CN104904376B - 一种快速检测獐茅种子生活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于种子检测技术领域，具体涉及一种快速检测獐茅种子生活力的方法，该方法是通过以下步骤实现的：獐茅种子在臭氧水及含有烷基糖苷及脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液预浸泡，然后将獐茅种子有种胚一端通过TTC溶液及葡萄糖酸锌溶液的混合液进行染色处理，再以乳酸苯酚透明剂浸种处理染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，计算有生活力种子的百分率。本发明提供的方法快速有效，减少，能够缩短浸泡时间，减少对种子的机械性损伤，对于草地利用和生态保护具有重要的实践意义。

Description

一种快速检测獐茅种子生活力的方法

技术领域

本发明属于种子检测技术领域，具体涉及一种快速检测獐茅种子生活力的方法。

背景技术

獐茅属于禾本科植物，以营养生长和营养繁殖为主，匍匐茎是其重要的营养繁殖器官，与之相比，有性繁殖对于獐茅种群的贡献不大，成穗率仅为15.7%，籽实很小，千粒重仅为0.12±0.0015g。獐茅广泛分布于中国北方各省内陆以及沿海的盐渍土壤地区，为盐生植物中的泌盐植物，是一种固沙和盐碱地区放牧的优良牧草。由于獐茅耐盐碱的生理特性及营养繁殖的生理现象，目前，对獐茅及其同属植物的泌盐生理及种群结构等研究较多，而獐茅种子发芽率相对较低，对于獐茅种子萌发活力研究较少，因此深入了解獐茅种子生活力，通过测定獐茅种子生活力预判獐茅种子发芽率，对于草地利用和生态保护具有实践意义。

四唑（2,3,5-氯代三苯基四氮唑，以下简称TTC）测定技术于1942年由德国莱抗（Lakon）教授提出，之后为世界各国所采用。目前，TTC检测方法多用于农作物、蔬菜、林木等种子的测定，而用于牧草等种子的相对较少，我国《牧草种子检验规程》中列出了57个属的草种TTC测定方法，獐茅属尚未列其中。许多牧草尤其是禾本科和豆科牧草种子，收获后即使给予适宜的发芽条件也不能发芽或发芽率很低。TTC法可检测獐茅种子的生活力，缩短了采用发芽试验衡量种子生活力的时间，但传统的TTC法将种子用水浸种24h左右后，再加入TTC溶液中进行染色6-24h，时间仍较长，因此，研究一种快速检测獐茅种子生活力的方法具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种快速检测獐茅种子生活力的方法，解决了现有技术中检测时间长的问题，能够快速有效的检测獐茅种子的生活力，对于草地利用和生态保护具有重要的实践意义。

本发明测定方法所依据的原理：有活力种胚中的脱氢酶可以将TTC还原成不溶性的TTF（红色三苯基甲），如果种胚死亡或种胚生活力衰退，则不能染色或染色较浅，因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生活力，化学方程式如下：

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种快速检测獐茅种子生活力的方法，包括以下步骤：

（1）首先将獐茅种子在臭氧水中浸泡2-3min，取出加入含有烷基糖苷及脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液中浸种，待种子均吸胀后，沿靠近种胚3/4处横切；

（2）将獐茅种子有种胚一端用质量百分比为0.5～5%的TTC溶液及质量百分比为0.1-0.3%的葡萄糖酸锌溶液的混合液置于25～35℃暗环境下染色2-4h，然后用蒸馏水冲洗2-3遍，再以乳酸苯酚透明剂浸种处理染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗的为正常有生活力的种子；染色异常或者不染色的种子为无生活力种子，计算有生活力种子的百分率。

