测定方法

技术领域

本发明属于离子选择性微电极技术领域，具体涉及一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法。

背景技术

非损伤微测技术(NMT)是一种新近发展起来的离子选择性微电极技术，可在不损伤活体样品的情况下获得进出样品的各种离子或分子浓度、流速及方向的信息。目前,NMT可以测量H⁺、Ca²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Na⁺、Cd²⁺、NO₃ ^-、Cl^-、O₂等多种离子和分子，但由于缺乏可靠的Cu²⁺离子交换剂，NMT技术尚无法用于测量活体样品表面的Cu²⁺流速。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明旨在提供一种考察了铜离子选择性液膜微电极的特征(斜率、选择性系数、pH范围)，测定植物根尖铜离子流速，并初步建立了测定植物根表铜离子流速的NMT技术的基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于非损伤微测技术的铜离子交换剂，其特征在于，由1.0％铜(II)离子载体、1.0％四[3,5-二(三氟甲基)苯基]硼酸钠、98.0％2-硝基苯辛醚组成。

一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的制备方法，向一支微电极玻璃毛细管内灌入一段长约1cm的连续灌充液液柱，灌充液由1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾溶液组成；再在显微镜下从尖端吸入一段长约40-50μm的所述的铜离子交换剂，并确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡；在微电极内的灌充液中插入银丝，并连接微电极夹持器，从而制成适用于NMT系统的铜离子选择性玻璃微电极。

铜离子选择性微电极的校准步骤如下：将上述制作好的铜离子选择性微电极与前置放大器相连接，调节微操纵仪将微电极尖端浸入校正液中，同时将Ag/AgCl参比电极尖端也浸入校正液中；借助于摄像头和视频采集软件观察微电极，确保尖端无离子交换剂的泄漏之后开始测定；将参比电极、微电极依次浸入校正液中，开启NMT系统测定并记录电位值；校正液为硝酸铜，初始浓度为10000μM、5000μM，将其分别逐级稀释10倍，分别测定它们的电位值，直至测定值不随校正液中铜浓度的变化而变化；根据校正液中铜离子的活度和测得的电位值，应用能斯特方程即可计算出微电极的斜率；以上为探究理想状态下微电极特征时所采用的方法，在将微电极技术应用于植物活体样品测定时需要采用维持生物活性的缓冲液，因而校正液的组成应作调整；调整后的校正液除分别含有1000μM，100μM，10μM，1μM铜离子外，还含有0.1mM氯化钙，0.1mM氯化钾，0.3mM MES，pH6.0。

选择性系数的测定步骤如下：

采用等活度法测定选择性系数；根据浓度活度换算表，以下溶液与10000μM硝酸铜溶液活度相等，都为5955μM：10000μM硝酸钙，10000μM硝酸锌，9580μM硝酸镁，10250μM硝酸铬，10400μM硝酸铅，6330μM硝酸钠，6340μM硝酸钾，6340μM硝酸铵；在非损伤微测系统中，采用上述方法制备的铜离子选择性微电极分别测定它们的电位值，并应用以下公式计算选择性系数：

其中，A为主离子，B为干扰离子；在本试验中，A为铜离子，B为钙离子、锌离子、镁离子、铬离子、铅离子、钠离子、钾离子、铵离子；z_A和z_B分别为A和B的电荷数；a_A为主离子A的活度(干扰离子B的活度a_B＝a_A)；E_A和E_B为等活度的A溶液和B溶液的电位测定值；

表示选择性系数，即A离子选择性电极对干扰离子B的电位选择性系数；R为气体常数，F为法拉第常数，T为绝对温度。

判断介质pH对流速测定的影响的实验步骤为：配制50μM硝酸铜，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液分别调pH至4.0,5.0,6.0,7.0,8.0，在非损伤微测系统中，采用本试验制备的铜离子选择性微电极，分别测定电位值。

