CN102106346B

CN102106346B - 水葫芦抑制剂、其制备方法及用其抑制水葫芦的方法

Info

Publication number: CN102106346B
Application number: CN200910200601.6A
Authority: CN
Inventors: 郑慧琼; 魏晓静; 王六法; 徐国鑫
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN102106346A

Abstract

本发明提供了一种水葫芦抑制剂、其制备方法及用其抑制水葫芦的方法。本发明提供的用于防治水葫芦的组合物包含：活性成分(a)：肉桂酸和/或其衍生物香豆酸；活性成分(b)：水杨酸；和(c)农药学上可接受的载体或辅剂，其中，活性成分(a)与活性成分(b)的重量比为10∶1～1∶10，本发明还提供了该组合物的制备方法以及用该组合物抑制水葫芦的方法。本发明的组合物和方法具有安全高效、质量可控、易于生产，且可持续性控制水葫芦生长的优点，为建立有效的水葫芦管理体系提供新的途径。

Description

水葫芦抑制剂、其制备方法及用其抑制水葫芦的方法

技术领域

本发明属于除草剂领域，更具体而言属于生物除草剂领域，其中所提供的除草剂对水葫芦具有有效的抑制作用。

背景技术

水葫芦[Eichhornia crassipes(Martus)Solmslaubach]又称凤眼莲，是雨久花科凤眼莲属，多年生单子叶水生草本植物，也可根生于淤泥中。水葫芦根状茎粗短，密生许多细长的须根，其繁殖能力极强，以无性繁殖为主，13～39℃的气温都适宜繁殖。水葫芦一般每5天可繁殖1株新植株，8个月便能繁衍成60万株的群体。水葫芦也可开花结出种子进行有性繁殖，一枝花大约结300粒种子，种子一般沉入水中休眠，环境适宜开始萌发。水葫芦是世界上繁殖速度最快的植物之一[1]，平均每100平方米的水面能够生长200万株水葫芦，合计300多吨。也是危害最严重的多年生水生杂草之一[2]。它能够在水库、湖泊、河道等大型水域快速繁殖，形成单一的优势群体，减少生物多样性，为蚊蝇滋生提供场所，严重危害农业发展，水上运输，人类和家畜的健康[3]。

近年来，随着人们生活水平的提高和工业的发展，城市生活垃圾及工业污水的排放使水体富营养化，加剧了水葫芦快速蔓延。在我国的17个省市自治区均有水葫芦泛滥成灾的报导，危害最严重为浙江、福建、广东、云南和台湾五省[4]。我国每年因水葫芦及其它入侵物种所造成的损失约为574亿元。

目前，水葫芦治理方法综合起来主要有三种：人工打捞、化学除草剂防治(例如国内外通常使用的化学除草剂：草甘膦和2，4-D)、以及生物防治[4]。由于人工打捞的费时费力且控制效果持续性小，化学除草剂会对造成新一轮的环境污染，人们开始重视无污染的天然产物农药及植物源除草剂，利用生物的化感作用来控制水葫芦是治理水葫芦的新思路[15，16]。

自20世纪70年代以来，人们已经尝试了利用多种植物的化感作用来探索寻找治理水葫芦的新方法，比如醡浆草酸(Oxalic acid)[5]、龙蛇草植物[6]、银胶菊[7]和野薄荷等[8]植物的提取物或干粉悬浮液对水葫芦的生长有显著的抑制作用。马缨丹广泛分布于热带和亚热带地区，能够产生大量的次生代谢物质，其提取物对于多种水生植物的幼苗根的生长与种子发芽具有较强的抑制作用[9，13]。Saxena MK(2000)报告把马缨丹的枝条放入培养水葫芦的水池中，3周后导致池中水葫芦叶和根死亡[13]，易振等(2006)报告马缨丹叶水提液中水杨酸、6-甲基香豆素、香豆素和对羟基苯甲酸对水葫芦的抑制作用[10]。本申请人实验室通过对马缨丹水提液对水葫芦生长的抑制研究发现，喷洒马缨丹提取液所导致的水葫芦叶细胞中超氧化物歧化酶活性和过氧化氢增加是导致其死亡的原因[11，17]，并申请了专利[12]。本发明的研究正是基于本项目组的发明专利“水葫芦生物抑制剂及其制备方法”(专利号：ZL200410052993.3)[2]以及2003-2005年期间上海市科技攻关项目“水葫芦生物抑制剂的研究”(项目编号：03DZ12008)。

