CN106978483A - 一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法，包括利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗根系和叶片组织中Na⁺离子流和K⁺离子流，同时结合盐胁迫下棉花根系和叶片组织中GhAKT1和GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。本发明提供了一种快速鉴定盐胁迫下棉花幼苗‘保钾排钠’能力的方法，从而可以区分耐盐性遗传背景差异的棉花种质材料。本发明利用离子流以及相关基因的差异，快速、准确的鉴定棉花材料‘保钾排钠’的能力，建立起一种稳定高效的棉花苗期耐盐性鉴定的方法，具有一定的实用价值。

Description

一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法

技术领域

本发明涉及一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法，涉及电生理学、分子生物学和植物遗传育种领域。

背景技术

当前，土壤盐渍化已经成为一个全球性的问题，全球土地盐碱化呈现越来越严重的趋势(马晨等,2010)。而我国是世界盐碱地大国之一，盐渍土面积约有3.3×10⁷hm²，严重的阻碍了农业经济的发展(赵可夫和李法曾,1999)。盐渍土作为一种土地资源，有着巨大的潜力和特殊的利用价值，如何积极的利用和开发地球表面大面积盐碱地，这是国内外亟待解决的重大课题，也是21世纪农业生产中十分迫切和重要的任务。

棉花是一种中等抗盐的作物，其盐胁迫的临界浓度是7.7dS m^-1，它以其较好的耐盐性逐渐成为盐碱地一种改良盐碱旱地的先锋作物(Ashraf and Ahmad,2000；Zhang etal,2014)。然而，棉花虽然是一种比较耐盐的农作物，但棉花的耐盐能力仍然有限，当土壤盐分浓度大于0.3％时，也会对棉花产生危害，尤其是其幼苗对盐分仍然比较敏感(Leidiet al,1997；Li et al,2013)。提高和改良棉花品种的抗盐碱能力已经成为棉花育种中重点目标，而建立简便快速的耐盐性鉴定方法则是棉花耐盐品种选择和育种研究的基础。

据Takahashi et al(2007)报道，许多植物能够忍耐土壤中高浓度的盐分，主要与植物自身在盐渍环境中可将Na⁺外排到胞质外维持细胞质中较低的Na⁺含量有关；孙小芳等(2000)的报道也指出，耐盐棉花品种根系具有一定的截留Na⁺作用。在盐胁迫下，由于植株吸收和积累大量钠离子，进而影响植物对其他营养元素的吸收，尤其是影响了K⁺的吸收，打破了植物体内离子平衡的稳态，造成一定程度的单盐毒害(Zhang et al,2014)；植物获得耐盐能力的另一个重要策略是离子稳态的重建，保持细胞质内高K⁺低Na⁺的平衡状态是植物抵御盐害的重要手段(Ding et al,2010)。Shabala和Cuin(2008)也指出，维持组织中较高的K⁺/Na⁺比值比单纯维持较低的Na⁺含量更重，这种选择性运输是棉花耐盐性的一个重要特点。因此，如何快速有效的鉴别不同棉花材料间‘保钾排钠’能力，对于我国棉花种质资源的筛选、棉花材料的耐盐性鉴定具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法。

本发明技术方案如下：

一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法，包括利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗根系和叶片组织中Na⁺离子流和K⁺离子流，同时结合盐胁迫下棉花根系和叶片组织中GhAKT1和GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。

本发明研究发现，盐胁迫下，棉花材料的耐盐性与根系中和叶片中K⁺离子流的外排呈负相关，与根系中和叶片中Na⁺离子流呈显著的正相关；在盐胁迫6～18h内，不同材料间GhAKT1和GhSOS1的表达水平较高且差异较大；棉花材料的耐盐性与根系中GhAKT1、GhSOS1以及叶片中GhSOS1的表达情况呈正相关，与叶片中GhAKT1表达情况呈负相关。

研究发现，在本发明条件下，以棉花品种中49为对照，当待测棉花种质材料‘保钾排钠’能力高于中49，即根系中和叶片中K⁺离子流的外排低于中49，且Na⁺离子的外排高于中49时，棉花种质材料为耐盐品种；反之，棉花种质材料则为不耐盐品种。

