CN104686011A

CN104686011A - 一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法

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Publication number: CN104686011A
Application number: CN201510122890.8A
Authority: CN
Inventors: 孟淑春; 宋顺华; 余振宙; 马连平; 占梦丹; 邢宝田
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: CN104686011B

Abstract

本发明属于种子发芽能力的测定领域，提供一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法，该染色方法将茄子种子于TTC染色液中进行染色处理。所述TTC染色液中，四唑的百分浓度0.1％-1.5％；所述TTC染色液中还包括缓冲液。本发明以早熟京茄1号种子为材料，采用TTC法测定茄子种子生活力的适宜方法，快速预测茄子种子最大发芽潜力，探索茄子种子生活力四唑测定值与发芽率之间的数量关系，以验证评价TTC法用于早熟京茄1号种子生活力预测的可行性，为茄子种子生产和销售提供参考依据；本发明茄子的种子由人工去除种皮后再染色，并选用了适宜的染色条件，如浸种温度、浸种时间、染色液浓度、染色温度、染色时间等，这些参数协同作用，共同提高染色效果。

Description

一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法

技术领域

本发明属于种子发芽能力的测定领域，特别涉及一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法，该染色方法将茄子种子于TTC染色液中进行染色处理。

背景技术

种子的生活力是种子质量的重要指标，是种用价值的主要组成部分，它与种子田间出苗率密切相关，是反映种子生命过程中十分重要的特性之一。种子生活力测定也是快速鉴定种子发芽能力的一种间接方法，准确的生活力测定方法能够真实反映种子的发芽能力和最大发芽潜力，尤其对一些休眠期长的种子更为适用。由于采用常规的发芽试验来测定发芽力需要的时间较长，而种子寿命长短各异，为了确定种子是否能用于播种及确定播种量，有必要进行种子生活力的高效测定。因此，研究不同种子生活力适宜的测定方法就具有重要意义(史周华和张雪飞，2009)。种子生活力测定是国内外农作物生产上非常重视和关注的内容之一。种子生活力的快速测定法主要有四唑(2,3,5-氯化三苯基四氮唑；2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法，溴麝香草酚兰(BTB)法和紫外荧光法等，其中以TTC染色法应用最广。其原理为有生活力的种子胚细胞含有脱氢酶，具有脱氢还原作用，被种子所吸收的无色TTC接受了活种子呼吸过程中脱氢酶产生的氢，而变成还原态的红色稳定不扩散物质，即不溶于水的三苯基甲腙(TTF)，而无生活力的种子则无此反应，故无染色出现，由此可按胚组织的染色情况区分有生活力的种子和无生活力的种子。

TTC测定于1942年由德国Socaled Hoheneim学校的H.Lakon教授发明，第二次世界大战期间传入美国。随着世界TTC测定技术的发展，国际种子检验协会(ISTA)于1950年成立TTC测定技术委员会，致力于世界TTC测定技术的发展。1953年爱尔兰都伯林ISTA世界大会第一次把TTC测定列入《国际种子检验规程》(International Rules for Seed Testing)，并且不断扩大适用种子种类和适用范围。1996年《国际种子检验规程》(International Rules for Seed Testing)已列入农业、园艺和林木的部分种子种类和应用范围内各类种子的鉴定标准(闫富英，2005)，但迄今为止工作比较集中于木本植物及麦类、豆类、玉米、棉花等大田农业种子。针对蔬菜，除番茄属作物外，其他蔬菜种子尚未列入《国际种子检验规程》(International Rules for Seed Testing)。TTC测定技术在我国农林生产上尚未普遍应用，相关研究和报道极为匮乏。我国的《农作物种子检验规程》和《国际种子检验规程》中均未对茄子种子的TTC染色进行详细描述。综合现有的各种有关资料，农作物种子生活力相关研究较多，但也只是局限于水稻(盛海平等，2000)，小麦(王辉，1999)，玉米(王丽红，2012)等粮食作物。蔬菜种子生活力测定方法的研究极少，仅在番茄(虞华丽等，2007)、苦瓜(曾正明等，2001)、冬瓜(黄亚军等，1996)等方面有报道。由于四唑染色法测定茄子种子生活力的试验前人涉及较少，目前为止茄子种子生活力的具体鉴定标准和茄子种子四唑染色图谱尚未见报道。

