CN103238396A

CN103238396A - 玉米耐盐种质的筛选方法

Info

Publication number: CN103238396A
Application number: CN201310203213XA
Authority: CN
Inventors: 彭云玲; 赵小强; 闫慧萍
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: ANHUI YINGNUO MANAGEMENT CONSULTING Co.,Ltd.
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103238396B

Abstract

玉米耐盐种质的筛选方法，步骤是：将种子消毒后在不同浓度盐溶液中浸泡12h，进行萌发和幼苗生长实验。在萌发期的胁迫实验中，每天补一次15ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4d后，每个样品留取生长一致的萌动种子，测定Na⁺、K⁺离子的含量。在幼苗生长实验中，直接将经过消毒和浸泡过的玉米种子播在含有0mmol/L、60mmol/L、140mmol/L与220mmol/L的NaC1溶液的消毒蛭石中，置于温室中进行胁迫处理，对照幼苗长到三叶一心时，测定Na⁺、K⁺离子的含量。本发明通过萌发期和幼苗生长期不同玉米自交系各个部位的Na⁺、K⁺离子含量和K⁺/Na⁺比值的变化筛选耐盐种质，能有效减少筛选工作量，缩短筛选时间，提高筛选效率和结果的准确性。

Description

玉米耐盐种质的筛选方法

技术领域

本发明属于农业新品种选育技术领域，具体涉及玉米耐盐自交系的筛选方法。

技术背景

在我国0.67亿hm² 耕地中有10%为盐渍化土壤，土壤盐渍化已成为限制农作物产量进一步提高的重要环境因子之一。玉米(Zea mays)对盐分中度敏感，耐盐性相对较差。因此，深入研究玉米耐盐生理机制，筛选耐盐品种，培育具有一定耐盐能力的玉米，对充分利用盐渍化土地，提高玉米产量具有重要意义。

对玉米耐盐种质的筛选已有大量报道，孟义江等对36份玉米杂交种进行了耐盐性筛选, 筛选出耐盐性强的品种3份；徐立华等以自交系齐319，鲁原341，Lx9801，8112的幼胚为外植体，通过组培筛选，获得了耐盐突变体，为玉米抗逆育种提供了新的种质资源。

盐胁迫对玉米的主要伤害是盐离子在细胞内大量累积，导致离子毒害和离子不平衡。盐胁迫下Na⁺大量涌入胞内，不仅破坏细胞中已形成的离子平衡状态，而且影响K⁺和Ca²⁺的胞内含量和分布。Na⁺对细胞K⁺的吸收呈现明显竞争性抑制；同时高浓度Na⁺可置换质膜和细胞内膜系统所结合的Ca²⁺，膜系统完整性被破坏，膜透性增大，导致生理生化代谢紊乱。盐胁迫下细胞内离子平衡破坏的一个典型指标就是K⁺/Na⁺降低。国内外学者对作物盐胁迫下离子含量的变化进行了大量研究，初步探索出了盐胁迫下作物离子含量的变化规律。王宝山等研究证明，在NaCI胁迫下，随盐浓度和胁迫时间增加，玉米黄化幼苗组织中Na⁺含量相应增加，根中Na⁺含量为地上部分的1倍。夏阳等报道，在NaCI胁迫下，玉米Na⁺含量增高，K⁺浓度下降，K⁺/Na⁺随盐浓度升高而降低。

目前对玉米耐盐种质的筛选主要有两种途径：一是在盐胁迫处理下，通过测定株高、根长、根数、干物质积累等性状对玉米种质进行耐盐性鉴定和评价；二是在盐胁迫处理后，通过测定玉米种质的叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）、相对电导率、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性等生理生化指标来确定玉米的耐盐性。利用这些方法虽然能够筛选出耐盐玉米种质，但是会增加筛选工作量，并且测定玉米种质的生理生化指标比较复杂、实验误差较大，要得到准确可靠的耐盐种质需要多次重复实验，因此延长实验时间，降低实验效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种玉米耐盐种质的筛选方法；该方法简便易行，不仅可以减少实验工作量，缩短实验时间，而且能够大大提高耐盐玉米种质筛选的效率和筛选结果的准确性。