本项目组前述的专利以红黄花马缨丹(Lantana camara)的叶为原材料，其优点是来源于天然材料，低毒，易降解等。但是，该制剂也存在有明显的缺点，即主效成分不清楚，生产过程中质量控制难。另外，原材料(马缨丹)中的主效成分受到了马缨丹生长状态与生长环境的巨大影响[14]，比如老叶与嫩叶、秋季与春季取材、取材后材料的储存条件等都可导致制剂主效成分的明显变化，从而导致制剂的使用效果不稳定。

因此，本领域中迫切需要开发出安全、高效、质量可控、易于生产，且可持续性控制水葫芦生长的生物除草剂，从而为建立有效的水葫芦管理体系提供新的途径。

发明内容

本发明的主要目的正是在于：寻找安全、高效且易于生产，可持续性控制水葫芦生长的生物除草剂，为建立有效的水葫芦管理体系提供新的途径。

在本发明的第一方面中，提供了一种用于防治水葫芦的组合物，所述组合物包含：

活性成分(a)：肉桂酸和/或其衍生物香豆酸；

活性成分(b)：水杨酸；

(c)农药学上可接受的载体或辅剂，

其中，活性成分(a)与活性成分(b)的重量比为10∶1～1∶10。

在一个优选例中，所述活性成分(a)与活性成分(b)的重量比为5∶1～1∶5，更优选4∶1～1∶4，再优选为1∶2～2∶1。

在本发明的一个实施方式中，所述活性成分(a)中同时包含肉桂酸和香豆酸，且肉桂酸与香豆酸的重量比为10∶1～1∶10。

在一个优选例中，肉桂酸与香豆酸的重量比为5∶1～1∶5，更优选4∶1～1∶4，再优选为1∶2～2∶1。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物中还包含选自下组中的一种或多种的活性成分(d)：6-甲基香豆素、龙胆酸、雷琐酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、香豆素或7-羟基香豆素。

在一个优选例中，所述活性成分(d)为：6-甲基香豆素。

在本发明的另一个实施方式中，所述农药学上可接受的载体或辅剂选自：稀释剂、保湿剂、表面活性剂或助溶解剂。

在一个优选例中，所述稀释剂选自：醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或柠檬酸-磷酸缓冲液；保湿剂选自：甘油；表面活性剂选自：十二烷基硫酸钠、吐温、Triton X-100；所述助溶解剂选自：二甲亚砜。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物包含的活性成分、稀释剂、保湿剂和表面活性剂之间的体积比为1∶(5000-15000)∶(100-1000)∶(1-200)。

在一个优选例中，所述活性成分、稀释剂、保湿剂和表面活性剂之间的体积比为1∶(8000-12000)∶(400-800)∶(10-100)，优选1∶(9000-10000)∶(400-500)∶(10-50)。

在本发明的另一个实施方式中，活性成分(a)和活性成分(b)的体积之和占所述组合物总体积的0.01～10.0。

在一个优选例中，活性成分(a)和活性成分(b)的体积之和占所述组合物总体积的0.05～5.0，优选0.1～1.0。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物包含：

0.1-10重量份的肉桂酸；

0.1-10重量份的香豆酸；

0.1-10重量份的水杨酸；和

0-10重量份6-甲基香豆素。

在本发明的第二方面中，提供了一种制备防治水葫芦的组合物的方法，所述方法包括混合以下组分形成组合物的步骤：

活性成分(a)：肉桂酸和/或其衍生物香豆酸；

活性成分(b)：水杨酸；

(c)农药学上可接受的载体或辅剂，

其中，活性成分(a)与活性成分(b)的重量比为10∶1～1∶10。

在本发明的第三方面中，提供了一种防治水葫芦的方法，所述方法包括将本发明的组合物施用到水葫芦上、施用到长有水葫芦的区域或可能会长有水葫芦的区域中。

在一个优选例中，所述组合物的施用剂量为0.05～0.60升/平方米/天，优选0.10～0.40升/平方米/天，更优选0.10～0.20升/平方米/天。

在本发明的第四方面中，提供了肉桂酸和/或其衍生物香豆酸在制备防治水葫芦的组合物中的用途。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：马缨丹叶水提取液中主效成分分析的HPLC图谱。其中：A：肉桂酸；B：香豆酸；C：二羟肉桂酸；D：丁香酸；E：水杨酸。