茄子(Solanum melongena L.)起源于东南亚的印度、缅甸及邻近的热带地区，古称酪酥、昆仑瓜等。它产量高、适应性强，结果期长，在全世界都有分布，以亚洲面积最大(杨建国等，2013)。我国是世界上最大的茄子生产国(申爱民，2007)，茄子栽培面积达73.67万hm2，占世界总面积的49.16％(徐长城等，2009)。茄子种植区域广，种子用量大，但是休眠现象比较普遍(马崇坚，2005)。

因此，目前的科研和实践中，如何研究出一种快速测定茄子种子的生活力的染色方法，确定茄子种子的最大发芽潜力，评定种子质量，为种子生产和销售提供参考根据，成为当前休眠茄子种急需解决的主要问题。

发明内容

本发明提供一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法，将茄子种子于TTC染色液中进行染色处理。

本发明是通过以下技术方案实现的：

该染色方法将茄子种子于TTC染色液中进行染色处理；

进一步地，所述TTC染色液中，四唑的百分浓度0.1％-1.5％，优选为0.2％或1％；

进一步地，所述TTC染色液中还包括缓冲液；

所述缓冲液包括：

溶液I：浓度为5-15g/L，优选为9.078g/L的磷酸二氢钾溶液；

溶液II：浓度为5-15g/L，优选为9.472g/L的磷酸氢二钠溶液，或浓度为5-15g/L，优选为11.876g/L二水合磷酸氢二钾溶液；

所述溶液I与溶液II的体积比为1：(1-4)，优选为1：1.5；

进一步地，该染色方法包括以下步骤：

浸种步骤：将茄子种子进行浸泡处理，得到浸泡后的种子；

染色步骤：将所述浸泡后的种子去皮处理后，再进行染色处理，得到染色后的种子；

进一步地，所述浸种步骤中，所述浸泡处理的时间为3-20小时，优选为4小时或18小时，温度为15-40℃，优选为20℃或30℃；

进一步地，所述染色步骤中，所述去皮处理的速度为50-85分钟/100粒种子，优选54分钟/100粒种子或57分钟/100粒种子；进一步地，所述染色步骤中，所述染色处理的时间为15-40小时，优选为18小时或36小时，温度为25-40℃，优选为30℃或35℃；

进一步地，所述染色步骤中，所述染色处理在避光条件下进行。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明以早熟京茄1号种子为材料，采用TTC法测定茄子种子生活力的适宜方法，快速预测茄子种子最大发芽潜力，探索茄子种子生活力四唑测定值与发芽率之间的数量关系，以验证评价TTC法用于早熟京茄1号种子生活力预测的可行性，为茄子种子生产和销售提供参考依据。

2、本发明中，茄子的种子由人工去除种皮后再染色，并选用了适宜的染色条件，有利于加强茄子种子的染色效果。目前关于TTC法测定种子的生活力的研究中，在染色前的准备阶段，《国际种子检验规程》(International Rules forSeed Testing)中规范了茄科番茄属的番茄种子需要在将种子纵切为两半，观察切面染色情况；而茄子种子较小，种皮表面光滑，不易切开。本发明中，种子经快速地人工剥皮染色之后，纵切较易操作，有利于在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，以区分种子胚各部分的着色效果，辨别种子的生活力。

3、本发明中，选用了适宜的染色条件，如浸种温度、浸种时间、染色液浓度、染色温度、染色时间等，这些参数协同作用，共同提高了染色效果。不同作物活种子中的脱氢酶含量不同，活性不同，因而需要的染色条件也不同。由于TTC测定法的原理是：利用种子所吸收的无色TTC，接受了有生活力的种子呼吸过程中胚细胞里含有的脱氢酶产生的氢，而变成还原态的红色稳定不溶于水的三苯基甲腙(TTF)；因此，可以按胚组织的染色情况区分有生活力的种子和无生活力的种子。

