CN102511220A - 基于微观动态离子流检测技术的测定小麦种子活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微观动态离子流检测技术的测定小麦种子活力的方法，其是利用微观动态离子流检测技术对连续发芽期的小麦种子做动态K⁺流检测，根据小麦种子的净K⁺流速及方向来测定种子活力。本发明能够实现对小麦种子活力的无损、活体、快速检测，检测一个样本耗时少至几分钟多至十几分钟，检测准确性高，耗时短，活力强的小麦种子K⁺外流作用弱；而活力弱的小麦种子K⁺外流作用强，呈现流失状态，评价方法简单可靠，为小麦育种、小麦种子储藏、作物田间生产提供了一种无损的、快速的、检测后的生物材料还能继续生长的小麦种子活力检测新方法。

Description

基于微观动态离子流检测技术的测定小麦种子活力的方法

技术领域

本发明涉及种子活力的测定方法，具体地说，涉及一种基于微观动态离子流检测技术的测定小麦种子活力的方法。

背景技术

种子活力是种子质量的重要指标，1980年AOSA定义了种子活力：广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗和成长为幼苗的潜在能力的总称。ISTA将大豆种子加速老化试验和豌豆种子浸出液电导率的标准化流程列为国际种子活力检测标准。当今的种子活力检测方法包括：生理测定法、加速老化法、电导率测定法，生化测定法等。

微观动态离子流检测技术是一种在不破坏被测试材料的前提下获得测试材料膜内外离子或分子流动信息的一项新技术，该项技术可以对测试材料的不同部位以及同一部位连续时间测量，已经在植物抗盐研究、植物病理研究、植物耐重金属等多种植物研究领域得到应用。Shabala(2000)利用微观动态离子流检测技术研究了小麦种子萌发期间的营养吸收，发现了K⁺在小麦种子的不同部位都处于外流状态，证实了K⁺的外是由于细胞膜上K⁺通道作用的结果，而非种皮渗出(Shabala，S.；Newman，I.；Wilson，S.；Clark，R.Nutrient uptake patternsover the surface of germinating wheat seeds(小麦种子萌发表面的离子吸收图谱)，Australian Journal of Plant Physiology，2000，27(2)，89-97)，为小麦萌发生理生化机理研究拓展了新视野，另外在植物抗盐性研究，抗重金属胁迫研究领域该方法也发挥了重要作用。

张辉等(1996)利用电导率测定法测定水稻种子活力(张辉，王辉宪，水稻种子浸泡液外渗离子与种子发芽率的相关性研究，吉首大学学报，1996，17(2)：80-83)，杜清福等(2007)用到了标准发芽法、电导率测定法、TTC定量法、丙二醛含量测定法测定玉米种子活力(杜清福等，不同类型玉米种子活力检测适宜方法的研究，玉米科学，2007，15(6)：122-127)。

现有的种子活力测定方法，如生理测定法、加速老化法、电导率测定法、生化测定法都对种子构成了严重的损伤，甚至是破坏了种子结构，使其完全失去发芽能力，这些种子活力测定方法对珍贵的小麦种子、数量少的小麦种子来说损失相当大，而且且无法实现种子活力的动态检测。因此，找到一种无损的、快速的、检测后的材料还能继续生长的小麦种子活力检测方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在为小麦育种、小麦种子储藏、作物田间生产提供一种无损的、快速的、检测后的生物材料还能继续生长的小麦种子活力检测新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种基于微观动态离子流检测技术测定小麦种子活力的方法，其是利用微观动态离子流检测技术对连续发芽期的小麦种子做动态K⁺流检测，根据小麦种子的净K⁺流速及方向来测定种子活力。其中，所述小麦种子萌发后长出胚根。

本发明能够实现对小麦种子活力的无损、活体、快速检测，检测一个样本耗时少至几分钟多至十几分钟，检测准确性高，耗时短，活力强的小麦种子K⁺外流作用弱；而活力弱的小麦种子K⁺外流作用强，呈现流失状态，评价方法简单可靠。