本发明所述‘保钾排钠’是指：在盐胁迫下，植物通过钾离子运输系统提高K⁺离子吸收和通过钠离子运输系统增强Na⁺离子外排的能力。

研究发现，棉花材料的耐盐性与根中GhAKT1基因、GhSOS1基因以及叶片中GhSOS1基因的表达情况呈正相关，与叶片中GhAKT1基因表达情况呈负相关。

本发明所述棉花种质材料包括但不限于中49(中等耐盐型)、中571(敏感型)、中棉所44和新陆中61。

本发明所述方法中，盐胁迫处理在棉花苗三叶期进行，可按常规方法进行盐胁迫处理。

较佳的盐胁迫处理方法包括将棉花苗培养至三叶期，进行盐胁迫处理，使其土壤终含盐量为0.3％；盐胁迫处理9天后，测定不同处理条件下各指标。为保持土壤中的水分及营养，每隔两天浇100ml的水，每隔五天浇100ml的Hoagland营养液。

一般地，可将棉花种子经消毒处理，用水漂洗后，在水中浸种催芽直至露白，然后播种于沙壤土中培养至三叶期，再进行盐胁迫处理。优选地，培养条件包括：光照培养温度为(30±2)℃，黑暗培养问题为(20±2)℃；光照/黑暗时间为14h/10h，光照强度为400μmolm^-2 s^-1。

本发明所述方法中，优选地，所用棉花幼苗根系为中部根系，具体为切取中部完整的根系(约3cm)作为根系样品；所用叶片为第三片叶，具体为切取第三叶片的中间部位(约5×5mm)作为叶肉组织样品。

本发明所述非损伤微测技术(NMT)可采用本领域常规方法进行，例如采用美国扬格Younger USA Sci非损伤微测系统(BIO-001A,Younger USA Sci.&Tech.Corp.,Amherst,MA,USA)。

所述Na⁺离子流和K⁺离子流的检测方法包括：将待测定的样品(盐胁迫下棉花幼苗根系和叶片组织)用去离子水冲洗干净，并将其浸没在蒸馏水15min，浸入100mL测试液中平衡15min，再转入新的100mL测试液中开始测试。测试液配方：0.1mmol L^-1KCl、0.1mmol L^{- 1}CaCl₂、0.3mmol·L^-1MES，pH 6.0；每处理测定8株幼苗，测试部位距根系分生区(距根尖约200μm处)和叶片样品位置300μm处；测试持续7～10min(达到稳定状态)，计算时舍弃前2～3min的数据。

本发明可应用qRT-PCR技术检测棉花苗胁迫后根系和叶片中GhAKT1和GhSOS1基因表达水平。可参照孟艳艳等(2011)改良的CTAB法提取总RNA，逆转录合成cDNA。采用PrimerExpress3.0软件设计qRT-PCR引物以棉花中的GhUBQ7基因(GenBank登录号：DQ116441)作为内参，GhAKT1(GenBank登录号：KF294166)和GhSOS1(GenBank登录号：KM986873)设计荧光定量PCR特异性引物。

引物序列分别为：

a)GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′，

GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；

b)GhAKT1-F：5′-CAATTGCCTCCTCGCCTACT-3′，

GhAKT1-R：5′-ATGCTCGATCGGATGGCTTT-3′；

c)GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′，

GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′。

采用SYBR greenⅡ荧光染料(TaKaRa,Japan)法进行荧光定量RT-PCR分析，扩增条件为95℃30s，95℃5s，60℃35s，40个循环，结果采用2^-ΔΔCT对基因相对表达量进行分析(Livak et al.2001)。

为了更好地提高筛选结果的准确性，本发明方法还包括检测检测盐胁迫处理前后棉花幼苗叶片(优选幼苗第三片叶)的电导率和丙二醛含量。

本发明研究发现，上述电导率和丙二醛含量的增加幅度与耐盐性呈负相关，即在盐胁迫前后，电导率和丙二醛含量增加幅度越高，棉花材料的耐盐性越低。

本发明所述电导率和丙二醛含量均可采用现有技术常规方法进行。例如，取0.5g新鲜的上述盐胁迫处理前后幼苗第三片叶，分别参照Nayyar et al(2005)的方法应用电导仪(EC 215,Hanna Instruments,USA)测定相对电导率；参照Stewart和Bewley(1980)的硫代巴比妥酸(TBA)方法测定丙二醛(MDA)的含量。

