CN105815003A - 一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法 - Google Patents

一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，属于种子活力检测技术领域。该方法是利用微观动态分子流检测技术对种子做动态H2O2流检测，根据种子的H2O2流速来评价种子活力。该检测方法简单、方便、快速、准确性高，检测一粒种子仅需8～12min，消耗时间短，评价方法简单可靠；为种子的生产、储藏、加工和新品种选育提供了一种无损、快速、活体的种子活力检测新方法。

Description

一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法
技术领域
本发明属于种子活力检测技术领域，具体涉及一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法。
背景技术
种子在贮藏过程都会发生老化，导致种子发芽率降低，给农业生产带来巨大损失。种子活力决定种子迅速整齐出苗以及幼苗正常生长的潜力，测量种子活力，能够正确评价种子在田间的出苗情况，科学指导农业生产，减少因种子活力差带来的生产损失。因此，农业生产前必须对种子活力进行检测，保证采用高种子活力的种子进行播种。
检测种子活力常用的方法有籽粒萌发实验、生理测定法、加速老化法、电导率测定法、生化测定法，这些方法存在周期较长或用量大等缺点，有的方法还对种子构成了严重的伤害，甚至是在检测时破坏了种子结构，使其完全失去发芽能力，因此，这些种子活力测定方法对于一些珍贵的数量少的种子来说损失相当大，而且无法实现种子活力的动态监测。因此，寻求一种无损的、快速的、检测后的材料还能继续生长的种子活力检测方法成为目前亟待解决的问题。
微观动态分子流或离子流技术是一种新型的检测种子活力的方法，是一种在不破坏被测试材料的前提下获得测试材料膜内外分子或离子流动信息的一项新技术。该项技术可以对测试材料不同部位以及同一部位连续时间测定，已经在植物抗盐研究、植物病理研究、植物耐重金属等多种植物研究领域得到应用，但在植物种子活力的检测应用方面却较少见。公告号CN102511220B的发明专利公开了一种基于微观动态离子流检测技术测定小麦活力的方法，它是利用微观动态离子流检测技术对连续发芽期的小麦种子做动态K+流检测，根据小麦种子的净K+流速及方向来测定种子活力。该种方法的检测对小麦种子无损、快速，但是采用K+流速及方向来反应种子的活力不直接、容易产生偏差，检测得到的数据不能准确地代表种子的老化程度。因此，需要检测一种能直接、准确地反映种子老化程度的物质，来评价种子的活力程度。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，该方法检测的准确性高、代表性强、简单、方便、快速、不伤害种子。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，利用微观动态分子流检测技术对种子做动态H2O2流检测，根据种子的H2O2流速来评价种子活力。
所述H2O2流的检测采用非损伤微测系统NMT100-SIM-YG，系统软件imFlux。
所述基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，包括以下步骤：
(1)将去壳后的种子在测试液中浸泡，再用校正后的微电极对待测种子进行检测；
(2)对检测结果进行处理和分析。
步骤(1)中，所述测试液的配方为100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH值为6.0。
步骤(1)中，校正时校正液的配方为0.01mM～1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH值为6.0。所述校正液为校正液1、校正液2和校正液3，校正液1的配方为：0.01mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH值为6.0；校正液2的配方为：0.1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH值为6.0；校正液3的配方为：1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH值为6.0；现配现用。
步骤(1)中，浸泡的时间为3h。
步骤(1)中，所述微电极为尖端直径为2～4μm的玻璃电极，所述微电极的型号为XY-DJ-502，厂家为：旭月(北京)科技有限公司。
步骤(1)中，检测的部位为种子外表面靠近胚轴处。
步骤(1)中，所述检测为振动检测，检测时微电极的运动方向垂直于种子表面，每次电极移动距离为30μm，检测的间隔时间为8～10s。
步骤(1)中，检测的时间为8～12min。
对检测结果进行处理时，将种子检测后得到电势的差值ΔI(fA)通过非损伤微测系统NMT100-SIM-YG自带系统软件imFlux进行计算后，再利用公式J0＝-D×(dc/dx)计算得到H2O2分子流速；所述J0是H2O2分子流速，单位是pmol·cm-2·s-1；dc为H2O2分子的浓度梯度；dx为电极移动距离；D是H2O2分子在测试液中的扩散常数。利用EXCEL2007进行常规数据分析和作图。
所述评价种子活力的标准由以下步骤得到：测定种子的发芽率以及该发芽率对应的种子的H2O2流速，以发芽率为y值，H2O2流速为x值，拟合得到发芽率与H2O2流速的线性曲线；计算发芽率85％时的H2O2流速A，当实测种子的H2O2流速≤A时，评价为高活力种子；同时计算发芽率50％时的H2O2流速B，当实测种子的H2O2流速≥B时，评价为低活力种子；当实测种子的H2O2流速在A～B之间，评价为中活力种子。
所述种子为水稻种子，当实测种子的H2O2流速≤0.33pmol·cm-2·s-1时，评价为高活力种子；当实测H2O2流速≥0.74pmol·cm-2·s-1时，评价为低活力种子；当实测种子的H2O2流速在0.33～0.74pmol·cm-2·s-1之间时，评价种子为中活力种子。
H2O2是一种氧化剂，植物体内H2O2的含量高低与种子的老化程度存在必然的关系，低浓度的H2O2作为一种信号分子，能抵御各种非生物胁迫，高浓度的H2O2则诱导细胞死亡。种子老化时，种子内的H2O2含量上升，H2O2会出现外流。老化程度加重，与抗氧化有关的酶活力急剧下降，H2O2大量积累，细胞膜受损，细胞程序性死亡，H2O2大量外流。因此，对H2O2的流速的检测能作为评价种子活力简单、直观、准确的指标。
本发明的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，是利用微观动态分子流检测技术对种子做动态H2O2流检测，根据种子的H2O2流速来评价种子活力。通过该方法能对种子活力进行的无损、活体、快速检测，耗时短，检测一粒种子仅需8～12min，准确性高、种子用量少。活力越弱的种子，细胞程序性死亡越明显，细胞膜功能受损越严重，呈现出H2O2大量快速流失状态；活力越强的种子，则H2O2流失速度慢或者内流。本发明的评价种子活力的方法简单可靠，为种子生产、储藏、加工和新品种选育提供了一种无损、快速的种子活力检测新方法。
附图说明
图1为检测种子H2O2流时微电极的位置；
图2为老化处理不同时间的粳稻品种日本晴种子H2O2流的动态变化；
图3为老化处理不同时间的籼稻品种金农丝苗种子H2O2流的动态变化。
实验例1
水稻种子的活力评价实验
1、实验材料及处理：水稻种子选取粳稻品种日本晴和籼稻品种金农丝苗，每个品种选取930粒，晒种2d，每个品种平均分3组，每组310粒；将种子分散均匀，置于老化网上，进行人工高温高湿(45℃±1℃，RH＝100％)老化处理，第1-3组处理时间分别为0d、7d和10d。老化处理完成后，室温风干至含水量与处理前一致。
2、每组取300粒水稻种子进行种子萌发实验，结果表明：粳稻日本晴种子老化处理0d、7d、10d后，种子的发芽率分别为98.33％、68.00％和26.67％，通常被分别视为高活力种子、中活力种子和低活力种子；籼稻金农丝苗种子老化处理0d、7d、10d后，种子的发芽率分别为97.33％、31.67％和0％，通常被分别视为高活力种子、低活力种子和无活力种子。