为了解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案：一种耐盐种质筛选方法，包括如下步骤：

1. 收集材料：收集3个玉米自交系材料；

2. 种子精选与消毒：精选无破损、大小一致的种子，将3个玉米自交系分别用0.5%的次氯酸钠消毒10 min，用蒸馏水冲洗3-5次，用滤纸吸干附着水，得3个自交系玉米消毒种子；

3. 盐胁迫下浸种：将3个玉米自交系消毒种子分别浸泡在0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与220 mmol/L的NaC1溶液中12 h；得3个玉米自交系盐胁迫种子分别进入步骤4与步骤5；0 mmol/L即蒸馏水浸种处理为对照样品；

4. 种子萌发：将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子分别置于直径为12cm的培养皿中，双层滤纸作发芽床，每皿30粒；分别加入0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与220 mmol/L的NaC1溶液，实验设3次重复；培养皿置于培养箱中25℃暗萌发；萌发期间每天补一次15ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子进入步骤6.1测定萌动种子的种皮、胚乳、胚的Na⁺、K⁺离子含量；

5. 幼苗生长：将0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与 220 mmol/L的NaC1溶液各100 mL分别与500 g已灭菌的蛭石搅拌均匀，而后分装于15 cm×13 cm的营养钵中；将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子，分别播在各对应盐浓度的消毒蛭石中，每钵30粒，进行胁迫处理，实验设3次重复；播种后置于植物生长室中培养，生长室的昼夜温度为25±2℃/20±2℃，每天光照12 h，光照强度为600 μmol/(s·m²)，相对湿度60-80%；期间，每隔1 d补加1次50 ml的去离子水，每3 d补加一次对应浓度的NaC1溶液50 ml，胁迫处理10 d后，待对照样品叶片生长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株盐胁迫处理幼苗进入步骤6.2测定幼苗根、茎、叶的Na⁺、K⁺离子含量；

6. 离子含量测定

6.1将步骤4所得的萌动种子用60 mmol/L的NaCl溶液冲洗干净，将种皮、胚、胚乳分离，置105℃烘箱中10 min，然后于80℃下烘48 h，而后用等离子质谱测定Na⁺、K⁺离子的含量；

6.2将步骤5所得的盐胁迫处理幼苗用60 mmol/L NaCl溶液冲洗干净，将根、茎、叶分离，置105℃烘箱中10 min，然后于80℃下烘48 h，用等离子质谱测定根、茎、叶中Na⁺、K⁺离子的含量；

7. 结果分析与筛选耐盐品种：对步骤6.1测得的萌动种子与步骤6.2测得的盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na⁺、K⁺离子的含量数据，采用Excel2007软件进行数据处理，所有实验数据统计分析SPSS16.0进行处理，试验结果用平均值±标准偏差(SD)表示，采用Duncan进行差异显著性多重比较，对各处理间的差异显著性进行分析；根据萌动种子与盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na⁺、K⁺离子的含量和K⁺/Na⁺比值的变化筛选耐盐品种。

在上述耐盐种质筛选中，步骤4）培养皿和滤纸都要进行高压灭菌后使用。

步骤4、步骤5中，为了得到更好的胁迫效果，种子经步骤2消毒后，应立即进入步骤3，在相应浓度的NaC1溶液浸泡12 h。

本发明主要通过测定萌动种子的种皮、胚、胚乳以及幼苗根、茎、叶中Na⁺、K⁺离子含量和K⁺/Na⁺比值的变化来筛选耐盐种质，当处理材料和处理浓度多时，此方法不仅可以减少筛选的工作量，缩短筛选时间，而且能够大大提高了耐盐种质的筛选效率和筛选结果的准确性，为耐盐育种工作奠定了坚实的基础，具有很高的应用价值。

具体实施方式

本发明下述实施例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规试剂、器材。

实验例，玉米耐盐种质筛选的方法，按以下步骤进行：

1. 收集材料：收集了81162、8723、P138 三份玉米种质材料，供实验所用。

2. 种子消毒：精选无破损、大小一致的种子，用0.5%的次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干附着水。