为了进一步地提高筛选结果的准确性，本发明方法还包括检测盐胁迫处理前后棉花幼苗鲜重及干物质。

本发明研究发现，棉花幼苗鲜重及干物质的降低幅度与耐盐性呈负相关，即在盐胁迫前后，鲜重及干物质降低幅度越高，棉花材料的耐盐性越低。

所述棉花幼苗鲜重及干物质可用本领域常规方法进行，例如检测方法包括取待测棉花幼苗植株，先用去离子水浸泡10min后，再用蒸馏水冲洗干净，并用吸水纸吸去表面附着的水分，称量鲜重；将整株幼苗或将将幼苗根及地上部(茎和叶)分开，分别于105℃杀青30min后，80℃下烘直至恒重，称量干物质。

为了更进一步地提高筛选结果的准确性，本发明方法还包括检测盐胁迫处理前后棉花幼苗根系中和/或叶片中Na⁺、K⁺。

本发明研究发现，上述棉花幼苗叶片中Na⁺含量的增加幅度与耐盐性呈负相关，即在盐胁迫前后，幼苗叶片中Na⁺含量的增加幅度越高，棉花材料的耐盐性越低；上述棉花幼苗叶片中K⁺含量的降低幅度与耐盐性呈负相关，即在盐胁迫前后，幼苗叶片中K⁺含量降低幅度越高，棉花材料的耐盐性越低。

棉花幼苗根系中和叶片中Na⁺、K⁺可用本领域常规方法进行，例如将烘干后的植株粉碎过筛，用1mol L^-1HCl浸提12h并振荡30min后过滤，用原子吸收分光光度计(SpectAA-50/55,Varian,Australia)测定K⁺和Na⁺含量。

具体地，一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法，包括：

1)将棉花种子用9％的双氧水消毒30min，用水漂洗数次后用去离子水浸种催芽直至露白，播种于灭菌的沙壤土中培养至三叶期，进行盐胁迫处理，使其土壤终含盐量为0.3％；为保持土壤中的水分及营养，每隔两天浇100mL水，每隔5天浇100mL Hoagland营养液；

培养条件包括：光照培养温度为(30±2)℃，黑暗培养问题为(20±2)℃；光照/黑暗时间为14h/10h，光照强度为400μmol m^-2 s^-1；

2)检测检测盐胁迫处理前后棉花幼苗第三片叶的电导率和丙二醛含量；

3)检测盐胁迫处理前后棉花幼苗鲜重及干物质；

4)检测盐胁迫处理前后棉花幼苗根系中和叶片中Na⁺、K⁺；

5)盐胁迫处理9天后，利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗根系和第三叶片组织中Na⁺离子流和K⁺离子流；

具体包括：将待测定的样品用去离子水冲洗干净，并将其浸没在蒸馏水15min，浸入100mL测试液中平衡15min，再转入新的100mL测试液中开始测试；测试液配方：0.1mmolL^-1KCl、0.1mmol L^-1CaCl₂、0.3mmol·L^-1MES，pH 6.0；每处理测定8株幼苗，测试部位距根系分生区(距根尖约200μm处)和叶片样品位置300μm处；测试持续7～10min；计算时舍弃前2～3min的数据；

6)盐胁迫处理9天后，应用qRT-PCR技术检测棉花苗胁迫后根系和叶片中GhAKT1和GhSOS1基因表达水平；

以棉花中的GhUBQ7基因作为内参，设计的特异性引物分别为：

a)GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′，

GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；

b)GhAKT1-F：5′-CAATTGCCTCCTCGCCTACT-3′，

GhAKT1-R：5′-ATGCTCGATCGGATGGCTTT-3′；

c)GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′，

GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′；

反应体系为：2×UltraSYBR Mixture(With ROX1)10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-Free Water 8.4μl。

采用SYBR greenⅡ荧光染料(TaKaRa,Japan)法进行荧光定量RT-PCR分析，扩增条件为95℃30s，95℃5s，60℃35s，40个循环，结果采用2^-ΔΔCT对基因相对表达量进行分析；