图2：含单一酚酸类化合物的抑制剂对水葫芦生长的影响(喷洒14天后)。其中，1：6-甲基香豆素；2：香豆酸；3：肉桂酸；4：水杨酸。

图3：新型制剂(LLE 02)与已有专利的马缨丹叶提取液(LLE 01)水葫芦叶片生长抑制作用的比较。其中，A：对照，在同样条件下生长，但不喷抑制剂；B：LLE 01喷洒7天；C：LLE 02喷洒7天。

图4：新型制剂(LLE 02)与已有专利的马缨丹叶提取液(LLE 01)对水葫芦叶片POD活性的影响。

图5：新型制剂(LLE 02)与已有专利的马缨丹叶提取液(LLE 01)处理导致水葫芦叶片中过氧化氢的积累。其中，A：对照；B：LLE 01制剂处理；C：LLE 02制剂处理。叶片的染色表示过氧化氢的积累，颜色越深表示过氧化氢积累越多。

图6：新型制剂(LLE 02)对野外河道(嘉定河道)中水葫芦生长的抑制作用。上图，喷洒药剂前；下图，喷洒药剂20天后。

图7：喷洒制剂LLE 02对野外河道(嘉定河道)中生长的水葫芦叶的抑制作用，所示为嘉定河道中喷洒LLE 02药剂20天后水葫芦的情况，着重观察叶的死亡情况。其中，A：对照，不喷药；B：喷药后20天；C、D：喷药后水葫芦叶片的形态变化：Con：对照，1-4：经药剂处理的植株。

图8：喷洒本发明药剂的长期效果，所示喷药后2个月水葫芦的恢复情况。其中，A：对照(不喷药)；B：LLE 02制剂喷洒的河道中水葫芦的局部照片。

图9：在松江池塘中进行的区域实验。其中，A：对照；B：LLE 01喷洒14天后；C：LLE 02喷洒14天后。

图10：抑制剂LLE 01和LLE 02对于封闭池塘中水葫芦干重的影响。

具体实施方式

在新农药开发难度越来越大的今天，利用天然药用植物，研究植物次生代谢物质是研制农药的主要途径之一，是寻找新的先导化合物的重要来源。通过分离马缨丹叶提取液中抑制水葫芦生长的活性成分，以及进一步研究各活性成分之间的配比与活性的关系，本发明开发出了新型的水葫芦抑制剂。

针对现有技术中所存在的问题，本发明首先对已有制剂中的有效成分进行了测定分析，结果表明：肉桂酸、香豆酸、水杨酸等成分是马缨丹叶提取物作用的主效成分，通过对水葫芦的抑制实验研究，证明肉桂酸、香豆酸和水杨酸均能对水葫芦的生长起到一定的抑制作用。

在此基础上，发明人还进一步研发出了一定配比的上述马缨丹液提取液有效成分与一定辅剂的组合物，通过实验证明了该组合物对水葫芦生长的抑制效果明显优于马缨丹叶提取液，进一步的野外的实验结果也表明用本发明研制的生物抑制剂喷洒水葫芦叶面，能够有效抑制水葫芦的叶和芽的繁殖，加速叶片的衰老和根的腐烂，为有效安全治理水葫芦提供的一种新的方法。在此基础上，本发明人完成了本发明。

活性成分

如本发明所用，术语“活性成分”是指对水葫芦具有一定防治作用的有效成分，所述活性成分包括：在本发明中从马缨丹叶提取物中鉴定出的具有抑制水葫芦效果的肉桂酸、香豆酸、水杨酸等成分；以及本领域中已知的具有防治水葫芦效果的其它有效成分。

如本文所用，术语“防治”或“防治作用”是指：施加于水葫芦上、生长有水葫芦的区域(如水域)或可能会生长水葫芦的区域时，对水葫芦的生长、繁殖所起到的消除、抑制或预防的作用。

