CN102507701A - 基于非损伤微测技术的动态离子流筛选抗旱水稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微观动态离子流检测技术的筛选抗旱水稻的方法，其是利用微观动态离子流检测技术检测水稻根系K+的吸收能力，通过检测PEG6000溶液处理前后幼苗的K+吸收变化筛选出抗旱水稻。本发明能够实现对水稻抗旱性的无损、快速、活体检测、检测时间在10-15min左右，耗时短，检测准确性高，抗旱性幼苗与不抗旱性幼苗净离子流对比差异明显，评价方法简单可靠，为水稻抗旱育种及水稻大田生产提供了直接而快速的筛选工具。

Description

基于非损伤微测技术的动态离子流筛选抗旱水稻的方法

技术领域

本发明涉及抗旱植株的筛选方法，具体地说，涉及一种基于非损伤微测技术的动态离子流筛选抗旱水稻的方法。

背景技术

全球水资源短缺，地下水位持续下降导致全球干旱灾害频繁发生。而我国是农业大国，干旱严重危害我国的农业生产和粮食安全，制约我国的农业发展。据国家防汛抗旱总指挥部发布统计数据2009、2010、2011连续三年受干旱影响损失严重。干旱造成了国民收入的大量损失，严重制约了我国经济社会的发展。因此，寻找或加速培育抗旱作物新品种，有助于稳定和促进我国粮食生产。

水稻作为我国的主要粮食作物之一，播种面积很大，但是随着近些年来干旱灾害的频繁发生育种家也开始关注旱稻育种，而旱稻育种缺少直接而有效的抗旱材料筛选工具，非损伤微测技术作为无损、快速的检测方法用于旱稻的筛选是比较好的直接工具，利用该技术检测不同品种在干旱条件下对K⁺的吸收能力可以快速筛选抗旱水稻品种。

Maria(2008)在研究气孔关闭时候发现，K⁺饥饿引起气孔关闭，导致生理学紊乱，有可能使许多作物在水分胁迫下脱水(Mari′aBenlloch-Gonza′lez，Octavio Arquero，Jose′Mari′a Fournier，DiegoBarranco，Manuel Benlloch.K⁺starvation inhibits water-stress-inducedstomatal closure(钾离子饥饿抑制水分胁迫诱导的气孔关闭).Journalof Plant Physiology，2008，165：623-630.)；由此推断，K⁺可能对植物的耐旱性有所帮助。Gnanasiri(1995)证实了高粱在干旱田间下除了积累K⁺和可溶性糖外Cl^-也对维持细胞的膨压起到了重要作用(Gnanasiri S.Premachandra，Daniel T.Hahn，David Rhodes and RobertJ.J oly.Leaf water relations and solute accumulation in two grainsorghum lines exhibiting contrasting drought tolerance.(两种高粱株系的叶片水势关系和溶质积累表现的不同耐旱性)Journal of ExperimentalBotany 1995，46(12)：1833-1841)；上述研究表明，可溶性小分子物质和无机离子在植物渗透调节中具有重要作用，因此用K⁺的吸收能力来判断植物抗旱能力成为可能。

非损伤微测技术(Non-Invasive Micro-Test Technology，NMT)，是通过微电极和微传感器获取离子和分子的信号，基于Nernst方程和Fick′s第一扩散定律计算离子和分子的浓度和流速的技术，精度达到pmol cm^-2s^-1，该技术是一项新型的无损检测技术，能够以单细胞、细胞层、组织、离体器官为检测对象，来检测离子、分子并且探知其流动速率及其方向，检测时不与被测材料接触，植物不用去除细胞壁，进行数小时、乃至十数小时以上的连续测量，能够得到时时的分子和离子流动的数据，从而判知被测对象生理状况。近几年来许多科学家通过这种技术研究了植物在不同环境下的离分子离子变化情况，取得了较好的成果。