进一步的，所述臭氧水的浓度为1.2mg/L。

进一步的，步骤（1）中，所述水溶液的各组分重量百分比为：烷基糖苷5-8%，脂肪酸甲酯乙氧基化物10-15%及余量的水。

进一步的，步骤（2）中，所述TTC溶液同葡萄糖酸锌溶液的体积比为5:1。

进一步的，所述TTC溶液最优化的质量百分比为1%，所述葡萄糖酸锌溶液最优化的质量百分比为0.3%。

进一步的，所述染色的最优化的温度为30℃。

进一步的，所述乳酸苯酚透明剂浸种处理的条件为：温度38℃，处理时间30min。

本发明中所述染色异常为染色很淡或颜色深暗，未呈现鲜红色，并且有杂色斑、白斑，胚根、胚芽、胚轴不染色。

本发明将獐茅种子预先经烷基糖苷及脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液进行浸泡，獐茅种子表皮含有的蜡质结构，是一层天然的疏水屏障，不利于浸润，传统的机械方法去除表面蜡质易破坏种子的内部结构且去除颖皮后仍需长时间水浸泡使其吸胀，脂肪酸甲基乙氧基化物能够溶解种子表面的蜡质，加快种子的吸胀，烷基糖苷同脂肪酸甲基乙氧基化物协同作用，加快表面蜡质的溶解，同时，烷基糖苷具有较强的广谱抗菌活性，能够避免后期浸泡染色导致种子发生霉变，影响检测效率及检测结果。本发明发明人经过大量试验后发现，葡萄糖酸锌中的锌离子能够加速种子的呼吸作用，从而缩短染色所需时间，提高染色效率。

本发明的有益效果为：

（1）本发明将獐茅种子通过含有烷基糖苷及脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液进行预处理，能够缩短浸泡时间，减少对种子的机械性损伤，同时减少染色过程中种子霉变。

（2）本发明将TTC溶液同葡萄糖酸锌溶液进行复配，能够快速有效的检测獐茅种子生活力，对于草地利用和生态保护具有重要的实践意义。

附图说明

图1为獐茅种子染色后200倍显微镜下图谱。

其中：（1）-（5）为生活力的种子，（6）-（9）为无生活力种子。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

溶液的制备：

1.TTC溶液的配制方法：准备两种溶液：溶液Ⅰ：在1000ml水中溶解9.078g磷酸二氢钾（KH2PO4）；溶液Ⅱ：在1000ml水中溶解9.472g磷酸氢二钠（Na2HPO4），或在1000ml水中溶解11.876g磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）。取溶液Ⅰ2份和溶液Ⅱ3份混合得到缓冲溶液。缓冲溶液PH值保持在6.5-7.5范围内。按照比例在缓冲溶液里溶入四氮唑粉末，获得确定浓度。装入棕色试剂瓶，贮存于4℃条件下备用。

2.乳酸苯酚透明级的配制方法：将10g苯酚加入10mL的蒸馏水，加热溶解后，加入10g乳酸（比重1.21）及20g甘油即可。

獐茅种子生活力的计算方法：獐茅种子生活力=胚部染成红色的种子数/种子总数×100%。

本发明所使用的烷基糖苷为APG0810。

实施例1

一种快速检测獐茅种子生活力的方法，包括以下步骤：

（1）首先将50粒獐茅种子（2014年在山东省寿光县北部采集）在1.2mg/L臭氧水中浸泡2min，取出加入含有8%烷基糖苷及12%脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液中浸种，待种子吸胀均一后，然后沿靠近种胚3/4处横切；

（2）将獐茅种子有种胚一端用质量百分比为1%的TTC溶液及质量百分比为0.3%的葡萄糖酸锌溶液（本发明所使用的葡萄糖酸锌溶液为葡萄糖酸锌的水溶液，以下实施例均同此）按照质量比5:1组成的混合液置于30℃暗环境下染色，然后用蒸馏水冲洗2遍，再以乳酸苯酚透明剂在38℃条件下浸种处理30min染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗的为正常有生活力的种子；染色异常或者不染色的种子为无生活力种子，计算有生活力种子的百分率。

将本实验重复3次，每个重复均为50粒，染色后的种子进行观察统计，两个重复中染成红色的种子数为49粒，48粒，48粒，计算本批次具有生活力种子的百分率平均为96.7%。

将染色的獐茅种子在200倍显微镜下观察检测，结果见图1，从图1中可以看出，（1）-（5）为有生活力种子，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗；（6）-（9）为无生活力种子，染色异常或者不染色的种子。

实施例2

一种快速检测獐茅种子生活力的方法，包括以下步骤：

（1）首先将50粒獐茅种子（2014年在河北省东南部的孟村回族自治县采集）在1.2mg/L臭氧水中浸泡3min，取出加入含有5%烷基糖苷及15%脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液中浸种，待种子吸胀均一后，然后沿靠近种胚3/4处横切；