术语“活性成分(a)”或“本发明的活性成分”是指：在本发明中首次从马缨丹叶提取物中鉴定出来具有防治水葫芦效果的有效成分肉桂酸及其衍生物香豆酸。经本发明的研究表明肉桂酸及香豆酸均对水葫芦的生长和营养增殖具有抑制作用，且其与其它有效组分以一定配比形成的组合物效果更佳。

在本发明中，对于制备或获得活性成分(a)的方法没有特别的限制，比如其可以从植物(例如马缨丹叶)中提取、通过化学合成的方法制备、或直接通过市售途径获得。

术语“活性成分(b)”是指本领域中已知的具有防治水葫芦效果的化合物水杨酸，该活性成分可于本发明的活性成分混合使用，以获得更佳的防治效果。在本发明中，对于制备或获得活性成分(b)的方法没有特别的限制，比如其可以从植物(例如马缨丹叶)中提取、通过化学合成的方法制备、或直接通过市售途径获得。

可用于本发明组合物中的其它活性成分包括但不限于：6-甲基香豆素、7-羟基香豆素，龙胆酸、雷琐酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸或香豆素，优选6-甲基香豆素。其它活性成分的加入应有利于本发明组合物防治水葫芦效果的提高。

组合物

本发明还提供了一种组合物，所述的组合物含有有效量的本发明的活性物质以及农药学上可接受的载体或辅剂。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。

如本文所用，术语“农药学上可接受的载体或辅剂”是指适用于除草剂中，本身并不是必要的活性成分，且施用后对环境和其它生物(尤其是人和/或动物)没有过分的毒性的物质。合适的载体或辅剂是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于：稀释剂、保湿剂、表面活性剂、润湿剂、粘着剂等。其中，保湿剂可在喷药后的一定时间内，使叶表面有一定的湿度，以增加药效；表面活性剂可使药剂喷洒在叶的表面后能粘附于叶的表面，尤其蜡质光滑的水葫芦叶表面。

本领域普通技术人员可根据具体需要对这些载体或辅剂进行选择。

本发明的组合物可根据生产、储存和施用等要求，制成液体形式、固体形式(如冻干粉剂形式)或半固体形式(如凝胶形式)。本发明的组合物可通过直接喷洒于水葫芦上或施用在水域中等方式施用。

本发明的组合物中含有本发明的活性成分(a)和活性成分(b)，以及任选的其它活性成分。本发明的组合物中活性成分(a)和(b)占组合物的0.01～10.0(体积比)，优选0.05～5.0，优选0.1～1.0，即可达到良好的防治水葫芦的效果。这些主效成分可抑制水葫芦叶和芽的繁殖，加速叶片的死亡，根系的腐烂，从而起到防治水葫芦的作用。本领域普通技术人员也可根据需要提高本发明组合物中活性成分的含量。

当然，本发明的组合物也可以浓缩组合物的形式存在，在使用前用适当的溶剂(例如水)稀释至所需的给药浓度，该浓缩组合物的制备也在本领域普通技术人员的常规技术范围内。

本发明组合物的施用量通常为0.05～0.6升/平方米/天，优选0.1～0.4升/平方米/天，更优选0.1～0.2升/平方米/天。以活性物质(a)的施用量为基准计，本发明组合物的施用量为10～40mg活性物质(a)/平方米/天，优选10～20mg活性物质(a)/平方米/天。可对水葫芦连续施用本发明的组合物，例如连续施用2～30天，优选5～20天，更优选5～7天。本领域普通技术人员也可根据具体需求(例如水葫芦的密度、所要达到的防治目标)对施用量和施用时间进行调整。

本发明的主要优点

与目前国内常用的化学除草剂相比，本发明的优点如下：

(1)生产成本低，我们采用的药用植物马缨丹的次生代谢产物，通过化学的方法易于合成，由于主效成分均是植物的次生代谢产物，也可以通过植物材料中分离获得。

(2)具有低毒、易降解等环保方面的优点，抑制剂使用肉桂酸、香豆酸或其与其它酚酸类化合物的组合，这些成分均是叶片中的天然产物，并且使用浓度极低，肉桂酸、香豆酸、6-甲基香豆素和水杨酸分别为0.05‰，0.05‰，0.05‰和0.01‰。因此，使用后不造成环境污染。