附图说明

图1为试验例中处理组合2的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图2为试验例中处理组合3的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图3为试验例中处理组合5的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图4为试验例中处理组合6的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图5为试验例中处理组合8的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图6为试验例中处理组合9的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图7为试验例中处理组合11的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图8为试验例中处理组合12的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图9为试验例中处理组合14的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图10为试验例中处理组合15的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图11为试验例中处理组合17的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图12为试验例中处理组合18的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图13为试验例中处理组合20的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图14为试验例中处理组合21的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图15为试验例中处理组合23的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

图16为试验例中处理组合24的种子染色后纵切，在体式显微镜下切面的染色效果的照片。

具体实施方式

一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法，包括以下步骤：

(1)TTC染色液配制：

①磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取5-15g(示例性地，可以为5g、8g、10g、12g、15g等中任意或任意两者之间的范围，优选为9.078g)的KH₂PO₄(磷酸二氢钾)溶解于1000mL蒸馏水中；

溶液Ⅱ：称取5-15g(示例性地，可以为5g、8g、10g、12g、15g等中任意或任意两者之间的范围，优选为9.472g)的Na₂HPO₄(磷酸氢二钠)溶解于1000mL蒸馏水中；或5-15g(示例性地，可以为5g、8g、10g、12g、15g等中任意或任意两者之间的范围，优选为11.876g)的Na₂HPO₄·2H₂O(二水合磷酸氢二钠)溶解于1000mL蒸馏水中；

之后，取溶液Ⅰ和溶液Ⅱ按体积比为1：(1-4)(示例性地，可以为1：1、1：2、1：3、1：4等中任意或任意两者之间的范围，优选为1：1.5)，混合即得到磷酸缓冲液；

②TTC染色液配制：

TTC染色液是由四唑溶于上述磷酸缓冲液中而配制得到，TTC染色液中四唑的百分浓度为0.1％-1.5％(示例性地，可以为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.2％、1.5％等中任意或任意两者之间的范围，优选为0.2％或1％)；

例如：1％浓度的TTC染色液：称取1g四唑粉剂溶解于100mL的上述磷酸缓冲液中即可得到；

0.2％浓度的TTC染色液：按照体积量取1份配好的1％浓度TTC染色液加入4份上述磷酸缓冲液混合均匀可得；

上述四唑(2,3,5-Triphenytetrazolium Chloride)粉剂由日本东京化成工业株式会社(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO.,LTD.)生产。

(2)浸种：将早熟京茄1号茄子种子(2014年9月新采收，购自北京京研益农科技发展中心)经净度分析之后，于温度为15-40℃(示例性地，可以为15℃、25℃、28℃、35℃、40℃等中任意或任意两者之间的范围，优选为20℃或30℃)，进行于蒸馏水中浸泡处理3-20小时(示例性地，可以为3小时、5小时、8小时、10小时、15小时、20小时等中任意或任意两者之间的范围，优选为4小时或18小时)，得到浸泡后的种子；该净度分析依据国家标准《农作物种子检验规程净度分析GB/T 3543.3-1995》进行。

(3)染色：将浸泡后的种子用滤纸吸干种子表面水分，用解剖刀快速人工去除种皮后，于避光条件下浸入TTC染色液中进行染色处理，时间为15-40小时(示例性地，可以为15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时等中任意或任意两者之间的范围，优选为18小时或36小时)，温度为25-40℃(示例性地，可以为25℃、28℃、32℃、37℃、40℃等中任意或任意两者之间的范围，优选为30℃或35℃)，得到染色后的种子。

上述去除种皮的速度为50-85分钟/100粒种子(示例性地，可以为50分钟/100粒种子、55分钟/100粒种子、60分钟/100粒种子、65分钟/100粒种子、70分钟/100粒种子、75分钟/100粒种子、80分钟/100粒种子、85分钟/100粒种子等中任意或任意两者之间的范围，优选为54分钟/100粒种子或57分钟/100粒种子)；

上述染色方法中使用的仪器包括：发芽箱、发芽盒(透光)、培养皿、镊子、解剖刀、解剖针、标签纸、滤纸、量筒、烧杯、容量瓶(100mL)、棕色瓶。

上述染色方法以早熟京茄1号种子为材料，采用TTC法测定茄子种子生活力的适宜方法，快速预测茄子种子最大发芽潜力，探索茄子种子生活力四唑测定值与发芽率之间的数量关系，以验证评价TTC法用于早熟京茄1号种子生活力预测的可行性，为茄子种子生产和销售提供参考依据。

