CN102577852A

CN102577852A - 一种棉花耐盐性鉴定方法

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Publication number: CN102577852A
Application number: CN2012100326740A
Authority: CN
Inventors: 董合忠; 孔祥强; 罗振; 代建龙; 李维江; 辛承松; 唐薇; 张冬梅
Original assignee: Shandong Cotton Research Center
Current assignee: Shandong Cotton Research Center
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明公开了一种棉花耐盐性鉴定方法。它首先选取具有1片真叶的健壮棉苗，用含150mM NaCl的营养液处理24h后，选取生长状态良好的侧根，剪下根尖并在测试缓冲液中预处理30min；然后将根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿中，利用非损伤微测系统测定并结合Mageflux软件进行数据分析，得出根尖的Na⁺和K⁺的外排流速，并计算出Na⁺/K⁺；Na⁺外排流速越大、K⁺外排流速越小，或者Na⁺/K⁺流速比越大，说明耐盐性越强。本发明的耐盐性鉴定方法具有非损伤检测，数据准确和鉴定快速的特点，不仅可用于棉花耐盐性的鉴定，而且也可用于其他植物耐盐性的鉴定。

Description

一种棉花耐盐性鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种棉花的耐盐性鉴定方法，具体为利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花根系Na⁺和K⁺流速，鉴定棉花耐盐性的方法。

背景技术

1974年美国海洋生物学实验室的神经科学家Jaffe首先提出非损伤微测技术原初概念，1990年非损伤微测技术被成功应用于测定细胞的Ca²⁺流速，目前该技术已广泛应用于生命科学、环境科学和材料科学等领域。非损伤微测技术可测定Ca²⁺、H⁺、K⁺、Na⁺、Cl^-等离子流速和三维运动方向的信息，具有活体、动态、实时、内外兼测、长时间、多维扫描与测量的特点。2011年Cuin等利用非损伤微测技术研究发现盐胁迫下耐盐小麦品种根系Na⁺外排能力高于盐敏感小麦品种，但K⁺外排能力低于盐敏感小麦品种。

盐胁迫下植物吸收大量Na⁺导致离子毒害，同时抑制K⁺的吸收和积累，导致K⁺/Na⁺比降低，盐胁迫下植物体内Na⁺和K⁺含量可作为评价植物耐盐性的重要指标。目前棉花耐盐性鉴定一般采用盐池、盆栽和海水浇灌等方法，测定盐处理后棉花生物量以及Na⁺、K⁺含量等生理指标，该方法不仅占地面积大，鉴定时间长，而且通常需要破坏性取样，效果有时也不稳定。因此，建立一种活体、快速、准确的棉花耐盐性鉴定方法十分必要。

发明内容

本发明的目的是要解决传统棉花耐盐性鉴定方法的不足，提供一种适合包括棉花在内的植物的活体、快速、准确的耐盐性鉴定方法。

本发明所采用的技术方案是：一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，选取具有1片真叶的健壮棉苗，用含150mM NaCl的营养液处理24h后，选取生长状态良好的侧根，剪下根尖并在测试缓冲液中预处理30min；然后将根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿中，利用非损伤微测系统测定并结合Mageflux软件进行数据分析，得出根尖的Na⁺和K⁺的外排流速，并计算出Na⁺/K⁺；Na⁺外排流速越大、K⁺外排流速越小，或者Na⁺/K⁺流速比越大，说明耐盐性越强；反之，Na⁺外排流速越小、K⁺外排流速越大，或者Na⁺/K⁺流速比越小，说明耐盐性越差。

具体包括以下步骤：

(1)棉苗培养和盐处理

选取充实饱满的脱绒棉子，浸泡后剥掉种皮，用0.1％的升汞溶液消毒15min，然后用灭菌的双蒸水冲洗6遍，种植在用双蒸水浸泡过的滤纸上(中间注意保持水分)，置日光温室中(22～32℃)发芽出苗。棉苗子叶完全展开后，选取大小一致的健壮棉苗，放入装有Hoagland营养液的育苗钵中培养(22～32℃，湿度60％～75％)，每两天换一次营养液。待棉苗长出1片真叶后，选取根系完整、大小一致的棉苗用含150mM NaCl的Hoagland营养液处理24小时。

