CN103460852B - 快速测定烟草种子生活力的方法 - Google Patents

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Abstract

快速测定烟草种子生活力的方法，该方法是将固定数量的烟草种子固定在食用面粉制成的面块平面上，采用冷冻切片机成批将种子切开，用水洗出切开后的种子后，置于0.01%~0.1%碘硝基四唑紫溶液中，在黑暗环境中染色2~5小时后，在体视显微镜下观察鉴定，胚和胚乳全部染成红色的种子占检测种子总数的百分率即为烟草种子生活力。本发明将烟草种子生活力的测定时间由68~70小时大幅缩短至2.2~5.2小时，检测速度快、结果准确可靠，并且剖切种子的方法劳动强度低，工作效率高，大大缩短工作时间。本发明应用前景良好。

Description

快速测定烟草种子生活力的方法
技术领域
本发明属于农作物的种子检测技术领域，涉及一种快速测定烟草种子生活力的方法。
背景技术
种子生活力是指种子潜在的发芽能力或是种胚所具有的生命力，是预期具有长成正常幼苗的潜在能力，通常用一批种子中具有生命力的种子数占种子总数的百分率表示。种子生活力测定在作物育种、种子生产、种子加工、种子收购、种子贮藏、种子调运等工作中具有重要意义。
常用的种子生活力检测方法是TTC法，TTC为2,3,5-三苯基氯化四氮唑的英文缩写。2003年，国际种子检验协会详细制定了种子活力TTC测定标准方法，该方法是采用TTC对种子内部活组织进行染色，通过鉴定染色情况判断种子生活力，该方法一般包括种子预湿处理、种子纵切、种子染色及鉴定4个步骤。目前，该方法是《国际种子检验规程》中用于测定发芽缓慢或休眠种子的生活力、快速判断种子潜在发芽能力的一种有效方法，具有经济、准确等特点，应用范围广泛。
采用TTC法测定烟草种子生活力有以下两个方面的限制因素：一方面，采用TTC对烟草种子染色全过程约需70小时，难以满足烟草种子生活力快速测定的需要；另一方面，由于烟草种子极小，千粒仅重70~80 mg，染色前需在体视显微镜下将种子逐粒切开，劳动强度大、工作时间长，且极易造成视觉疲劳和误操作。
碘硝基四唑紫，化学名：2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基氯化四唑，英文缩写INT，分子式：C19H13N5O2ICl。是一种新型的人工受氢体，被广泛用于土壤活性分析、水体微生物活性分析、乳酸脱氢酶活性分析、脯氨酸脱氢酶分析等领域。
发明内容
针对现有技术中，采用TTC法检测烟草种子的生活力，存在染色时间慢长、烟草种子切开难度大的问题，本发明提供一种快速测定烟草种子生活力的方法，该方法采用碘硝基四唑紫对切开的烟草种子染色，具体做法是：随机取同一批次固定数量的烟草种子，将种子切开，每粒种子取其中的一半放入浓度为0.01%~0.1%的碘硝基四唑紫溶液中，在黑暗条件下浸泡染色2~5小时，取出后，在体视显微镜下进行观察鉴定，胚和胚乳全部染成红色的种子为有生活力的种子，染色异常或不染色的为无生活力的种子，有生活力的种子占检测种子总数的百分率即为该批次烟草种子生活力。
上述方法中，将种子切开的方法是将烟草种子单层、均匀固定在食用面粉制成的面块平面上进行平行剖切，将种子成批切开，具体包括以下步骤：
（1）将5 g可溶性淀粉与5 g普通面粉混合均匀，加入少许水搅拌成均匀团状，将面团在桌面用平板压成厚度为0.3cm的块状，用刀片将面块切成与冷冻切片机冷台支架表面大小一致的面块；
（2）随机选取同一批次固定数量烟草种子，单层、均匀铺撒于面块表面上，用平板把种子完全压入面块；
（3）将面块底面贴在冷冻切片机冷台的支架上，将冷台温度设置为-15℃进行冷冻，当种子表面出现白霜后，操作冷冻切片机，从与面块平面平行方向将面块上的种子整体切开，清除从面块上切落的部分，保留粘在面块上的半粒种子，关闭冷却装置；
（4）待面块解冻后从冷台上取下，放入盛有100ml水的烧杯中，轻轻搅拌使面块充分溶解，用纱布过滤，得到切开后的种子，这些种子在染色工作中备用。
上述采用碘硝基四唑紫对切开的烟草种子染色并检测烟草种子生活力的新方法，我们称之为INT法。
相对于现有技术本发明具有如下优点：
（1）TTC法测定烟草种子生活力，种子预湿处理一般需24 h，染色时间一般42~44 h。本发明采用INT对烟草种子进行染色，反应速度快，可省略种子预湿处理，染色时间缩短至2~5 h，大大缩短了种子生活力测定时间。
（2）将待测种子固定在面块平面上，可实现一次性成批切开，切开时间由2 h大幅减少至0.2 h，大大降低了劳动强度。
（3）本发明简化了种子生活力测定程序，检测结果准确可靠，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1
将5 g可溶性淀粉与5 g普通面粉混合均匀，加入少许水搅拌成均匀团状；将面团放在桌面上，用平板压成厚度为0.3cm的块状，然后用刀片切成与冷冻切片机冷台支架表面大小一致的面块；随机选取同批次的500粒烟草种子，单层、均匀铺撒于面块表面上，用平板把种子完全压入面块；将面块底面贴在冷冻切片机冷台的支架上，将冷台温度设置为-15℃进行冷冻；当种子表面出现白霜后，操作冷冻切片机，从平行面块平面的方向将面块上的种子整体切开，清除从面块上切落的部分，保留粘在面块上的半粒种子，关闭冷却装置；待面块解冻后从冷台上取下，放入盛有100ml水的烧杯中，轻轻搅拌使面块充分溶解，用纱布过滤得到切开后的种子。
每次从切开的种子中数出100粒进行实验，将100粒切开的种子放入盛有浓度为0.1%的 INT溶液的小烧杯中，在黑暗条件下染色2 h；将种子取出在体视显微镜下进行观察鉴定，胚和胚乳全部染成红色的种子为有生命力的种子，胚或胚乳染色异常或不染色的种子为无生命力种子。
以100粒切开的种子为固定数，重复上述染色实验4次，检测每一次种子的生活力，统计4次重复试验的平均值，求得该批次烟草种子生活力。
实施例2
重复实施例1，有以下不同：将碘硝基四唑紫，简称INT，浓度设为0.03%，染色时间为4 h。
实施例3
重复实施例1，有以下不同：将碘硝基四唑紫，简称INT，浓度设为0.01%，染色时间为5 h。
应用实施例1
以MS云烟87种子为试验材料，按照实施例1进行测定。
应用实施例2
以MS云烟87种子为试验材料，按照实施例2进行测定。
应用实施例3
以MS云烟87种子为试验材料，按照实施例3进行测定。
应用实施例4
以云烟97种子为试验材料，按照实施例1进行测定。
应用实施例5
以云烟97种子为试验材料，按照实施例2进行测定。
应用实施例6
以云烟97种子为试验材料，按照实施例3进行测定。
为进一步验证本发明的技术效果，设置如下2个对照：
对照1
按国际种子检验协会描述的四唑测定法，简称TTC法，将400粒MS云烟87种子预湿（浸种）24 h后，在显微镜下用解剖刀将种子从中间逐粒纵切。然后将切开后种子置于含有0.1%  TTC溶液的小烧杯中于黑暗条件下进行，染色后每隔1h观察一次，凡是胚和胚乳全部染成红色的种子为有生命力种子，凡是胚或胚乳染色异常或完全不染色的种子为无生命力种子，具有生命力的种子数占种子总数的百分率即为种子的生活力。
4次重复，每重复随机取100粒种子计算生活力。
对照2
重复对照1， 有以下不同：试验材料为云烟97种子。
应用实施例1~6、对照1~2的试验结果见表1、表2。
表1  MS云烟87种子不同生活力测定方法的染色时间及效果比较
注：总时间指种子预湿、切种子及种子染色时间之和。生活力是4次重复的平均值±标准差。
表2  云烟97种子不同生活力测定方法的染色时间及效果比较
注：总时间指种子预湿、切种子及种子染色时间之和。生活力是4次重复的平均值±标准差。
结果表明，将烟草种子逐粒切开与将烟草种子固定在面块上，采用冷冻切片机成批切开相比，可以大幅降低劳动强度，并将种子切开的时间由2 h减少到0.2 h（表1、表2）。
与对照组的TTC法相比， 本发明中的INT法，染色速率较快，可以使染色时间由42~44 h大幅缩短到2~5 h，其中，实施例1，实施例4中采用0.1%的 INT染色速率最快，染色时间只需2 h。
从生活力测定结果看，采用INT法的应用实施例1~6与采用TTC法的对照1~2的测定结果无明显差异。
综合分析表明：本发明简化了种子生活力测定程序，检测速度快、结果准确可靠，并且在剖切种子时，劳动强度较低。该方法具有良好的应用前景。