上述染色方法中，茄子的种子由人工去除种皮后再染色，并选用了适宜的染色条件，有利于加强茄子种子的染色效果；目前关于TTC法测定种子的生活力的研究中，在染色前的准备阶段，《国际种子检验规程》(International Rulesfor Seed Testing)中规范了茄科番茄属的番茄种子需要在将种子纵切为两半，观察切面染色情况；而茄子种子较小，种皮表面光滑，不易切开；种子经人工剥皮染色之后，纵切较易操作，有利于在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，以区分种子胚各部分的着色效果，辨别种子的生活力。

上述染色方法中，选用了适宜的染色条件，如浸种温度、浸种时间、染色液浓度、染色温度、染色时间等，这些参数协同作用，共同提高了染色效果；不同作物活种子中的脱氢酶含量不同，活性不同，因而需要的染色条件也不同；由于TTC测定法的原理是：利用种子所吸收的无色TTC，接受了有生活力的种子呼吸过程中胚细胞里含有的脱氢酶产生的氢，而变成还原态的红色稳定不溶于水的三苯基甲腙(TTF)；因此，可以按胚组织的染色情况区分有生活力的种子和无生活力的种子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

溶液Ⅱ：称取9.472g Na₂HPO₄或11.876g Na₂HPO₄·2H₂O溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

(2)称再取1g四唑粉剂溶解于100mL的上述磷酸缓冲液中，即可得浓度为1％的TTC染色液；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在20℃恒温浸种18h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为54分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在30℃避光染色36h，得到染色后的种子。

实施例2：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在20℃恒温浸种18h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为54分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在35℃避光染色18h，得到染色后的种子。

实施例3：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在20℃恒温浸种18h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为54分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在35℃避光染色36h，得到染色后的种子。

实施例4：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在30℃恒温浸种4h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为57分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在30℃避光染色36h，得到染色后的种子。

实施例5：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在20℃恒温浸种18h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为54分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在30℃避光染色18h，得到染色后的种子。

实施例6：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在30℃恒温浸种4h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为57分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在30℃避光染色18h，得到染色后的种子。

实施例7：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在30℃恒温浸种4h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为57分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在35℃避光染色18h，得到染色后的种子。

实施例8：

本实施例的TTC染色液的配制方法包括以下步骤：

(1)磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄溶解于1000mL蒸馏水中；

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成；

本实施例的检测方法包括以下步骤：

对供试的早熟京茄1号种子经净度分析之后，在30℃恒温浸种4h；浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮(速度为57分钟/100粒种子)后，进行选用四唑的百分浓度为1％的TTC染色液在35℃避光染色36h，得到染色后的种子。

试验例：

本试验例中，对于包括以上实施例1-8中的早熟京茄1号种子在不同浸种温度、时间组合、不同浓度染色液、不同染色温度、不同染色时间下的染色情况进行分析。

一、试验方法：

1、发芽试验：

对供试早熟京茄1号种子经净度分析之后，随机选取每重复100粒种子，设4次重复，在发芽箱内(20℃16h黑暗，30℃8h光照)进行纸上发芽试验，7天初数，14天终数，统计发芽率；该发芽试验的目的是为了确保试验用的种子都是有活力的，以检验四唑染色方法；

2、TTC染色液的配制：

2.1、磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9.078g KH₂PO₄(磷酸二氢钾)溶解于1000mL蒸馏水中；

溶液Ⅱ：称取9.472g Na₂HPO₄(磷酸氢二钠)或11.876g Na₂HPO₄·2H₂O溶解于1000mL蒸馏水中。

然后按照体积比取溶液Ⅰ：1份和溶液Ⅱ：1.5份混合即成。

2.2、不同浓度TTC染色液配制：

1％浓度TTC染色液：称取1g四唑粉剂溶解于100mL磷酸缓冲液中即可。

0.2％浓度TTC染色液：量取1份配好的1％浓度TTC染色液加入4份磷酸缓冲液混合均匀可得。

3、种子浸泡、染色：

对供试早熟京茄1号种子经净度分析之后，随机数取每重复100粒种子，设4次重复。在20℃恒温浸种18h或在30℃恒温浸种4h，浸种结束后，取出种子，用滤纸吸干种子表面水分，快速人工去皮后进行避光染色。分别选用0.2％、1％两种浓度的四唑染色液，在30℃、35℃恒温条件下进行染色不同时间(1h、18h、36h)，分别统计各组染色结果即着色种子数目。