张智猛等(2010)通过研究花生种子萌发期在干旱处理下抗旱性评价指标(芽干重、根干重、生芽率、生根率等)筛选抗旱花生新品种(张智猛等，花生品种芽期抗旱性指标筛选与综合性评价，中国农业科技导报，2010，12(1)：85-91)；刘鹏等(2009)，利用耐寒指数和抗旱指数评价方法筛选玉米抗旱新品种(刘鹏等，玉米品种抗旱性指标筛选的研究，吉林农业科学，2009，34(4)：21-24，34)；王麟等(2009)，利用抗旱指数评价方法筛选抗旱水稻品种(王麟等，黑龙江省抗旱水稻品种(系)的筛选，黑龙江省农业科学，2009，4：26-29)。以上方法不能实现活体生物材料的动态检测，对珍稀材料造成浪费。因此，开发新的筛选抗旱作物的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明旨在为水稻抗旱育种和水稻大田生产提供一种快速的、无损的筛选抗旱水稻的新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种基于非损伤微测技术的动态离子流筛选抗旱水稻的方法，其是利用微观动态离子流检测技术检测水稻根系K⁺的吸收能力，通过检测PEG6000溶液处理前后幼苗的K⁺吸收变化筛选出抗旱水稻。

本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的，待水稻长至1叶1心期，用PEG6000溶液进行处理，利用微观动态离子流检测技术检测处理前后幼苗的K⁺吸收流速和流向，筛选出抗旱水稻。优选地，使用的PEG6000溶液浓度为10-20％，更优选为20％。

前述的方法，测试液中PEG6000溶液浓度为10～20％，优选为20％。

前述的方法，微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0.05～0.15mM。

前述的方法，检测使用的水稻处于1叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖200～500μm的根尖分生区的外表面20～40μm处。

具体地，前述方法包括以下步骤：(1)向微电极中灌入离子灌充液至充满所述电极尖端0.8～1.5cm，再将电极前端吸入相应的测试离子交换剂；(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30min左右，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10～15min；(4)对检测结果进行处理和分析。

其中，步骤(1)所述的灌充液为：80～140mM KCl；步骤(2)所述的校正液为：0.05～0.15mM KCl和0.5～1.5mM KCl；步骤(3)所述的测试缓冲液为：K⁺：0.05～0.15mM KCl、0.05～0.15mM CaCl₂、0.05～0.15mM MgCl₂、0.3～0.6mM NaCl、0.1～0.3mM Na₂SO₄和0.2～0.5mM MES。

前述方法中步骤(1)电极的前端吸入测试离子交换剂的长度为K⁺：100～200μm。

前述方法中校正后电极的能斯特方程计算理想值为K⁺：56～60mV；

前述方法中所述K⁺离子流的流速为40～500pmol.cm^-2.s^-1。

本发明是基于非损伤微测技术，通过对水稻和旱稻的动态K⁺流检测来筛选抗旱水稻品种，实现对水稻抗旱性的无损、快速、活体检测、检测时间在10-15min左右，耗时短，检测准确性高，抗旱性幼苗与不抗旱性幼苗净离子流对比差异明显，评价方法简单可靠，为水稻抗旱育种及水稻大田生产提供了直接而快速的筛选工具。

附图说明

图1为本发明基于非损伤微测技术的动态离子流筛选抗旱水稻的实验过程图。

图2为水稻品种日本晴和巴西旱稻经PEG6000处理前后K⁺动态吸收变化。其中，RBQ：日本晴；RBQ+PEG：日本晴+PEG；BXHD：巴西旱稻；BXHD+PEG：巴西旱稻+PEG。

图3为水稻品种日本晴和巴西旱稻经PEG6000处理前后K⁺净离子流的比较。其中，RBQ：日本晴；RBQ+PEG：日本晴+PEG；BXHD：巴西旱稻；BXHD+PEG：巴西旱稻+PEG。

图4为水稻品种日本晴和巴西旱稻幼苗经20％PEG6000处理3天后的生长情况。

图5所示为利用微电极检测时，电极距离根尖的位置。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。其中水稻品种日本晴由中国农业大学农学院惠赠，巴西旱稻的种子由北京农业信息技术研究中心保存。

实施例

1.实验方法

实验材料及培养条件：为水稻品种日本晴和巴西旱稻，种子经过次氯酸钠消毒蒸馏水清洗后，加入适当水浸种2小时，置于地垫湿润滤纸的培养皿上25℃光照培养箱内萌发，发芽后加入hogland营养液培养，生长至1叶1心期时开始加入PEG6000处理，测试处理前后的离子流。

2.实验仪器及耗材：

离子流检测用非损伤微测系统(BIO-001B，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，USA)，系统软件imFlux，微电极采用尖端直径为2-4μm的玻璃微电极。