(3)抑制效果明显，室外以及室内的效果表明，用本发明的抑制剂喷洒水葫芦的叶片，每天喷洒一次，连续喷洒7天，能够有效促进水葫芦叶片的死亡，并抑制新生叶芽的繁殖。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.马缨丹叶水提取液中对水葫芦生长抑制作用的主效成分分析

1.材料及方法

试验材料：采集于广东省广州市的郊区的马缨丹(Lantana camara L)嫩叶

试验方法：称取30g叶片浸泡于100mL去离子水中，室温(25℃±1℃)浸泡48h，16000g离心，上清倒出即为粗提液。将30mL粗提液与30mL 4N NaOH混合，在氮气瓶中水解，室温(25℃±1℃)过夜。过滤所述水解液，滤液用乙醚萃取三次，用浓盐酸将水相调节至pH 2。再次用乙醚萃取水相，并将乙醚相浓缩至10mL用于HPLC分析(安捷伦1200系列)。

采用安捷伦C18反相柱(4.6mm×15cm)，乙腈和5％乙酸水溶液混合溶剂为流动相进行梯度测定，在1.0mL/min的流速下，流动梯度为0％乙腈10min，10％乙腈30min，60％乙腈10min，75％乙腈10min，100％乙腈10min，共70min。准确称取各酚酸类物质(标准品购自百灵威公司)溶于甲醇中，用直径为0.22μm的滤头过滤，采用外标法按照上述梯度进行测定，根据已知化合物色谱峰的保留时间和峰面积来测定马缨丹叶水提液中酚酸类化合物的种类。

2.结果

经HPLC测定马缨丹水提液中含有5种酚酸类物质，即肉桂酸(t-cinnamicacid)、香豆酸(coumaric acid)、二羟肉桂酸(caffeic acid)、水杨酸(salicylic acid)和丁香酸(syringic acid)，其含量分别为0.89mg/g FW(鲜重)、0.49mg/g FW、0.11mg/g FW、0.02mg/g FW、0.02mg/g FW，其中肉桂酸的含量最高，其次是香豆酸，水杨酸和丁香酸含量最低。HPLC图谱如图1所示。

实施例2.含单一酚酸类化合物的新型抑制剂对水葫芦叶片叶绿素含量的影响以及对叶芽繁殖的抑制作用

1材料与方法

1.1试验材料及试剂的制备方法

根据马缨丹叶提取液中抑制水葫芦生长的主效成分(肉桂酸、香豆酸、6-甲基香豆素和水杨酸)，从药剂公司(百灵威公司)购买获得6-甲基香豆素、香豆酸、肉桂酸和水杨酸。称取适量上述各化合物分别溶解于二甲亚砜溶剂(每1mg化合物溶于10μL二甲亚砜)中，制成浓度为浓度100mg/ml的单一酚酸类化合物主效成分母液。

将主效成分母液分别与稀释液[由0.12％(v/v)冰醋酸(HAC)与0.45％(v/w)的醋酸钠加蒸馏水配制而成]、保湿剂(甘油)和表面活性剂(1％的吐温-20)等辅助成分混合，获得含有单一主效成分母液的制剂。其中的配比如下：主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100(体积比)，用醋酸调节pH为5.0-5.2。

1.2叶绿素含量测定

叶绿素的测定与计算参考Arnon等的方法[19]加以修改。用上述配备的含单一酚酸类化合物的四种抑制剂喷洒水葫芦(每天喷洒一次)，三天后选取从中心叶芽开始的第4片叶测定其叶绿素含量。叶片经液氮研磨后加丙酮10ml，过滤后，于Spectrum 752型分光光度计上，663nm和645nm波长处读取光密度，计算出叶绿素的含量，每组实验重复3次。

1.3抑制剂对水葫芦叶、芽生长的抑制作用

水葫芦具有很强的营养生长与繁殖能力，这一特征也是其因过度繁殖而产生生态危害的主要原因，因此，抑制水葫芦的叶的生长与芽的增殖是治理水葫芦的关键。

用上述配备的含单一酚酸类化合物的四种抑制剂进行水葫芦喷洒实验，选取大小、形态相似的水葫芦植株(每株水葫芦大约50g鲜重，7片展开的叶子，根长20cm，水上部分20cm左右)培养于盛有20L Hoagland营养液的塑料盒(40×25×23cm)中，人工气候室中培养实验，温度25-30℃，光照1000-2500lux(model Aplab ML 4420光度计测定)。实验期间塑料盒中培养液通过添加蒸馏水保持恒定的体积。每一盒中放入5棵水葫芦，每3盒为1组，用药剂量为0.15L/m²，每组分别用实施方案中描述抑制剂进行喷洒，每天喷洒一次。同时不喷洒的为对照组。在喷洒7天、14天时统计平均每棵新生芽和叶的数目。