（2）将獐茅种子有种胚一端用质量百分比为0.5%的TTC溶液及质量百分比为0.23%的葡萄糖酸锌溶液按照质量比5:1组成的混合液置于35℃暗环境下染色，然后用蒸馏水冲洗3遍，再以乳酸苯酚透明剂在38℃条件下浸种处理30min染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗的为正常有生活力的种子；染色异常或者不染色的种子为无生活力种子，计算有生活力种子的百分率。

将本实验重复3次，每个重复均为50粒，染色后的种子进行观察统计，两个重复中染成红色的种子数为47粒，47粒，46粒，计算本批次具有生活力种子的百分率平均为93.3%。

实施例3

一种快速检测獐茅种子生活力的方法，包括以下步骤：

（1）首先将50粒獐茅种子（2014年在内蒙古乌海市采集）在1.2mg/L臭氧水中浸泡3min，取出加入含有6.5%烷基糖苷及10%脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液中浸种，待种子吸胀均一后，然后沿靠近种胚3/4处横切；

（2）将獐茅种子有种胚一端用质量百分比为5%的TTC溶液及质量百分比为0.1%的葡萄糖酸锌溶液按照质量比5:1组成的混合液置于25℃暗环境下染色，然后用蒸馏水冲洗3遍，再以乳酸苯酚透明剂在38℃条件下浸种处理30min染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗的为正常有生活力的种子；染色异常或者不染色的种子为无生活力种子，计算有生活力种子的百分率。

将本实验重复3次，每个重复均为50粒，染色后的种子进行观察统计，两个重复中染成红色的种子数为44粒，45粒，43粒，计算本批次具有生活力种子的百分率平均为88%。

对比例1

一种快速检测獐茅种子生活力的方法，包括以下步骤：

（1）首先将50粒獐茅种子（2014年在山东省寿光县北部采集）通过机械方法去除种子表面颖皮，在1.2mg/L臭氧水中浸泡2min，纸间浸种，待种子吸胀均一后，然后沿靠近种胚3/4处横切；

（2）将獐茅种子有种胚一端用质量百分比为1%的TTC溶液置于30℃暗环境下染色，然后用蒸馏水冲洗2遍，再以乳酸苯酚透明剂在38℃条件下浸种处理30min染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗的为正常有生活力的种子；染色异常或者不染色的种子为无生活力种子，计算有生活力种子的百分率。

将本实验重复3次，每个重复均为50粒，染色后的种子进行观察统计，两个重复中染成红色的种子数为48粒，48粒，49粒，计算本批次具有生活力种子的百分率平均为96.7%。

对实施例1-3及对比例1的浸种时间、染色时间进行统计，具体结果见表1。

表1

从表1中可以看出，本发明提供的方法较传统的TTC方法浸种及染色时间均有大幅度的缩减，有效的提高了检测效率。

将实施例1-3从不同地区采集的种子分别取50粒进行发芽率试验，每一个地区的种子进行重复试验2次，具体结果见表2。

表2

从表2中可以看出，本发明提供的方法同通过发芽率测得的方法所得的百分率相近，说明该方法快速有效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种快速检测獐茅种子生活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）首先将獐茅种子在臭氧水中浸泡2-3min，取出加入含有烷基糖苷及脂肪酸甲酯乙氧基化物的水溶液中浸种，待种子均吸胀后，沿靠近种胚3/4处横切；

所述水溶液的各组分重量百分比为：烷基糖苷5-8%，脂肪酸甲酯乙氧基化物10-15%及余量的水；

（2）将獐茅种子有种胚一端用质量百分比为0.5～5%的TTC溶液及质量百分比为0.1-0.3%的葡萄糖酸锌溶液的混合液置于25～35℃暗环境下染色2-4h，然后用蒸馏水冲洗2-3遍，再以乳酸苯酚透明剂浸种处理染色后的种子，观察獐茅种子染色情况，染色均匀、一致，呈鲜红色，胚形态正常，胚根尖及子叶边缘颜色稍暗的为正常有生活力的种子；染色异常或者不染色的种子为无生活力种子，计算有生活力种子的百分率；

所述TTC溶液同葡萄糖酸锌溶液的体积比为5:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述臭氧水的浓度为1.2mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述TTC溶液的质量百分比为1%，所述葡萄糖酸锌溶液的质量百分比为0.3%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色的温度为30℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乳酸苯酚透明剂浸种处理的条件为：温度38℃，处理时间30min。