前述的方法，所述微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0.05～0.15mM。

前述的方法，检测使用的水稻处于1叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖100～500μm的根尖分生区的外表面10～40μm处。

具体地，前述方法包括以下步骤：(1)向微电极中灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1～1.5cm，再将电极的前端吸入相应测试离子交换剂；(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30min左右，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10～16min；(4)对检测结果进行处理和分析。

其中，步骤(1)所述的灌充液为：80～140mM KCl。

步骤(2)所述的校正液为0.05～0.15mM KCl和0.5～1.5mM KCl。

步骤(3)所述的测试缓冲液为：0.05～0.15mM KCl、0.05～0.15mMCaCl₂、0.05～0.15mM MgCl₂、0.3～0.6mM NaCl、0.1～0.3mM Na₂SO₄和0.2～0.5mM MES。

前述方法中步骤(1)电极的前端吸入测试离子交换剂的长度为K⁺：100～200μm。

前述方法中校正后电极的能斯特方程计算理想值为K⁺：56～60mV。

前述方法中所述K⁺离子流的流速为：萌发32～40小时K⁺离子内流速度为-4.76～-274.99pmol.cm^-2.s^-1。

本发明能够实现对小麦种子活力的无损、活体、快速检测，检测一个样本耗时少至几分钟多至十几分钟，检测准确性高，耗时短，活力强的小麦种子K⁺外流作用弱；而活力弱的小麦种子K⁺外流作用强，呈现流失状态，评价方法简单可靠。

本发明是利用微观动态离子流检测技术检测不同发芽期的小麦胚根部位的K⁺流，比较活力强的和活力弱的小麦种子对K⁺保持能力来判断小麦种子的活力，为小麦育种、小麦种子储藏、作物田间生产提供了一种无损的、快速的、检测后的生物材料还能继续生长的小麦种子活力检测新方法。

附图说明

图1为本发明基于微观动态离子流检测技术测定小麦种子活力的实验过程图。

图2为不同活力的小麦种子萌发期间K⁺流动态变化。

图3为不同活力的小麦种子净K⁺流速。

图4所示为利用微电极检测时，电极距离根尖的位置。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。其中，小麦种子选用中国春(Triticumaestivum)，购自国家农作物种质保存中心。

实施例

1.实验方法

实验材料及培养条件：小麦种子选用中国春(Triticum aestivum)为试验材料，液体培养基参照Hogland营养液配方，挑选外型均一、饱满的小麦种子，自来水清洗后用75％乙醇浸泡30秒，然后蒸馏水清洗3-4次，3％次氯酸钠浸泡10分钟，后用蒸馏水清洗3-4次，将小麦种子播种于底垫双层滤纸的培养皿内，滤纸要充分润湿，封盖，置于25±1℃的培养箱中萌发，每4小时测一次离子流，每次10-15min。

2.实验仪器及耗材：

离子流检测用非损伤微测系统(BIO-001B，Younger USA Sci.&Tech.Corp.，USA)，系统软件imFlux，微电极采用尖端直径为2-4μm的玻璃微电极。

3.实验试剂及溶液：

(1)液态离子交换剂包括：

K⁺：货号Potassium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich，Louis，MO 63103，USA；

(2)测试缓冲液成分：

K⁺离子：0.1mM KCl、0.1mM CaCl₂、0.1mM MgCl₂、0.5mM NaCl、0.2mM Na₂SO₄、0.3mM MES

(3)电极灌充液：(这个是固定的浓度，改变后会有影响)

K⁺：100mM KCl

(4)校正液：

K⁺离子：0.1mM和1mM KCl

4.实验内容及方法：

实验过程如图1所示。

从电极末端灌入1cm左右的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，前端吸入适当长度180-200μm的离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正，能斯特(Nerst)方程计算理想值是27-30mV。