(2)Na⁺、K⁺流速测定

选取部位相同、生长状态良好、长度和粗细程度一致的侧根用于Na⁺和K⁺流速测定。具体方法为：将侧根的根尖部分用剪刀剪下(2-3cm)并用双蒸水冲洗，除去根尖表面附着的无机盐离子，然后在测试缓冲液中平衡30min(中间更换1～2次缓冲液)；将根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿中，用非损伤微测系统(NMT system BIO-IM)测定距离根尖0.5cm处；每个棉花品种(材料)测定3株，每株测定2条侧根，每条根测定5～10min。

(3)Na⁺、K⁺流速计算和耐盐性分析

将步骤(2)中获得的原始数据输入Mageflux软件进行换算处理，得出距离根尖0.5cm处的Na⁺和K⁺的外排流速，并计算出Na⁺/K⁺。Na⁺外排流速越大、K⁺外排流速越小，或者Na⁺/K⁺流速比越大，说明耐盐性越强；反之，Na⁺外排流速越小、K⁺外排流速越大，或者Na⁺/K⁺流速比越小，说明耐盐性越差。

本发明的耐盐性鉴定方法和其他方法相比，具有以下优点：

(1)数据准确，可重复性好。棉苗处理是在水培条件下进行的，处理前棉花根系生长状况一目了然，利于选取生长一致的棉苗，减少试验的误差；盐处理时间较短，避免了盐处理时间过长引起的误差；先进的非损伤微测技术可确保测试的准确性和可重复性。

(2)鉴定快速。这种方法只需棉苗长至1片真叶前后就可以处理和测定，减少了棉苗的前期培养时间；盐处理24小时后即可测定离子流速，与其他鉴定方法相比显著缩短了盐处理时间，并且每个品系的Na⁺、K⁺流速测定可在短时间内完成。

(3)非损伤检测。该方法不需要破坏性取样，仅取2条侧根，不影响被检测棉苗的正常生长，检测完成后，棉苗可继续生长发育或用于其它研究；剪下的侧根在一定时间内与活体根系的活力相同，可以完全代表活体状态下棉花根系的Na⁺、K⁺流速，能够准确显示出生长状态下棉株对盐胁迫的反应和耐盐性。

具体实施方式

本实施例的非损伤微测系统、Mageflux软件及测定Na⁺、K⁺流速的测试缓冲液和新鲜测试液由旭月(北京)科技有限公司提供。

实施例1：

取3个灭菌的半径10cm的培养皿，分别放入两张相同大小的滤纸，并加入10ml灭菌的双蒸水；将泗棉3号(SM3)和过量表达山菠菜CMO基因的两个耐盐棉花品系(CMO2和CMO4)的脱绒种子各20粒，浸泡后剥掉种皮，用0.1％升汞溶液消毒15min，然后用灭菌的双蒸水冲洗6遍，分别种植在上述培养皿中，置温室中(22～32℃)发芽出苗。棉苗子叶完全展开后，每个品种选取10棵大小一致的健壮棉苗，放入装有Hoagland营养液的育苗钵中生长(22～32℃，湿度60％～75％)，营养液每两天换一次。待棉花长出1片真叶后，每个品系各选取3棵根系完整、大小一致的棉苗用含150mM NaCl的Hoagland营养液处理24小时。

表1盐胁迫后SM3、CMO2和CMO4根系的Na⁺、K⁺流速和Na⁺和K⁺流速的比值

选取部位相同、生长状态良好、长度和粗细程度一致的侧根，用剪刀剪下侧根根尖(2-3cm)，用双蒸水冲洗干净，放置在测试缓冲液中平衡30min(中间换1-2次测试缓冲液)后，用小石块和滤纸条把根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿底部，用非损伤微测系统(NMT system BIO-IM)测定Na⁺和K⁺流速(原始数据为电流值)。每个棉花品种测定3棵，其中每棵棉苗测定2条根。把测定出的原始数据输入Mageflux软件，计算出盐胁迫后SM3、CMO2和CMO4的Na⁺和K⁺流速(表1)。发现盐胁迫下转基因耐盐棉花品系CMO2和CMO4的Na⁺外排比SM3分别提高了27.5％和25.9％，Na⁺/K⁺比SM3分别提高了44.8％和39.9％，但CMO2和CMO4的K⁺外排比SM3降低了11.5％和9.7％。这与已知CMO2和CMO4耐盐性显著高于SM3的结果完全一致，说明该技术可用于鉴定不同棉花品种的耐盐性。