4、着色种子纵切，显微镜下观察：

种子经染色之后，统计每组种子着色情况，选取每组有代表性的着色种子进行纵切，在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，区分种子胚各部分的着色效果，辨别种子的生活力。

种子经染色和处理后，进行正确的观察鉴定十分重要。一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力种子；凡是胚的主要构造局部不染色或染成异常的颜色和光泽，并且活营养组织不染色部分已超过二分之一，或超过容许范围，以及组织软化的，完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软化腐烂或异常、虫蛀、损伤的均为无生活力种子。

二、结果与分析：

1、发芽率计算：

发芽试验结束后，观察统计4次重复种子发芽的数目分别为91粒、95粒、94粒、92粒，计算发芽率：

发芽率＝[(91+95+94+92)/400]×100％＝93％

2、TTC染色法早熟京茄1号种子着色情况

不同浸种温度、时间组合，不同浓度的TTC染色液、不同染色温度、不同染色时间下，早熟京茄1号种子染色情况及方差分析结果如表1所示：

表1：TTC法测定早熟京茄1号种子生活力

表注：表中方差分析结果是运用IBM SPSS Statistics 20软件对各处理组合着色种子数目在0.01显著水平下进行差异显著性分析得到的。

从表1中各处理组合着色种子数目及方差分析结果可以看出：

当染色时间为1h(见处理组合1、4、7、10、13、16、19、22)，早熟京茄1号种子染色效果很差，大多数种子没有着色，只有少数的种子有轻微的着色。

当浸种温度为20℃、浸种时间为18h，染色温度(30℃)较低时，随染色时间延长，着色种子数目增多，染色效果增强；而染色温度(35℃)较高时却发现在较高染色液(1％)浓度时，染色时间为36h的染色效果不及染色时间为18h的染色效果，着色种子数目减少，但没有显著性差异。对应比较处理组合5、6和处理组合2、3以及处理组合11、12和处理组合8、9可以发现，在染色温度相同时，TTC染色液浓度(1％)较高，着色种子数目显著性增多，种子染色效果有明显的优势；对应比较处理组合8、9和处理组合2、3以及处理组合11、12和5、6却发现，在染色液浓度相同时，染色温度(35℃)较高有利于种子着色，着色种子数目增多，且发现，仅处理组合11对比处理组合5着色种子数目有显著性差异。说明浸种温度、时间组合为20℃、18h，TTC染色液浓度(1％)较高，染色温度(35℃)较高有利于种子着色。

当浸种温度为30℃、浸种时间为4h，染色温度相同(30℃或35℃)时，TTC染色液浓度较高(1％)，种子着色效果有明显的优势，即对应比较处理组合17、18和处理组合14、15以及处理组合23、24和处理组合20、21，种子着色效果均有明显的优势，且达到显著性差异。当TTC染色液浓度相同且较低(0.2％)时，不同的染色温度下着色种子数目没有显著性差异；TTC染色液浓度较高(1％)时，染色温度较低(30℃)时，随着染色时间的延长，着色种子数目增加，且达到显著性差异，而染色温度较高(35℃)时，随着染色时间的延长，着色种子数目反而有下降的趋势，说明在TTC染色液浓度(1％)较高时，染色温度(35℃)较高同时染色时间(36h)较长不利于种子着色，反而会降低种子的染色效果。

3、着色种子纵切、显微镜下观察种子切面染色情况

实验过程中处理组合1、4、7、10、13、16、19、22着色种子数目均少于50粒，且染色程度很浅，故没有进行纵切在显微镜下观察种子切面胚各部分的染色情况，其余各处理组合均选取了具有代表性的着色较为清晰的种子，纵切并在体式显微镜下观察种子的切面染色效果，区分种子胚各部分的着色情况，辨别种子的生活力。