7)根据步骤2)至步骤6)的分析结果，区分出耐盐性差异的棉花种质材料。

本发明进一步提供上述方法在筛选耐盐性棉花品种中的应用。

本发明通过测定盐胁迫下棉花幼苗根系及叶片中K⁺和Na⁺离子流，同时结合K⁺和Na⁺运转基因GhAKT1和GhSOS1的表达情况，提供了一种快速鉴定盐胁迫下棉花幼苗‘保钾排钠’能力的方法，从而可以区分耐盐性遗传背景差异的棉花种质材料。以选用2个耐盐性差异显著的棉花品种材料为例，利用沙壤土为培养基质，种植在人工培养箱中，研究盐协迫下各品种的干物质累积、电导率、丙二醛含量以及不同部位的K⁺/Na⁺浓度；同时采用非损伤微测技术(NMT)和qRT-PCR技术，测定盐胁迫条件下K⁺和Na⁺离子流、GhAKT1和GhSOS1的变化情况。结果表明，盐胁迫下不同耐盐性棉花材料在K⁺和Na⁺吸收动态、GhAKT1和GhSOS1的表达变化趋势上具有明显差异，可以利用离子流以及相关基因的差异，快速、准确的鉴定棉花材料‘保钾排钠’的能力，建立起一种稳定高效的棉花苗期耐盐性鉴定的方法，具有一定的实用价值。

本发明有益效果：在盐量为0.3％的盐胁迫条件处理9天后，通过测定根系及叶片中K⁺和Na⁺离子流的实时变化7～10min，便可以鉴定出不同棉花材料‘保钾排钠’的能力，具有快速、便捷等特点。棉花材料的耐盐性与根中GhAKT1、GhSOS1以及叶片中GhSOS1的表达情况呈正相关，与叶片中GhAKT1表达情况呈负相关。在盐胁迫6～18h内，不同材料间GhAKT1和GhSOS1的表达水平较高且差异较大，可以通过GhAKT1和GhSOS1表达水平的比较，从基因层面上进一步有效的区分耐盐性遗传背景差异的棉花种质材料。

附图说明

图1为本发明实施例中盐胁迫下不同棉花幼苗的鲜重、干物质以及叶片中丙二醛(MDA)和电导率变化情况；标以不同字母的柱值在P<0.05水平上差异显著；

图2为本发明实施例中盐胁迫下不同棉花幼苗的根及叶片中K⁺和Na⁺浓度变化情况；标以不同字母的柱值在P<0.05水平上差异显著；

图3为本发明实施例中盐胁迫下不同棉花幼苗的根及叶片中K⁺离子流和Na⁺离子流变化情况；

图4为本发明实施例中盐胁迫下不同棉花幼苗的根及叶片中GhAKT1和GhSOS1基因的变化情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

1 研究方法

供试品种和盐胁迫处理；以盐敏感型中571、耐盐型中49为研究对象，在中国农业科学院棉花研究所光照培养箱内进行，光照培养室温度为(30±2)℃/(20±2)℃，光照/黑暗时间为14h/10h，光照强度为400μmol m^-2 s^-1。种子用9％的双氧水消毒30min，清水漂洗数次后用去离子水浸种催芽直至露白，均匀播于高温灭菌过的沙壤土中，在培养箱中培养到三叶期，进行盐胁迫处理，使其土壤终含盐量为0.3％；盐胁迫处理9天后，测定不同处理条件下各指标。为保持土壤中的水分及营养，每隔两天浇100ml的水，每隔五天浇100ml的Hoagland营养液。

电导率和丙二醛含量的测定；取0.5g新鲜的幼苗第三片叶，分别参照Nayyar etal(2005)的方法应用电导仪(EC 215,Hanna Instruments,USA)测定相对电导率，参照Stewart和Bewley(1980)的硫代巴比妥酸(TBA)方法测定丙二醛(MDA)的含量。

鲜重、干物质量、Na⁺和K⁺含量的测定；取盆中待测植株，先用去离子水浸泡10min后，再用蒸馏水冲洗干净，并用吸水纸吸去表面附着的水分，称量鲜重。将幼苗根及地上部(茎和叶)分开，分别于105℃杀青30min后，80℃下烘直至恒重，称其干物质重。将烘干后的植株粉碎过筛，用1mol L^-1HCl浸提12h并振荡30min后过滤，用原子吸收分光光度计(SpectAA-50/55,Varian,Australia)测定K⁺和Na⁺浓度。

测定离子流速；在旭月(北京)科技有限公司采用非损伤微测技术(NMT,BIO-001A,Younger USA Sci.&Tech.Corp.,Amherst,MA,USA)测定幼苗根系及叶片Na⁺离子流速；选生长整齐的棉花幼苗，用刀片从幼苗根中切除完整的根系作为根部样品，切取第三叶片的中间部位(～5×5mm)作为叶肉组织样品；将测定的样品用去离子水冲洗干净，并将其浸没在蒸馏水15min，浸入100mL测试液中平衡15min，再转入新的100mL测试液中开始测试。测试液配方：0.1mmol L^-1KCl、0.1mmol L^-1CaCl₂、0.3mmol·L^-1MES，pH 6.0；每处理测定8株幼苗，测试部位距样品位置300μm处；测试持续7～10min(达到稳定状态)，计算时舍弃前2～3min的数据。