2实验结果

单一酚酸化合物对水葫芦叶绿素含量影响的实验结果如表1所示：

表1.单一酚酸化合物对水葫芦叶绿素含量的影响(平均值±标准差)

叶绿素含量(mg/g鲜重)	对照	6-甲基香豆素	香豆酸	肉桂酸	水杨酸
						叶绿素a	1.49±0.2	0.51±0.1	0.80±0.1	0.83±0.2	0.58±0.1
叶绿素b	0.67±0.2	0.32±0.0	0.33±0.2	0.29±0.1	0.25±0.1
						总叶绿素	2.16±0.3	0.83±0.1	1.13±0.2	1.12±0.1	0.83±0.1

该结果显示：喷洒3天后，水葫芦叶片的叶绿素含量(表1)，明显低于对照，其中只含6-甲基香豆素或水杨酸的新型抑制剂处理的水葫芦叶片中叶绿素含量与对照相比均减少了约60％，只含肉桂酸或香豆酸的新型抑制剂处理的水葫芦叶片叶绿素含量与对照相比减少了约50％。

这说明四种酚酸类化合物作为马缨丹水提液的主效成分均影响叶片的光合作用，这也是本发明生物抑制剂能够抑制水葫芦生长的原因之一。

并且，通过形态观察发现(参见图2)：用含单一化合物的新型抑制剂喷洒水葫芦之后，叶片大部分枯黄，新生芽的数目减少，生长缓慢，抑制效果明显，其中与叶绿素含量测定结果一致，6-甲基香豆素和水杨酸的抑制效果明显一些。

单一酚酸化合物抑制剂对水葫芦叶、芽生长的抑制作用的测定结果如表2A和2B所示：

表2A含单一酚酸类化合物的抑制剂对水葫芦新生叶的影响(平均±标准差)

表2B含单一酚酸类化合物的抑制剂对水葫芦新生芽的影响(平均±标准差)

实验结果显示：用含单一酚酸化合物的抑制剂喷洒水葫芦之后，叶片大部分枯黄(图2)，喷药14天后新生叶和芽的数目的分别减少了58％和38％(表2A和表2B)。上述结果表明：用单一酚酸类化合物可对水葫芦产生抑制作用。

实施例3.新型水葫芦生物抑制剂(LLE 02)对水葫芦生长影响试验(室内)

用与马缨丹叶提取液中含有的能够抑制水葫芦生长的主要成分(包括肉桂酸、香豆酸、6-甲基香豆素和水杨酸)制成为新型的水葫芦生长抑制剂，进行了水葫芦叶面喷洒试验，具体报告如下：

1材料及方法

1.1试验材料：根据马缨丹叶提取液中抑制水葫芦生长的主效成分(如肉桂酸、香豆酸、6-甲基香豆素和水杨酸)，从药剂公司购买获得肉桂酸、6-甲基香豆素、香豆酸和水杨酸。称取适量上述各化合物分别溶解于二甲亚砜溶剂(每1mg化合物溶于10μL二甲亚砜)中，然后将各成分按照等比例混合，制成主效成分母液。将主效成分母液与稀释液[由0.12％(v/v)冰醋酸(HAC)与0.45％(v/w)的醋酸钠加蒸馏水配制而成]、保湿剂(甘油)和表面活性剂(1％的吐温-20)的辅助成分混合，获得本发明的新型制剂LLE 02。组合物中的配比如下：