3.实验试剂及溶液：

(1)液态离子交换剂包括：

K⁺：货号Potassium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich，Louis，MO 63103，USA；

(2)测试缓冲液成分：

K⁺离子：0.1mM KCl、0.1mM CaCl₂、0.1mM MgCl₂、0.5mM NaCl、0.2mM Na₂SO₄、0.3mM MES

(3)电极灌充液：

K⁺：100mM KCl

(4)校正液：(浓度相差十倍也是必须的)

K⁺：0.1mM和1mM KCl

4.实验内容及方法：

实验过程如图1所示。

从电极末端灌入1cm左右的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，前端吸入适当长度(K⁺：150-200μm)离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正，其能斯特理想值是：55-60mV。

测试前将材料在相应的测试液中平衡30-50min。然后在距离水稻根尖分生区(距离根尖300μm左右)外表面30μm的地方振动检测(图5)，每个样品检测10-15min。

5.数据处理

离子流处理基于Fick′s扩散定律，并通过在线软件MageFlux-3DIon Flux Plotting System(http://www.xuyue.net/mageflux/)计算得出。由大于3次独立实验所得到的数据做统计分析，利用Excel2003分析作图。

6.实验结果评价

实验结果如图2和图3所示。

干旱敏感型水稻日本晴幼苗未处理前对K⁺吸收幅度很大，离子吸收平均流速达-74.86pmol cm^-2s^-1；加入20％PEG6000处理30min之后K⁺吸收平均流速幅度降低至-29.69pmol cm^-2s^-1。干旱产生的渗透胁迫引起了日本晴根系对K⁺吸收幅度的迅速减小，细胞内的K⁺含量降低，造成细胞膨压和渗透势的改变，最终水稻枯萎死亡(图4)。

干旱耐受型的巴西旱稻幼苗未处理前对K+吸收幅度很小，离子吸收平均流速为-15.52pmol cm-2s-1；加入20％PEG6000处理30min之后K+吸收平均流速幅度迅速升高至-79.21pmol cm-2s-1，可作为抗旱水稻评价指标。短时间内(30min)PEG6000处理后巴西旱稻对K+的吸收幅度较处理前大幅增多，这是由于巴西旱稻能够通过吸收K+稳定因干旱造成的渗透势变化，保证细胞的膨压，维持正常代谢活动，从而提高了抗旱性。

综上，干旱敏感型水稻在干旱条件下细胞内K⁺流失，细胞膨压下降，体现了对干旱的敏感性；而干旱耐受型巴西旱稻能够通过吸收K⁺维持细胞的渗透平衡，保证细胞的膨压，表现了很好的抗旱性，因此利用干旱条件下细胞对K⁺的吸收能力作为水稻抗旱植株的筛选是一种有效迅速而有效的手段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于微观动态离子流检测技术筛选抗旱水稻的方法，其特征在于，利用微观动态离子流检测技术检测水稻根系K⁺的吸收能力，通过检测PEG6000溶液处理前后幼苗的K⁺吸收变化筛选出抗旱水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待水稻长至1叶1心期，用PEG6000溶液进行处理，利用微观动态离子流检测技术检测处理前后幼苗的K⁺吸收流速和流向，筛选出抗旱水稻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测试液中PEG6000溶液浓度为10～20％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，测试液中PEG6000溶液浓度为20％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0.05～0.15mM。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测使用的水稻处于1叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖200～500μm的根尖分生区的外表面20～40μm处。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向微电极中灌入离子灌充液至充满所述电极尖端0.8～1.5cm，再将电极前端吸入相应的测试离子交换剂；

(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；

(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10～15min；

(4)对检测结果进行处理和分析；

其中，步骤(1)所述的灌充液为：80～140mM KCl；

步骤(2)所述的校正液为：0.05～0.15mM KCl和0.5～1.5mM KCl；

步骤(3)所述的测试缓冲液为：K⁺：0.05～0.15mM KCl、0.05～0.15mM CaCl₂、0.05～0.15mM MgCl₂、0.3～0.6mM NaCl、0.1～0.3mM Na₂SO₄和0.2～0.5mM MES。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)电极的前端吸入测试离子交换剂的长度为K⁺：100～200μm。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，校正后电极的能斯特方程计算理想值为K⁺：56～60mV；

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述K⁺离子流的流速为40～500pmol.cm^-2.s^-1。

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