离子运转体表达；应用qRT-PCR技术研究盐胁迫0、3、6、12、24和48h后，根系和叶片中GhAKT1和GhSOS1基因表达水平。参照孟艳艳等(2011)改良的CTAB法提取总RNA，逆转录合成cDNA。采用Primer Express3.0软件设计qRT-PCR引物以棉花中的GhUBQ7基因(GenBank登录号：DQ116441)作为内参，GhAKT1(GenBank登录号：KF294166)和GhSOS1(GenBank登录号：KM986873)设计荧光定量PCR特异性引物。

引物序列分别为：

a)GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′，

GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；

b)GhAKT1-F：5′-CAATTGCCTCCTCGCCTACT-3′，

GhAKT1-R：5′-ATGCTCGATCGGATGGCTTT-3′；

c)GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′，

GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′；

反应体系为：2×UltraSYBR Mixture(With ROX1)10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-Free Water 8.4μl。

采用SYBR greenⅡ荧光染料(TaKaRa,Japan)法进行荧光定量RT-PCR分析，扩增条件为95℃30s，95℃5s，60℃35s，40个循环，结果采用2^-ΔΔCT对基因相对表达量进行分析(Livak et al.2001)。

数据统计；所有实验至少独立重复3次，各次结果趋势一致，取其中具有代表性的数值进行统计分析。采用SPSS 16.0(SPSS Inc.Chicago,USA)处理数据，以Duncan’s多重比较进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果部分

盐胁迫显著的降低了棉花幼苗的鲜重及干物重，但中49受盐胁迫影响较小(见图1)。在盐胁迫下，中49和中571的鲜重分别降低了36.4％和48.9％，干物重分别降低了17.1％和28.5％。盐胁迫显著的增加了叶片中电导率和MDA的含量，中49和中571的电导率分别增加了65.7％和105.5％，MDA含量分别增加了84.3％和129.6％。上述结果表明了，中49的耐盐性较强，而中571对盐胁迫较为敏感。

盐胁迫影响了棉花组织中K⁺和Na⁺的分配，且不同棉花材料间表现出明显的差异(见图2)。其中，盐胁迫显著的降低了中49和中571叶片中K⁺的浓度，分别降低了23.1％和36.8％；盐胁迫显著的增加了根系中K⁺的浓度以及组织中(根系和叶片)Na⁺的浓度；盐胁迫下，中49根系中K⁺的浓度、Na⁺的浓度以及叶片中Na⁺浓度分别增加了30.9％、6.6倍和2.1倍，而中571中上述指标分别增加了42.2％、7.7倍和3.1倍。这些结果说明了中49根系对Na⁺具有较强的截留能力，对K⁺具有较强的吸收及转运能力，从而保持了其地上部低Na⁺高K⁺的环境，减轻了过多的Na⁺对叶片等器官的毒害作用。

为了进一步明确盐胁迫对棉花幼苗离子吸收的影响，通过NMT测定盐处理条件下幼苗根中K⁺和Na⁺离子的动态变化。如图3所示，正常条件下，棉花幼苗的根系呈现轻微的K⁺内流，叶片中呈较低的外排，但盐胁迫显著的增加了根系和叶片中K⁺外流。在盐胁迫条件下，中49的K⁺外流速率较低，根系和叶片中K⁺外流分别为263pmol cm^-2 s^-1和787pmol cm^-2s^-1，而中571的根系和叶片中K⁺外流分别为393pmol cm^-2 s^-1和1525pmol cm^-2 s^-1，比中49的外排速率分别高49.2％和93.9％。盐胁迫也显著的增加了根系和叶片中Na⁺的外流；中49根系和叶片中的Na⁺外流速率均较高，分别比中571高494pmol cm^-2 s^-1和807pmol cm^-2 s^-1。