3. 盐胁迫下浸种：种子消毒后，将种子分别在0 mmol/L，60 mmol/L， 140 mmol/L，220 mmol/L的NaC1溶液中浸泡12 h，蒸馏水浸种处理为对照；。

4. 种子萌发实验：将步骤3处理后的种子置于直径为12 cm的培养皿中，双层滤纸作发芽床，每皿30粒。分别加入0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与 220 mmol/L的NaC1溶液，实验设3次重复，以蒸馏水为对照。培养皿置于培养箱中25℃暗中萌发。萌发期间每天补加一次15 ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子测定种皮、胚乳和胚中的Na⁺、K⁺离子含量。

5. 幼苗生长实验：将0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与 220 mmol/L的NaC1溶液各100 mL分别与500 g已灭菌的蛭石搅拌均匀，而后分装于15 cm×13 cm的营养钵中。3个玉米自交系的种子经步骤3后，分别播在各对应盐浓度的消毒蛭石中，每钵30粒，实验设3次重复。播种后置于植物生长室中培养，生长室的昼夜温度为(25±2)/ (20±2)℃，每天光照12 h，光照强度为600 μmol/(s·m²), 相对湿度60%-80%。3个自交系的幼苗生长10 d后，对照叶片生长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株幼苗测定根、茎、叶中的Na⁺、K⁺离子含量。

6. 离子含量测定：萌发期胁迫处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子用60 mmol/L的NaCl溶液冲洗干净，将种皮、胚、胚乳分离，用等离子质谱测定Na⁺、K⁺离子的含量，实验结果如表1所示。幼苗生长期胁迫处理10 d后，对照幼苗长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株幼苗用60 mmol/LNaCl溶液冲洗干净，将根、茎、叶分离，置105℃烘箱中10 min，然后于80℃下烘48 h，用等离子质谱测定Na⁺、K⁺离子的含量，实验结果如表2所示。

第一，萌动种子中Na⁺、K⁺含量的变化

如表1所示，3个玉米自交系萌动种子中的Na⁺含量都随NaCl浓度的增加而增加。与对照相比，60 mmol/L、140 mmol/L、220 mmol/L NaCl处理后，81162萌动种子中Na⁺含量分别上升2.82、4.02、6.03倍；8723分别上升1.88、4.91、5.94倍、P138分别上升2.97、6.35、9.34倍。由此可见，萌发期81162和8723的Na⁺积累速度小于P138，反映81162和8723的拒Na⁺能力较强，而P138的拒Na⁺能力较弱，在体内聚集了过多的Na⁺，从而造成了对种子萌发的影响。

随着NaCl浓度的增加，3个自交系萌动种子中K⁺含量均呈下降趋势。与对照相比，220 mmol/L NaCl处理后，81162萌动种子中的K⁺含量分别下降34.46%，8723分别下降36.84%，P138分别下降44.31%。由此可见，萌动种子中K⁺离子在P138中的降低幅度大于81162和8723。在胚和种皮中，81162和8723中K⁺的积累量几乎在每个浓度下都大于P138，而在胚乳中没有差异。

表1中：不同小写字母abcdef表示不同盐浓度下0.05水平差异显著，xyz表示品种间0.05水平差异显著；表2、表3相同。

第二，幼苗中Na⁺、K⁺含量的变化

如表2所示，3个自交系玉米幼苗中Na⁺含量均随NaCl浓度的增加而增加。与对照相比，60 mmol/L、140 mmol/L、220mmol/L NaCl处理后，81162的Na⁺含量上升倍数分别为0.56、1.19、2.33；8723分别上升0.30、1.77、3.27；P138分别上升0.37、1.30、1.65。由此可以看出，幼苗生长期81162和8723体内Na⁺积累大于P138，说明81162和8723的耐Na⁺能力较强，而P138的耐Na⁺能力弱。另外，根和茎中81162和8723中Na⁺含量大于P138，而叶中P138中的Na⁺含量大于81162和8723。