本发明还提供采用上述的制备方法得到的铜离子选择性微电极及其特征参数。

采用前述铜离子选择性微电极对植物根尖铜离子流速进行测定的方法，包括如下步骤：在实验室采用水培方式培育白羽扇豆、吊兰，选择生长旺盛、根系健康的植株用于测定；将铜离子选择性微电极固定于夹持器上，采用前述方法校正并获得斜率；在塑料培养皿中加入测试液，用滤纸片和树脂块固定白羽扇豆根部，露出根尖；将铜离子选择性微电极和Ag/AgCl参比电极尖端浸入测试液中，调节微操纵仪，使微电极尖端靠近根表；设置NMT测试参数，由数据收集系统开始记录测得的电位值；采用NMT系统的数据转换软件，将测定值转换为离子流速信息；

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明建立了一种可用于NMT技术的Cu²⁺交换剂配方，以此制作的离子选择性玻璃微电极具有稳定的斜率和较高的选择性系数，可用于NMT技术测定活体样品表面的铜离子流速，扩大了NMT技术的应用范围。

附图说明

图1铜离子选择性微电极对铜离子活度的响应曲线；

图2铜离子选择性微电极的校准曲线；

图3测试液背景下铜离子选择性微电极的校准曲线；

图4介质pH对铜离子微电极测定值的影响；

图5吊兰根尖的铜离子流速(负值表示内流)；

图6白羽扇豆种子根根尖的铜离子流速(负值表示内流)。

具体实施方式

以下通过具体实例对本发明作进一步详细说明。

植物的铜营养生理

铜元素是植物生长发育所必须的微量元素，大多数植物的含铜量在5-25mg/kg(干重)，多集中于幼嫩叶片、种子胚等生长活跃的组织中，而茎杆和成熟的叶片中较少。植物含铜量常因植物种类、植株部位、成熟状况、土壤条件等因素而有变化，且不同种类作物体内的含量差异很大。

植物吸铜受代谢作用的控制，根系中的铜含量往往比地上部高，尤其是根尖。植物地上部是种子和生长旺盛部位含铜量较高。铜的移动取决于体内铜的营养水平。供铜充足时，铜较易移动；而供应不足时。铜则不易移动。

在污染环境条件下过量的铜又成为危害植物生长的常见重金属元素。对于一般作物来讲，含铜量＞20mg/kg干重时，作物就可能中毒。铜中毒的症状时新叶失绿，老叶坏死，叶柄和叶的背面出现紫红色。植物对铜的忍耐能力有限，铜过量很容易引起毒害。铜对植物的毒害首先表现在根部，因为植物体内过多的铜主要集中在根部，具体表现为主根的伸长受阻，侧根变短。许多研究者认为，过多铜对质膜结构有损害，从而导致根内大量物质外溢。

非损伤微测技术

非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique，NMT)是一种选择性离子/分子微电极技术。非损伤微测技术是一大类微电极技术的统称，包括：离子选择性电极技术(SIET)、扫描极谱电极技术(SPET)、自参比离子选择性电极技术(SERIS)、自参比极谱电极技术(SERP)、自参比酶辅助电极技术(SERE)、扫描参比微电极技术(SRET)、微电极离子流技术(MIFE)、扫描振动电极技术(SVET)。