盐胁迫显著的影响根系和叶片中GhAKT1和GhSOS1的表达，且不同材料间差异明显(见图4)。随着盐胁迫处理的延长，根系中GhAKT1和叶片中GhSOS1的表达呈先增加后降低的单峰曲线变化，且中49中的表达量均高于中571。盐胁迫处理显著的抑制了中49叶片中GhAKT1的表达，但增加了中571叶片中GhAKT1的表达。与之相反，盐胁迫处理显著的增加了中49根中GhSOS1的表达，但降低了中571根中GhSOS1的表达。

3 总结部分

本研究通过电生理和分子技术的相结合，建立了一种高效准确的室内鉴定棉花幼苗‘保钾排钠’能力的方法。盐胁迫下，棉花材料的耐盐性与根中和叶片中K⁺离子流的外排呈负相关，与根中和叶片中Na⁺离子流呈显著的正相关。在盐胁迫6～18h内，不同材料间GhAKT1和GhSOS1的表达水平较高且差异较大；棉花材料的耐盐性与根中GhAKT1、GhSOS1以及叶片中GhSOS1的表达情况呈正相关，与叶片中GhAKT1表达情况呈负相关。本研究证实，利用电生理技术和qRT-PCR技术，测定棉花种质根系和叶片中K⁺和Na⁺离子流、GhAKT1和GhSOS1的表达水平，可以快速有效的区分和筛选‘保钾排钠’能力较强的耐盐性棉花种质材料。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

[1]马晨,马履一,刘太祥,等.盐碱地改良利用技术研究进展.世界林业研究,2010,23(2):28-32.

[2]孙小芳,刘友良.NCaI胁迫下棉花体内N⁺、K⁺分布与耐盐性.西北植物学报,2000,20(6):1027-1033.

[3]赵可夫,李法曾.中国盐生植物.北京:科学出版社,1999,23-25.

[4]Ashraf M,Ahmad S.Influence of sodium chloride on ion accumulation,yield components and fiber characteristics in salt-tolerant and salt-sensitive lines of cotton(Gossypium hirsutum L.).Field Crops Research,2000,66:115-27.

[5]Ding MQ,Hou PC,Shen X,et al.Salt-induced expression of genesrelated to Na⁺/K⁺and ROS homeostasis in leaves of salt-resistant and salt-sensitive poplar species.Plant Molecular Biology,2010,73:251-269.

[6]Leidi EO,Saiz JF.Is salinity tolerance related to Na⁺accumulationin upland cotton (Gossypium hirsutum)seedlings？Plant and Soil,1997,190:67-75.

[7]Li MY,Li FJ,Yue YS,et al.NaCl-induced changes of ion fluxes inroots of transgenic bacillus thuringiensis(Bt)cotton(Gossypium hirsutum L.).Journal of Integrative Agriculture,2013,12(3):436-444.

[8]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods,2001,25:402-408.

[9]Nayyar H,Bainsb T S,Kumar S.Chilling stressed chickpea seedlings:effect of cold acclimation,calcium and abscisic acid on cryoprotectivesolutes and oxidative damage.Environ Exp Bot,2005,54:275-285.

[10]Shabala S,Cuin TA.Potassium transport and plant salttolerance.Physiologia Plantarum,2008,133:651-669.

[11]Stewart RC，Bewley JD.Lipid perexidafion associated withaccelerated aging of soybean axes.Plant Physiol,1980,245-248.

[12]Takahashi S,Badger MR.Photoprotection in plants:a new light onphotosystem II damage.Trends Plant Sci,2011,16:53–60.

[13]Zhang L,Ma HJ,Chen TT,et al.Morphological and physiologicalresponses of cotton (Gossypium hirsutum L.)plants to salinity.PLOS ONE,2014,9(11),1-14.

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法

<130> KHP171110644.5TQ

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaggcattc cacctgacca ac 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttgaccttc ttcttcttgt gcttg 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人格序列

<400> 3

caattgcctc ctcgcctact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctcgatc ggatggcttt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccttccttc tagtgtccgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcccaacg tactcccatg 20

Claims (10)

1.一种稳定高效筛选耐盐性棉花苗的方法，其特征在于，包括利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗根系和叶片组织中Na⁺离子流和K⁺离子流，同时结合盐胁迫下棉花根系和叶片组织中GhAKT1基因和GhSOS1基因的表达情况，从而区分耐盐性差异的棉花种质材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以棉花品种中49为对照，当待测棉花种质材料根系中和叶片中K⁺离子流的外排低于中49，且Na⁺离子的外排高于中49时，棉花种质材料为耐盐品种；反之，棉花种质材料则为不耐盐品种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，棉花材料的耐盐性与根中GhAKT1基因、GhSOS1基因以及叶片中GhSOS1基因的表达情况呈正相关，与叶片中GhAKT1基因表达情况呈负相关。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，还包括检测检测盐胁迫处理前后棉花幼苗叶片的电导率和丙二醛含量；和/或，