随着NaCl浓度的增加，3个玉米自交系幼苗中K⁺含量均呈下降趋势。与对照相比，60 mmol/L、140 mmol/L、220 mmol/L NaCl处理后，81162的K⁺含量分别下降6.71%、18.58%、36.55%；8723分别下降9.33%、25.35%、35.40%；P138分别下降7.06%、28.21%、40.27%。说明81162和8723幼苗体内的K⁺含量下降幅度小于P138。不同玉米自交系根茎叶中K⁺含量下降的幅度也不同。当NaCl浓度增至220mmol/L时， 81162和8723根中K⁺含量的降低幅度大于P138，而茎和叶中K⁺含量的降低幅度小于P138。

Figure 201310203213X100002DEST_PATH_IMAGE004

第三，萌动种子及幼苗中Na⁺/K⁺比值的变化

如表3所示，萌动种子和玉米幼苗各部位K⁺/Na⁺随着NaCl浓度的升高而降低，与对照相比存在显著性差异。81162和8723不管在萌动种子还是在幼苗中的K⁺/Na⁺都高于P138，表明81162和8723通过渗透调节保持较高的K⁺/Na⁺比值，从而增强耐盐性。

Figure 201310203213X100002DEST_PATH_IMAGE006

7.数据处理和分析

数据的处理采用Excel2007软件，所有实验数据统计分析SPSS16.0进行处理，试验结果用平均值±标准偏差(SD)表示，采用Duncan进行差异显著性多重比较，对各处理间的差异显著性进行分析。

从以上实例可以看出，此玉米耐盐种质筛选方法操作简便，能够减少实验工作量，缩短实验时间，提高耐盐种质筛选的效率，确保得到准确可靠的耐盐种质，为玉米耐盐育种奠定了坚实的基础，应用潜力很大。

Claims

1.一种耐盐种质筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）收集材料：收集3个玉米自交系材料；

（2）种子精选与消毒：精选无破损、大小一致的种子，将3个玉米自交系分别用0.5%的次氯酸钠消毒10 min，用蒸馏水冲洗3-5次，用滤纸吸干附着水，得3个自交系玉米消毒种子；

（3）盐胁迫下浸种：将3个玉米自交系消毒种子分别浸泡在0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与220 mmol/L的NaC1溶液中12 h；得3个玉米自交系盐胁迫种子分别进入步骤4与步骤5；0 mmol/L即蒸馏水浸种处理为对照样品；

（4）种子萌发：将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子分别置于直径为12cm的培养皿中，双层滤纸作发芽床，每皿30粒；分别加入0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与220 mmol/L的NaC1溶液，实验设3次重复；培养皿置于培养箱中25℃暗萌发；萌发期间每天补一次15ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子进入步骤6.1测定萌动种子的种皮、胚乳、胚的Na⁺、K⁺离子含量；

（5）幼苗生长：将0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与 220 mmol/L的NaC1溶液各100 mL分别与500 g已灭菌的蛭石搅拌均匀，而后分装于15 cm×13 cm的营养钵中；将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子，分别播在各对应盐浓度的消毒蛭石中，每钵30粒，进行胁迫处理，实验设3次重复；播种后置于植物生长室中培养，生长室的昼夜温度为25±2℃/20±2℃，每天光照12 h，光照强度为600 μmol/(s·m²)，相对湿度60-80%；期间，每隔1 d补加1次50 ml的去离子水，每3 d补加一次对应浓度的NaC1溶液50 ml，胁迫处理10 d后，待对照样品叶片生长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株盐胁迫处理幼苗进入步骤6.2测定幼苗根、茎、叶的Na⁺、K⁺离子含量；

（6）离子含量测定

（7）结果分析与筛选耐盐品种：对步骤6.1测得的萌动种子与步骤6.2测得的盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na⁺、K⁺离子的含量数据，采用Excel2007软件进行数据处理，所有实验数据统计分析SPSS16.0进行处理，试验结果用平均值±标准偏差(SD)表示，采用Duncan进行差异显著性多重比较，对各处理间的差异显著性进行分析；根据萌动种子与盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na⁺、K⁺离子的含量和K⁺/Na⁺比值的变化筛选耐盐品种。