主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100，用醋酸调节pH为5.0-5.2。

对比抑制剂：按照ZL200410052993.3[12]的实施例1中所述方法制得的马缨丹提取液制剂LLE 01。具体为：取广州市郊区采集的马缨丹叶，于70℃烘干至恒重，研磨成细粉末制成干粉(约小于100目)，在1000毫升水中加30克干粉，在4℃下进行提取过夜，10000g离心15分钟，取上清液，即为马缨丹提取液。向该提取液940ml中，加入甘油50ml及1重量％浓度的吐温-20 10ml，搅拌混匀，用醋酸将pH调节至5.6，记得液体水葫芦生物抑制剂LLE 01。

1.2试验方法

水葫芦[Eichhornia crassipes(Mart.)Solms]采集于上海市嘉定区华亭镇的河道中，再于中科院植物生理生态所的人工气候室中进行生长繁殖。

选取大小、形态相似的水葫芦植株(每株水葫芦鲜重约50g，具有7片展开的叶子，根长约20cm，水上部分约20cm左右)培养于盛有20L Hoagland营养液的塑料盒(40cm×25cm×23cm)中，人工气候室中培养实验，温度25-30℃，光照强度为1000～2500lux(model Aplab ML 4420光度计测定)。实验期间，通过添加蒸馏水，保存塑料盒中培养液体积恒定。每一盒中放入5棵水葫芦，每5盒为1组，用药剂量为0.15L/m²，每组分别用前述的抑制剂进行喷洒，每天喷洒一次，每天对水葫芦新增及死亡叶进行观察统计。将本发明抑制剂的抑制效果与已有专利的马缨丹提取液制剂LLE 01的抑制效果进行对比，每组实验重复3次。

干重测定方法：将处理与对照的水葫芦分别用小纸牌编号挂好后，取出整株水葫芦，于塑料筐中沥干根部吸附的水分后，每5颗分为一组，于烘箱中80～90℃烘至恒重(约72小时)，然后称重并做好记录。

鲜重测定方法：将处理与对照的水葫芦分别用小纸牌编号挂好后，取出整株水葫芦，于塑料筐中沥干根部吸附的水分后，称量每株水葫芦的鲜重，并进行统计分析。

枯叶指数测定和计算方法：每个组处理随机选取20棵水葫芦。为了便于统计叶片的枯死情况，将观察的叶片分为五级，分别为：0级：全叶绿色；1级：绿色面积占叶面积80％以上；2级：绿色面积占叶面积60％-79％；3级：绿色面积占叶面积40％-59％；4级：绿色面积占叶面积20％-39％；5级：绿色面积占叶面积19％以下。

枯叶指数＝∑(各级枯叶数×相对级数值)÷(调查总叶数×5)×100

2实验结果

2.1新型制剂喷洒后叶的反应

图3表明已有专利的马缨丹叶提取液制剂[12](Lantana camara LeafExtract，为了便于描述，以下将该制剂简称为LLE 01)与新型的马缨丹提取液主效成分制剂(以下简称为LLE 02)，均能够导致水葫芦的叶提前衰老死亡，但LLE02的效果更为明显。

表3表明在喷药7天后，LLE 01处理的水葫芦大约有56％左右的叶失绿和死亡，而LLE 02处理的水葫芦大约69％以上的叶都变黄而死亡，根与茎部也开始坏死。喷药14天后，LLE 01与LLE 02处理的水葫芦枯叶指数分别上升为78％与87％，喷药21天后，LLE 01与LLE 02处理的水葫芦枯叶指数分别上升为87％与90％以上。由此可见LLE 02制剂不仅效果明显好于LLE 01制剂，而且见效快。

表3新型水葫芦抑制剂喷洒水葫芦后枯叶指数统计

2.2叶芽增殖的抑制统计结果

针对水葫芦的营养繁殖的研究结果如表4所示。从表4中可以看出喷洒LLE01与LLE 02均能够抑制水葫芦新叶与新芽的产生，喷药7天后，LLE 01处理的水葫芦每颗新增叶片数与新增芽数分别比对照减少了43％与42％，而LLE 02处理的水葫芦每颗新增叶片数与新增芽数分别比对照减少了46％与57％。喷药14天后，LLE 01处理的水葫芦每颗新增叶片数与新增芽数分别比对照减少了61％与50％，而LLE 02处理的水葫芦每颗新增叶片数与新增芽数分别比对照减少了69％与60％。通过统计学分析LLE 02对于水葫芦叶与芽的增殖的抑制效果明显强于LLE 01制剂。