3、采用本发明微观动态分子流检测技术对每组剩余的10粒水稻种子做动态H2O2流检测
(1)实验仪器
H2O2分子流的检测用非损伤微测系统NMT100-SIM-YG，系统软件imFlux，微电极为尖端直径为2～4μm的玻璃电极，型号为XY-DJ-502，厂家为：旭月(北京)科技有限公司。
(2)实验试剂：
配制试剂：配制不同浓度的校正液1、2、3。校正液1的配方为0.01mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0；校正液2的配方为0.1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0；校正液3的配方为1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0，现配先用。
配制测试液，配方为100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0，现配先用。
(3)测定方法包括以下步骤：
a、将配置好的校正液1、2、3分别倒入3个培养皿中，将盛有校正液1的培养皿放到载物台上，将参比电极冲洗干净，放入校正液1中，随后将微电极也放入校正液1中开始校正，观察仪器“tip”读数；若变化波动小，读取校正液1的电流读数；将参比电极取出，用去离子水冲洗干净，用滤纸将表面水分吸干；再利用校正液2和校正液3进行校正，方法同校正液1；当电极校正合格，即可开始测量；
b、将去壳后的种子在测试液中浸泡3h，再用校正后的微电极在种子外表面靠近胚轴处振动检测，如图1所示；检测时微电极的运动方向垂直于种子表面，每次电极移动距离为30μm，检测的间隔时间为10s，每粒水稻种子检测10min；测定完成后，记录好读数；
c、对检测结果进行处理和分析；将种子检测后得到电势的差值ΔI(fA)通过非损伤微测系统NMT100-SIM-YG自带系统软件imFlux进行计算后，再利用公式J0＝-D×(dc/dx)计算得到H2O2分子流速；所述J0是H2O2分子流速，单位是pmol·cm-2·s-1；dc为H2O2分子的浓度梯度；dx为电极移动距离；D是H2O2分子在测试液中的扩散常数。
(4)实验结果：
粳稻日本晴种子活力测定结果如图2所示，正值代表H2O2外流，负值代表H2O2内流。结果表明，老化处理0d的种子，H2O2分子的流速为-0.1750pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为内流；老化处理7d的种子，H2O2分子的流速为0.5754pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流；老化处理10d的种子，H2O2分子的流速为1.0907pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流。
籼稻金农丝苗种子活力测定结果如图3所示，正值代表H2O2外流，负值代表H2O2内流。结果表明，老化处理0d的种子，H2O2分子的流速为0.2451pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流；老化处理7d的种子，H2O2分子的流速为0.7690pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流；老化处理10d的种子，H2O2分子的流速为1.3617pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流。
4、对上述测定得到的粳稻日本晴和籼稻金农丝苗的种子发芽率以及该发芽率对应的种子的H2O2流速，以发芽率为y值，H2O2流速为x值，拟合得到水稻种子发芽率与H2O2流速的线性关系为y＝-0.85x+1.13，R＝0.94；计算发芽率85％时的H2O2流速为0.33pmol·cm-2·s-1，计算发芽率50％时的H2O2流速为0.74pmol·cm-2·s-1；当实测种子的H2O2流速≤0.33pmol·cm-2·s-1时，评价为高活力种子，当实测种子的H2O2流速≥0.74pmol·cm-2·s-1时，评价为低活力种子；当实测种子的H2O2流速在0.33～0.74pmol·cm-2·s-1之间，评价为中活力种子。
因此，根据H2O2流速来评价水稻种子活力是一种直接而有效的方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
试剂：配制不同浓度的校正液1、2、3；校正液1的配方为0.01mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0；校正液2的配方为0.1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0；校正液3的配方为1mMH2O2、100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0，现配先用。
配制测试液，配方为100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH＝6.0，现配先用。
所述H2O2流的检测采用非损伤微测系统NMT100-SIM-YG，系统软件imFlux，微电极为尖端直径为2～4μm的玻璃电极，型号为XY-DJ-502，厂家为：旭月(北京)科技有限公司。
实施例1
本实施例的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，利用微观动态分子流检测技术对在储藏库中储藏一年、两年、三年和四年的水稻品种新丰2号种子做动态H2O2流检测，根据种子的H2O2流速来评价种子活力。
本实施例的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，包括以下步骤：
(1)将配制好的校正液1、2、3分别倒入3个培养皿中，将盛有校正液1的培养皿放到载物台上，将参比电极冲洗干净，放入校正液1中，随后将微电极也放入校正液1中开始校正，观察仪器“tip”读数；若变化波动小，读取校正液1的电流读数；将参比电极取出，用去离子水冲洗干净，用滤纸将表面水分吸干；再利用校正液2和校正液3进行校正，方法同校正液1；当电极校正合格，即可开始测量；
(2)将去壳后的种子在测试液中浸泡3h，再用校正后的微电极在种子外表面靠近胚轴处振动检测，如图1所示；检测时微电极的运动方向垂直于种子表面，每次电极移动距离为30μm，检测的间隔时间为10s，每粒水稻种子检测8min；测定完成后，记录好读数。
(3)对检测结果进行处理，将种子检测后得到电势的差值ΔI(fA)通过非损伤微测系统NMT100-SIM-YG自带系统软件imFlux进行计算后，再利用公式J0＝-D×(dc/dx)计算得到H2O2分子流速；所述J0是H2O2分子流速，单位是pmol·cm-2·s-1；dc为H2O2分子的浓度梯度；dx为电极移动距离；D是H2O2分子在测试液中的扩散常数。
结果分析为：储藏一年的水稻新丰2号种子H2O2流速为0.1344pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流，评价为高活力种子；储藏两年的水稻新丰2号种子H2O2流速为0.3163pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流，评价为高活力种子；储藏三年的水稻新丰2号种子H2O2流速为0.6382pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流，评价为中活力种子；储藏四年的水稻新丰2号种子H2O2流速为0.9718pmol·cm-2·s-1，H2O2流动方向为外流，评价为低活力种子。
本发明的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，也适用于对小麦、玉米、大豆等其他农作物种子的活力判定，操作基本同上，也可根据种子的形态结构不同对浸泡时间进行适当调整。