测试前材料在相应的测试液中平衡30-50min。然后在距离小麦种子胚根区表面30μm的地方振动检测(图4)，每个样品检测10-15min。

5.数据处理

离子流处理基于Fick扩散定律，并通过在线软件MageFlux-3DIon Flux Plotting System(http://www.xuyue.net/mageflux/)计算得出。由大于3次独立实验所得到的数据做统计分析，利用Excel2003分析作图。

6.实验结果

结果(图2和图3)表明在小麦种子没有长出根之前，K⁺一直处于外流状态，在小麦种子吸收水分4小时后，小麦种子K⁺开始外流，活力弱的小麦种子K⁺外流明显，而活力强的小麦种子K⁺外流幅度偏低；当小麦种子吸收水分到8小时后活力弱的小麦种子外流幅度达到最终大值，活力强的小麦种子也达到最大值，随后K⁺外流幅度都开始变小，但是活力强的小麦种子K⁺一直外流幅度都较活力弱的小麦种子小，36小时后活力强的小麦种子先长出根尖，开始主动吸收K⁺，而活力弱的小麦离子流还处于低水平的外流状态，活力强的小麦种子其K⁺外流作用小，而活力弱的小麦种子其K⁺外流作用很大，说明了活力强的小麦种子细胞膜功能在萌发初期就恢复的很快，而活力弱的小麦种子细胞膜功能恢复慢，造成大量K⁺渗漏，营养流失，最终表现了弱的小麦种子活力。

因此，通过表1可以看出不同时间点的离子流结果都可以作为判断小麦种子活力强弱的依据，尤其是在4h、8h和12h，活力弱的小麦种子K⁺流失较活力强的小麦种子大很多，因此可以通过这几个时间点作为种子萌发活力强弱的早期判断；在40h时间点上活力强的小麦种子已经生根，且K⁺开始内流，活力弱的小麦种子K⁺仍然处于外流状态，此时间点也可以作为判断依据。

表1不同时间点活力不同的小麦种子K⁺净流速

注：数据单位为pmol/cm²·s

K⁺作为主要的营养离子，也起到渗透调节作用，有关这方面的报道不多，小麦种子在成熟过程中累积了大量的K⁺，这些K⁺作为小麦种子萌发的主要的营养物质在渗透调节和代谢过程中发挥着重要的作用，本方法通过检测活力强的小麦种子和活力弱的小麦种子发现了前者具有很强的K⁺保持能力，而后者K⁺大量渗漏，造成营养流失，根本原因是细胞膜活力的下降，因此，通过K⁺流测量方法判断小麦种子活力是一种直接而有效的方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种基于微观动态离子流检测技术测定小麦种子活力的方法，其特征在于，利用微观动态离子流检测技术对连续发芽期的小麦种子做动态K⁺流检测，根据小麦种子的净K⁺流速及方向来测定种子活力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小麦种子萌发后长出胚根。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0.05～0.15mM。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，检测使用的水稻处于1叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖100～500μm的根尖分生区的外表面10～40μm处。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向微电极中灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1～1.5cm，再将电极的前端吸入相应测试离子交换剂；

(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；

(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10～16min；

(4)对检测结果进行处理和分析；

其中，步骤(1)所述的灌充液为：80～140mM KCl；

步骤(2)所述的校正液为0.05～0.15mM KCl和0.5～1.5mM KCl；

步骤(3)所述的测试缓冲液为：0.05～0.15mM KCl、0.05～0.15mMCaCl₂、0.05～0.15mM MgCl₂、0.3～0.6mM NaCl、0.1～0.3mM Na₂SO₄和0.2～0.5mM MES。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)电极的前端吸入测试离子交换剂的长度为K⁺：100～200μm。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，校正后电极的能斯特方程计算理想值为K⁺：56～60mV。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述K⁺离子流的流速为：萌发32～40小时K⁺离子内流速度为-4.76～-274.99pmol.cm^-2.s^-1。

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