实施例2：

取2个灭菌的半径10cm的培养皿，分别放入两张相同大小的滤纸，并加入10ml灭菌的双蒸水；将充实饱满的棉花(鲁棉研28号)和海滨锦葵的种子各20粒，剥掉种皮后用0.1％升汞溶液浸泡15min，然后用灭菌的双蒸水冲洗6遍，分别种植在上述培养皿中，置温室中(22～32℃)发芽出苗。待棉花(鲁棉研28号)和锦葵子叶完全展开后，选取10棵大小一致的健壮苗，放入装有Hoagland营养液的育苗钵中生长(22～32℃，湿度60％～75％)，营养液每两天换一次。待长出1片真叶后，分别选取3棵根系完整、大小一致的幼苗用含150mM NaCl的Hoagland营养液处理24小时。

表2盐胁迫后锦葵和鲁棉研28根系的Na⁺、K⁺流速和Na⁺和K⁺流速的比值

选取部位相同、生长状态良好、长度和粗细程度一致的侧根，用剪刀剪下侧根根尖(2-3cm)，用双蒸水冲洗干净，放置在测试缓冲液中平衡30min(中间换1-2次测试缓冲液)后，用小石块和滤纸条把根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿底部，然后用非损伤微测系统(NMT system BIO-IM)测定Na⁺和K⁺流速(原始数据为电流值)。分别测定3株鲁棉研28号棉花和3株锦葵，每株测定2条侧根。把测定出的原始数据输入Mageflux软件，计算出盐胁迫后鲁棉研28号棉花和锦葵根系的Na⁺和K⁺流速和Na⁺/K⁺(表2)。发现盐胁迫下锦葵的Na⁺外排比鲁棉研28号棉花高44.3％，Na⁺/K⁺比鲁棉研28号棉花高88.9％，而K⁺外排则比鲁棉研28号棉花低23.5％(表2)。这与已知锦葵的耐盐性高于鲁棉研28号棉花的结果完全一致，进一步说明该技术可用于鉴定植物的耐盐性。

Claims

1.一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，选取具有1片真叶的健壮棉苗，用含150mM NaCl的营养液处理24h后，选取生长状态良好的侧根，剪下根尖并在测试缓冲液中预处理30min；然后将根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿中，利用非损伤微测系统测定并结合Mageflux软件进行数据分析，得出根尖的Na⁺和K⁺的外排流速，并计算出Na⁺/K⁺；Na⁺外排流速越大、K⁺外排流速越小，或者Na⁺/K⁺流速比越大，说明耐盐性越强；反之，Na⁺外排流速越小、K⁺外排流速越大，或者Na⁺/K⁺流速比越小，说明耐盐性越差。

2.如权利要求1所述的一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，

(1)棉苗培养和盐处理

将剥掉种皮的棉子用0.1％的升汞溶液消毒15min，然后用灭菌的双蒸水冲洗后种植在用双蒸水浸泡过的滤纸上，置日光温室中发芽出苗；棉苗子叶完全展开后，放入装有Hoagland营养液的育苗钵中培养；待棉苗长出1片真叶后，选取根系完整、大小一致的棉苗用含150mM NaCl的Hoagland营养液处理24小时；

(2)Na⁺、K⁺流速测定

选取生长状态良好的侧根，将侧根的根尖部分用剪刀剪下并用双蒸水冲洗，放置在测试缓冲液中平衡30min，然后将根尖固定在含有新鲜测试液的培养皿中，用非损伤微测系统测定根尖；

(3)Na⁺、K⁺流速计算和耐盐性分析

将步骤(2)中获得的原始数据输入Mageflux软件进行换算处理，得出根尖的Na⁺和K⁺的外排流速，并计算出Na⁺/K⁺；Na⁺外排流速越大、K⁺外排流速越小，或者Na⁺/K⁺流速比越大，说明耐盐性越强；反之，Na⁺外排流速越小、K⁺外排流速越大，或者Na⁺/K⁺流速比越小，说明耐盐性越差。

3.如权利要求2所述的一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，所述步骤(1)棉苗子叶完全展开后，选取大小一致的健壮棉苗，放入装有Hoagland营养液的育苗钵中于温度22～32℃，湿度60％～75％下培养，每两天换一次营养液。

4.如权利要求1-3中任意一项所述的一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，所述每个棉花品种测定3株，每株测定2条侧根，每条根测定5～10min。

5.如权利要求1-3中任意一项所述的一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，所述测定用的侧根为部位相同、生长状态良好、长度和粗细程度一致的侧根；所述根尖的长度为2-3cm。

6.如权利要求1-3中任意一项所述的一种棉花耐盐性鉴定方法，其特征是，所述测定部位为距离根尖0.5cm处。