自从1974年美国海洋生物学实验室(Marine Biological Laboratory)的神经科学家Lionel F.Jaffe提出非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)原初概念,到1990年成功应用于测定细胞Ca²⁺运动方向和流速,该技术已经解决了众多科学问题。NMT是实时选择性测定进出活体材料离子和小分子流速的技术,是生理功能研究的工具之一。该技术由电脑自动控制离子和分子选择性微电极,在不接触活体样品的情况下,获得进出样品的各种离子和分子浓度、流速及其三维运动方向的信息,能够按照研究人员的设定,以手动或编程的方式,从任意角度(相对于样品表面)对样品进行测量。NMT技术具有以下特点:(1)非损伤活体测量；(2)可长时间进行三维动态和实时测量；(3)多个微电极同时测量；(4)具有高分辨率和高灵敏度；(5)强大的智能化数据采集、分析及管理软件。NMT的原理是通过微电极和微传感器获取离子和分子的信号,基于Nernst方程和Fick’s第一扩散定律计算离子和分子的浓度和流速,能够获得非常细微的信号,流速能够达到10^-12mol·cm^-2·s^-1。目前,NMT可以测量H⁺、Ca²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Na⁺、Cd²⁺、NO₃ ^-、Cl^-以及O₂、CO₂、NO、氨基酸等多种离子和分子,为获得生物样品离子和分子信息提供了良好的实验平台。被测样品可以是单细胞、细胞层、组织、器官甚至整个生物体,从而获得其他技术难以检测的生理特征和生命活动规律,在理论研究和应用领域方面产生了前所未有的重大突破。随着NMT的快速发展,该技术在诸多领域得到广泛应用,取得了大量的科研成果,在诸多学科领域得到应用,如植物学、动物学、微生物学、医学、环境科学、材料科学等。

非损伤微测系统是通过计算机和精密运动控制系统的自动控制，基于非损伤微电极技术，在不接触被测样品的情况下进行三维、实时、动态地测量，获取进出样品的各种分子/离子浓度、流速及其运动方向信息的设备。

非损伤微测系统是通过物理学中的离子/分子扩散定律的数学公式，即Fick’s第一扩散定律，计算获得离子/分子的浓度和流速以及运动方向。离子选择性电极由玻璃微电极、Ag/AgCl导线、电解质以及液态离子交换剂(LIX)四部分组成。该电极在待测离子浓度梯度dc中以已知距离dx进行两点测量，可以得到两点的V1、V2的电压/浓度矫正曲线。D是离子/分子特异的扩散常数，将它们代入Fick的第一扩散定律公式：J₀＝-Ddc/dx，可获得该离子的流动速率，即每一秒钟通过一个平方厘米的该离子/分子的皮摩尔数。

非损伤微测系统获取的是离子/分子的电压值和电流值，当采用离子/分子选择性电极对被测材料进行检测时，检测信号输入到前置放大器中，再经由信号处理器到达数据采集系统，通过非损伤微测系统数据分析软件(iFluxes)进行数据记录、显示和处理，且可多通道显示和分析所记录的数据；同时，在测量过程中iFluxes软件通过数据采集系统与显微成像装置连接，从而实现测试过程中对被测材料以及离子/分子选择性电极进行实时图像捕捉和监控；另外，在测量过程中iFluxes软件与运动控制器连接，运动控制器与位移传递架上的驱动器连接，通过驱动器实现对离子/分子选择性电极的三维运动控制。

铜是植物生长必需的微量元素，在污染环境条件下过量的铜又会成为危害植物生长的常见重金属元素。在研究植物对铜的吸收时，尚缺乏能够进行准确且实时测定的分析技术。非损伤微测技术是一种新近发展起来的离子选择性微电极技术，可在不损伤活体样品的情况下获得进出样品的各种离子或分子浓度、流速及方向的信息。本申请提供了一种新的铜离子选择性液膜配方，并在此基础上制作了适用于NMT技术的铜离子选择性玻璃微电极，进而考察了该微电极的斜率、检测限、选择性系数、pH范围等特征参数，并应用于NMT系统测定了植物根尖的铜离子流速，从而建立了测定植物根表铜离子流速的NMT技术体系。

一、材料与方法

1.1铜离子选择性微电极的制作

在微电极玻璃毛细管(开口直径4-5μm，北京旭月公司)内灌入一段长约1cm的连续无气泡灌充液液柱，再在显微镜下从尖端吸入一段长约40-50μm长的铜离子交换剂，确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡，再在玻璃管内的灌充液中插入银丝，并连接微电极夹持器，从而制成适用于NMT系统的铜离子选择性玻璃微电极。