还包括检测盐胁迫处理前后棉花幼苗鲜重及干物质；和/或，

还包括检测盐胁迫处理前后棉花幼苗根系中和/或叶片中Na⁺、K⁺。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，应用qRT-PCR技术检测棉花苗胁迫后根系和叶片中GhAKT1基因和GhSOS1基因表达水平；以棉花中的GhUBQ7基因作为内参，设计的特异性引物分别为：

a)GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′，

GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；

b)GhAKT1-F：5′-CAATTGCCTCCTCGCCTACT-3′，

GhAKT1-R：5′-ATGCTCGATCGGATGGCTTT-3′；

c)GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′，

GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述qRT-PCR反应体系为：2×UltraSYBRMixture(With ROX1)10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-FreeWater 8.4μl；和/或，

采用SYBR greenⅡ荧光染料法进行荧光定量RT-PCR分析，扩增条件为95℃30s，95℃5s，60℃35s，40个循环，结果采用2^-ΔΔCT对基因相对表达量进行分析。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述盐胁迫处理在棉花苗三叶期进行；和/或，所用棉花幼苗根系为中部根系；和/或，所述棉花幼苗叶片为幼苗第三片叶。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述棉花种质材料包括但不限于中49、中571、中棉所44和新陆中61。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，包括：

1)将棉花种子用9％的双氧水消毒30min，用水漂洗数次后用去离子水浸种催芽直至露白，播种于灭菌的沙壤土中培养至三叶期，进行盐胁迫处理，使其土壤终含盐量为0.3％；为保持土壤中的水分及营养，每隔两天浇100mL水，每隔5天浇100mL Hoagland营养液；

培养条件包括：光照培养温度为(30±2)℃，黑暗培养问题为(20±2)℃；光照/黑暗时间为14h/10h，光照强度为400μmol m^-2s^-1；

2)检测检测盐胁迫处理前后棉花幼苗第三片叶的电导率和丙二醛含量；

3)检测盐胁迫处理前后棉花幼苗鲜重及干物质；

4)检测盐胁迫处理前后棉花幼苗根系中和叶片中Na⁺、K⁺；

5)盐胁迫处理9天后，利用非损伤微测技术测定盐胁迫下棉花幼苗根系和第三叶片组织中Na⁺离子流和K⁺离子流；

具体包括：将待测定的样品用去离子水冲洗干净，并将其浸没在蒸馏水15min，浸入100mL测试液中平衡15min，再转入新的100mL测试液中开始测试；测试液配方：0.1mmol L^{- 1}KCl、0.1mmol L^-1CaCl₂、0.3mmol·L^-1MES，pH 6.0；每处理测定8株幼苗，测试部位距根系分生区和叶片样品位置300μm处；测试持续7～10min；计算时舍弃前2～3min的数据；

6)盐胁迫处理9天后，应用qRT-PCR技术检测棉花苗胁迫后根系和叶片中GhAKT1和GhSOS1基因表达水平；

以棉花中的GhUBQ7基因作为内参，设计的特异性引物分别为：

a)GhUBQ7-F：5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′，

GhUBQ7-R：5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3′；

b)GhAKT1-F：5′-CAATTGCCTCCTCGCCTACT-3′，

GhAKT1-R：5′-ATGCTCGATCGGATGGCTTT-3′；

c)GhSOS1-F：5′-CCCTTCCTTCTAGTGTCCGC-3′，

GhSOS1-R：5′-AAGCCCAACGTACTCCCATG-3′；

反应体系为：2×UltraSYBR Mixture(With ROX1)10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-Free Water 8.4μl；

采用SYBR greenⅡ荧光染料法进行荧光定量RT-PCR分析，扩增条件为95℃30s，95℃5s，60℃35s，40个循环，结果采用2^-ΔΔCT对基因相对表达量进行分析；

7)根据步骤2)至步骤6)的分析结果，区分出耐盐性差异的棉花种质材料。

10.权利要求1-9任一项所述的方法在筛选耐盐性棉花品种中的应用。