Claims (8)

1.一种基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，利用微观动态分子流检测技术对种子做动态H2O2流检测，根据种子的H2O2流速来评价种子活力。
2.根据权利要求1所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将去壳后的种子在测试液中浸泡，再用校正后的微电极对待测种子进行检测；
(2)对检测结果进行处理和分析。
3.根据权利要求2所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述测试液的配方为100mMKCl、300mMC6H13NO4S、100mMCaCl2，pH值为6.0。
4.根据权利要求2所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，浸泡的时间为3h。
5.根据权利要求2所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，检测的部位为种子外表面靠近胚轴处。
6.根据权利要求2所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，检测的时间为8～12min。
7.根据权利要求1或2所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，评价种子活力的标准由以下步骤得到：测定种子的发芽率以及该发芽率对应的种子的H2O2流速，以发芽率为y值，H2O2流速为x值，拟合得到发芽率与H2O2流速的线性曲线；计算发芽率85％时的H2O2流速A，当实测种子的H2O2流速≤A时，评价为高活力种子；同时计算发芽率50％时的H2O2流速B，当实测种子的H2O2流速≥B时，评价为低活力种子；当实测种子的H2O2流速在A～B之间，评价为中活力种子。
8.根据权利要求7所述的基于微观动态分子流检测技术判定种子活力的方法，其特征在于，所述种子为水稻种子，当实测种子的H2O2流速≤0.33pmol·cm-2·s-1时，评价为高活力种子；当实测H2O2流速≥0.74pmol·cm-2·s-1时，评价为低活力种子；当实测种子的H2O2流速在0.33～0.74pmol·cm-2·s-1之间时，评价种子为中活力种子。
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