铜离子交换剂的组成为：1.0％铜(II)离子载体、1.0％四[3,5-二(三氟甲基)苯基]硼酸钠和98.0％2-硝基苯辛醚。灌充液的组成为：1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾。

1.2铜离子选择性微电极的校准

将上述制作好的铜离子微电极与NMT系统中的前置放大器相连接，并调节微操纵仪将微电极尖端浸入校正液中，同时将Ag/AgCl参比电极尖端也浸入校正液中。借助于NMT系统中显微摄像和视频采集软件观察微电极尖端，确保无铜离子交换剂的泄漏之后，开始测定。测定时，将参比电极，微电极依次浸入一系列的校正液中。

校正液为硝酸铜，初始浓度设为10000μM和5000μM，分别测定电位值。再将校准溶液母液分别稀释10倍，即1000μM及500μM硝酸铜溶液，将其分别逐级稀释10倍，再分别测定它们的电位值，直至测定值不随校正液中铜浓度的变化而变化。根据校正液中铜离子的活度和测得的电位值，应用能斯特方程即可计算出微电极的斜率。

以上为探究理想状态下微电极特征时所采用的方法，在将微电极技术应用于植物活体样品测定时需要采用维持生物活性的缓冲液，因而校正液的组成应作调整。调整后的校正液除分别含有1000μM，100μM，10μM，1μM铜离子外，还含有0.1mM氯化钙，0.1mM氯化钾，0.3mM MES，并调节pH至6.0。

1.3选择性系数的测定

采用分别溶液法(等活度法)来测定选择性系数。根据浓度活度换算表，以下溶液与10000μM硝酸铜溶液活度相等，都为5955μM：10000μM硝酸钙，10000μM硝酸锌，9580μM硝酸镁，10250μM硝酸铬，10400μM硝酸铅，6330μM硝酸钠，6340μM硝酸钾，6340μM硝酸铵。采用前述方法制备的铜离子选择性微电极，在非损伤微测系统中分别测定它们的电位值，并应用以下公式计算选择性系数：

其中，A为主离子，B为干扰离子；在本试验中，A为铜离子，B为钙离子、锌离子、镁离子、铬离子、铅离子、钠离子、钾离子、铵离子；z_A和z_B分别为A和B的电荷数；a_A为主离子A的活度(干扰离子B的活度a_B＝a_A)；E_A和E_B为等活度的A溶液和B溶液的电位测定值；

表示选择性系数，即A离子选择性电极对干扰离子B的电位选择性系数；R为气体常数，F为法拉第常数，T为绝对温度。

1.4介质pH对NMT(非损伤微测技术)测定的影响

配制50μM硝酸铜，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液分别调pH至4.0,5.0,6.0,7.0,8.0，在非损伤微测系统中，采用制备的铜离子选择性微电极分别测定电位。

1.5植物根尖铜离子流速的NMT测定

在实验室采用水培方法培育白羽扇豆、吊兰，选择生长旺盛、根系健康的植株用于测定；将铜离子选择性微电极固定于夹持器上，采用前述方法校正并获得斜率；在塑料培养皿中加入测试液，用滤纸片和树脂块固定白羽扇豆根部，露出根尖；将铜离子选择性微电极和Ag/AgCl参比电极尖端浸入测试液中，调节微操纵仪，使微电极尖端靠近根表；设置NMT测试参数，由数据收集系统开始记录测得的电位值；采用NMT系统的数据转换软件，将测定值转换为离子流速信息。

二、结果与分析

2.1铜离子选择性微电极的校准曲线

图1示出了铜离子选择性微电极对铜离子活度的响应，其中每个数据点为四根不同微电极测定结果的平均值；微电极对铜离子在较宽的活度(浓度)范围内都有响应，测定值随介质铜离子活度的增加而增加。