Claims (1)

1.快速测定烟草种子生活力的方法，其特征在于：该方法采用碘硝基四唑紫对切开的烟草种子染色；具体方法是：随机取同一批次固定数量的烟草种子，将种子切开，每粒种子取其中的一半放入浓度为0.01%~0.1%碘硝基四唑紫溶液中，在黑暗条件下浸泡染色2~5小时，取出后，在体视显微镜下进行观察鉴定，胚和胚乳全部染成红色的种子为有生活力的种子，染色异常或不染色的为无生活力种子，有生活力的种子占检测种子总数的百分率即为该批次烟草种子生活力；
将种子切开的方法是将烟草种子固定在食用面粉制成的面块平面上进行平行剖切，将种子成批切开，具体包括以下步骤：
（1）将5 g可溶性淀粉与5 g普通面粉混合均匀，加入少许水搅拌成均匀团状，将面团在桌面用平板压成厚度为0.3cm的块状，用刀片将面块切成与冷冻切片机冷台支架表面大小一致的面块；
（2）随机选取同一批次固定数量烟草种子，单层、均匀铺撒于面块表面上，用平板把种子完全压入面块；
（3）将面块底面贴在冷冻切片机冷台的支架上，将冷台温度设置为-15℃进行冷冻，当种子表面出现白霜后，操作冷冻切片机，从与面块平面平行方向将面块上的种子整体切开，清除从面块上切落的部分，保留粘在面块上的半粒种子，关闭冷却装置；
（4）待面块解冻后从冷台上取下，放入盛有100ml水的烧杯中，轻轻搅拌使面块充分溶解，用纱布过滤得到切开后的种子，这些种子在染色工作中备用。
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