从上面这些着色种子纵切在显微镜下观察采集的图像可以发现：

图4(处理组合6)、图7(处理组合11)、图8(处理组合12)、图12(处理组合18)、图13(处理组合20)、图14(处理组合21)较为清晰。再结合表1中各处理组合着色种子数目及方差分析结果，图13和图14虽然较为清晰，但其处理组合20和21着色种子数目仅有72±3粒和68±3粒，均没有反映出供试材料的实际生活力情况，故处理组合20和21均不适于早熟京茄1号茄子种子的生活力测定。图4(处理组合6)、图7(处理组合11)、图8(处理组合12)、图12(处理组合18)着色种子数目分别为91±2粒、97±3粒、94±4粒和92±2粒，没有出现显著性差异，其中处理组合11着色种子数目最多，为97粒，且染色时间较短，为18h，其余三个处理组合染色时间均为36h，考虑染色时间对实验周期的影响，因此选择处理组合11作为TTC法快速测定早熟京茄1号茄子种子生活力的理想处理组合。

三、结论与讨论

TTC法测定种子的生活力，在染色前的准备阶段，《国际种子检验规程》(International Rules for Seed Testing)中规范了茄科番茄属的番茄种子需要在将种子纵切为两半，观察切面染色情况。而茄子种子较小，种皮表面光滑，不易切开，经过多次实验探索，发现用解剖刀快速人工去皮后，在适宜的条件下染色效果较好。种子经剥皮染色之后，统计每组种子着色情况，选取每组有代表性的着色种子进行纵切，此时纵切较易操作，在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，区分种子胚各部分的着色效果，辨别种子的生活力。

在种子染色阶段，染色时间1h过短，不适于早熟京茄1号茄子种子的生活力测定。这很可能是由于染色时间过短，活种子呼吸过程中脱氢酶产生的[H]非常有限，来不及与四唑染色液充分反应造成的。

TTC染色液浓度(1％)较高、染色温度(35℃)较高、染色时间延长，均有利于早熟京茄1号茄子种子的生活力测定。但在较高的染色液浓度时，染色温度(35℃)较高，同时染色时间(36h)过长，早熟京茄1号茄子种子的染色效果反而下降，这可能是由于种子长时间处于较高的染色温度条件下，内部某些物质结构遭到破坏，导致种子生活力下降引起的。

Claims

1.一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法，其特征在于：该染色方法将茄子种子于TTC染色液中进行染色处理。

2.根据权利要求1所述测定茄子种子生活力的四唑染色方法，其特征在于：

所述TTC染色液中，四唑的百分浓度0.1％-1.5％，优选为0.2％或1％。

3.根据权利要求2所述测定茄子种子生活力的四唑染色方法，其特征在于：所述TTC染色液中还包括缓冲液；

所述缓冲液包括：

溶液I：浓度为5-15g/L，优选为9.078g/L的磷酸二氢钾溶液；

溶液II：浓度为5-15g/L，优选为9.472g/L的磷酸氢二钠溶液，或浓度为5-15g/L，优选为11.876g/L的二水合磷酸氢二钠溶液；

所述溶液I与溶液II的体积比为1：(1-4)，优选为1：1.5。

4.根据权利要求1-3中任一项所述四唑染色方法，其特征在于：该染色方法包括以下步骤：

浸种步骤：将茄子种子进行浸泡处理，得到浸泡后的种子；

染色步骤：将所述浸泡后的种子去皮处理后，再进行染色处理，得到染色后的种子。

5.根据权利要求4所述四唑染色方法，其特征在于：所述浸种步骤中，所述浸泡处理的时间为3-20小时，优选为4小时或18小时，温度为15-40℃，优选为20℃或30℃。

6.根据权利要求4所述四唑染色方法，其特征在于：所述染色步骤中，所述去皮处理的速度为50-85分钟/100粒种子，优选54分钟/100粒种子或57分钟/100粒种子。

7.根据权利要求6所述四唑染色方法，其特征在于：所述染色步骤中，所述染色处理的时间为15-40小时，优选为18小时或36小时，温度为25-40℃，优选为30℃或35℃。

8.根据权利要求6或7所述四唑染色方法，其特征在于：所述染色步骤中，所述染色处理在避光条件下进行。