图2示出了铜离子选择性微电极的校准曲线，在铜离子浓度为0.50-10000μM(活度0.50～5955μM)范围内，铜离子选择性微电极的测定值与铜离子活度的对数成线性关系(图2)，相关性系数为0.9844±0.0044。校准曲线的斜率为31.28±0.49，接近于Nernst方程的理论值(28.5)。铜离子选择性微电极的检测限为0.52±0.08μM，当铜离子活度低于此值时，铜离子选择性微电极的测定值与铜离子活度的对数不再呈线性关系。

在应用微电极测定植物根系对离子的响应时，通常采用含有一定量钙离子和钾离子的缓冲溶液作为测试液，因此，本试验中还考察了在测试液背景下铜离子选择性微电极的响应情况(图3)。测试液的组成为：0.1mM CaCl₂、0.1mM KCl、0.3mM MES，pH6.0。在测试液条件下，铜离子选择性微电极的斜率为30.0，略低于硝酸铜单一溶液时的斜率(图2)，但仍接近于Nernst方程的理论值(28.5)，在测试液条件下，相关性系数为0.9998±0.0001。从斜率和相关性来看，在测试液条件下微电极对铜离子活度有着良好的线性响应。

2.2选择性系数

表1列出了铜离子选择性微电极对8个离子的选择性系数的对数。这8个离子包括水培植物所用营养液中部分二价离子(Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)和一价离子(K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺)，还包括2个重金属离子(Cd²⁺、Pb²⁺)。lgK大于等于0，表示微电极不能区别铜离子和干扰离子，lgK小于0，表示微电极对铜离子的选择性要高于干扰离子。由表1可见，本试验中所用的微电极对铜离子的选择性比对其它阳离子要高。

表1铜离子选择性微电极对干扰离子的选择性

2.3介质pH对微电极测定值的影响

由图4可以看出，介质pH低于6时，铜离子选择性微电极的测定值高，而介质pH高于6时，测定值较低。这可能是由于介质pH高时，溶液中有部分铜离子生成了氢氧化铜沉淀。在采用铜离子选择性微电极测定溶液铜离子浓度(活度)时需要考虑介质的pH，在NMT中要考虑测试液、处理液的pH。

2.4植物根尖铜离子流速的NMT测定

图5和图6分别为百羽扇豆和吊兰距根尖不同部位处的根表铜离子流速。吊兰根尖从静止中心向上，铜离子内流速度逐渐增大，在距离静止中心200μm处达最大，之后逐渐降低(图5)。白羽扇豆根尖的铜离子内流速度最大值出现在距离静止中心250μm处，之后也呈逐渐降低的趋势(图6)。

三、讨论和小结

3.1讨论

NMT技术目前主要用于研究H⁺、Ca²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Na⁺、Cd²⁺、NO₃ ^-、Cl^-以及O₂、CO₂、NO、氨基酸等多种离子和分子进出表面的流速，基于铜离子选择性微电极的NMT技术尚未见报道。本试验中的所采用的微电极对较宽的铜浓度范围表现出了良好的响应(图1～3)，其斜率接近Nernst方程的理论值，检测限低于1μM，且选择性高(表1)、响应时间短，因此该微电极技术可为研究植物根系的铜吸收提供实时、准确的活体分析信息(图5和图6)。

从吊兰和百羽扇豆根尖的铜离子流速来看，两种植物的根尖部位对铜离子均有一定的吸收。在距静止中心200-250μm处，根对铜离子的吸收速率较高，而随后则降低(图5和图6)。这一现象可能与根系的显微结构有关，今后可继续进行探究。

3.2小结

本试验得到了如下结论：

(1)在铜离子浓度为0.50～10000μM(活度0.50～5955μM)范围内，铜离子选择性微电极的校准曲线的斜率为31.28±0.49，相关性系数为0.9844±0.0044，检测限为0.52±0.08μM。

(2)在测试液条件下，铜离子选择性微电极的斜率为30.00，相关性系数为0.9998±0.0001。可见，在测试液条件下微电极对铜离子活度有着良好的线性响应。

(3)本试验中所用的微电极对铜离子的选择性比对其它阳离子要高。

(4)介质pH影响铜离子选择性微电极的测定值。在采用铜离子选择性微电极的NMT中，要考虑测试液、处理液的pH。

(5)采用铜离子选择性微电极的NMT技术可以直观地考察铜离子进出植物根系的流速情况。

以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的测定方法，其特征在于，

所述铜离子选择性微电极的制备方法如下：

向一支玻璃微电极管灌入一段长约1cm的连续无气泡灌充液液柱，连续无气泡灌充液液柱由1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾溶液组成，再在显微镜下从尖端吸入一段40-50µm的铜离子交换剂，并确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡；在微电极的灌充液中插入银丝，并连接微电极夹持器，则铜离子选择性微电极制作完成；

所述铜离子交换剂由1.0%二价铜离子载体N,N,N′,N′-四环己基-2,2′-硫代二乙酰胺、1.0%四[3,5-二(三氟甲基)苯基]硼酸钠和98.0% 2-硝基苯辛醚组成；

将所述铜离子选择性微电极与前置放大器相连接，调节微操纵仪将微电极尖端浸入校正液中，同时将Ag/AgCl参比电极尖端也浸入校正液中；打开摄像头和视频采集软件观察微电极尖端，确保无泄漏后开始校正；将参比电极、铜离子选择性微电极依次浸入校正液中测定电位值，并求得微电极的特征参数；校正液为硝酸铜，初始浓度设置为10000µM、5000µM，将其分别进行逐级稀释，分别测定电位值，直至测定值趋于不变；根据校正液中铜离子的活度和测得的电位值，应用能斯特方程即可计算出微电极的斜率；以上为探究理想状态下微电极特征时所采用的方法，在将微电极技术应用于植物活体样品测定时需要采用维持生物活性的缓冲液，因而校正液的组成应作调整；调整后的校正液除分别含有1000µM，100µM，10µM，1µM铜离子外，还含有0.1mM氯化钙，0.1mM氯化钾，0.3mM MES，pH6.0；

选择性系数的测定步骤如下：

采用等活度法测定选择性系数：根据浓度活度换算表，以下溶液与10000 µM硝酸铜溶液的活度相等，都为5955µM：10000 µM硝酸钙，10000 µM硝酸锌，9580 µM硝酸镁，10250 µM硝酸铬，10400 µM硝酸铅，6330 µM硝酸钠，6340 µM硝酸钾，6340 µM硝酸铵；在非损伤微测系统中，采用所述铜离子选择性微电极分别测定这些溶液电位值，并应用以下公式计算选择性系数：

其中，A为主离子：铜离子，B为干扰离子：钙离子、锌离子、镁离子、铬离子、铅离子、钠离子、钾离子、铵离子；z _A 和 z _B分别为A和B的电荷数；a _A为主离子A的活度,干扰离子B的活度a _B＝a _A； E _A和E _B为等活度的A溶液和B溶液的电位测定值；

表示选择性系数，即A离子选择性电极对干扰离子B的电位选择性系数；R为气体常数，F为法拉第常数，T为绝对温度。

2.根据权利要求1所述的基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的测定方法，其特征在于，判断介质pH对流速测定的影响的实验步骤为：配制50 µM硝酸铜，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液分别调pH至4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0，在非损伤微测系统中，采用所述铜离子选择性微电极分别测定电位。

3.根据权利要求1或2所述的基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

在实验室采用水培方法培育白羽扇豆、吊兰，选择生长旺盛、根系健康的植株用于测定；将铜离子选择性微电极固定于夹持器上，采用权利要求1中的校准方法校准并获得斜率；在塑料培养皿中加入测试液，用滤纸片和树脂块固定白羽扇豆根部，露出根尖；将铜离子选择性微电极和Ag-AgCl参比电极尖端浸入测试液中，调节微操纵仪，使微电极尖端靠近根表；设置NMT测试参数，由数据收集系统开始记录测得的电位值；采用NMT系统的数据转换软件，将测定值转换为离子流速信息。

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