表4新型制剂(LLE 02)与已有专利的马缨丹叶提取液(LLE 01)制剂

对水葫芦叶、芽增殖抑制作用比较(平均值±标准差)

并且，与实施例2中单一酚酸化合物对水葫芦叶芽的抑制作用相比，LLE 02处理的水葫芦每颗新增叶片数与新增芽数分别比对照减少了69％与60％(表4)，这说明含多种酚酸类化合物的新型抑制剂LLE 02共同作用的效果要好于单一的酚酸类化合物，尤其是14天以上的喷洒效果，LLE02对水葫芦的抑制作用(表4)明显好于单一酚酸类化合物(表2A和B)。

实施例4.新型抑制剂对水葫芦叶片的叶绿素含量的影响

1材料与方法

1.1试验材料及试剂的制备方法：实验材料及试剂制备方法同实施例3，主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100，用醋酸调节pH为5.0-5.2。主效成分母液包括：100mg/ml肉桂酸，100mg/ml香豆酸和50mg/ml水杨酸溶解于二甲亚砜溶剂中，稀释液为0.1mol/L的醋酸(HAC)缓冲液，pH为5.2，保湿剂为甘油，表面活性剂的成分是1％的SDS水溶液。

1.2叶绿素含量测定叶绿素的测定与计算参考Arnon等的方法[19]加以修改。用实施例1中描述的方法制备新型抑制剂，喷洒水葫芦三天后，选取从中心叶芽开始的第2片叶为嫩叶，第5片叶为老叶，大约2g，液氮研磨后加丙酮10ml，过滤后，于Spectrum 752型分光光度计上，663nm和645nm波长处读取光密度，计算出叶绿素的含量，每组实验重复3次。

2实验结果

实验表明，喷洒3天后，水葫芦叶片的叶绿素含量，明显低于对照，发现处理过的幼嫩叶片和老叶片中叶绿素含量与对照相比均明显下降，其中幼嫩叶片下降了40％左右，老叶片叶绿素含量下降了30％左右(表5)。叶绿素含量的减少，影响了叶片的光合作用，这也是本发明生物抑制剂能够抑制水葫芦生长的原因之一。

表5.新型抑制剂喷洒对水葫芦叶片叶绿素含量的影响

(平均值±标准差)

实施例5.不同浓度梯度的新型抑制剂对水葫芦的抑制作用

1材料和方法

1.1试剂的制备方法

试剂制备方法同实施例3，主效成分母液包括100mg/ml 6-甲基香豆素，100mg/ml肉桂酸，100mg/ml香豆酸和100mg/ml水杨酸溶解于二甲亚砜溶剂中，稀释液为0.1mol/L的醋酸缓冲液，pH 5.2，保湿剂为甘油，表面活性剂的成分是1％的SDS水溶液。

根据配比中主效成分母液所占比例的不同配置不同的浓度梯度。配备三个浓度梯度，配比依次为主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100；主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝2∶9398∶500∶100；主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝10∶9390∶500∶10.并根据其主效成分的含量命名为LLE 02-0.01‰，LLE 02-0.05‰，LLE 02-0.10‰。

1.2方法

用上述三种浓度梯度的新型抑制剂进行水葫芦喷洒实验，选取大小、形态相似的水葫芦植株(每株水葫芦大约50g鲜重，7片展开的叶子，根长20cm，水上部分20cm左右)培养于盛有20L Hoagland营养液的塑料盒(40×25×23c m)中，人工气候室中培养实验，温度25-30℃，光照1000-2500lux(model Aplab ML4420光度计测定)。实验期间塑料盒中培养液通过添加蒸馏水保持恒定的体积。每一盒中放入5棵水葫芦，每3盒为1组，用药剂量为0.15L/m²，每组分别用实施方案中描述抑制剂进行喷洒，每天喷洒一次。同时不喷洒的为对照组。在喷洒7天，14天时统计平均每棵新生芽和叶的数目。

2实验结果

如表6，用三种浓度梯度的新型抑制剂LLE 02喷洒水葫芦均能有效抑制水葫芦新叶与新芽的产生，其中最低浓度的新型抑制剂LLE 02-0.01‰处理7天后水葫芦每棵新增叶片数和新增芽数与对照相比分别下降了约50％与40％，且随着主效成分浓度的提高抑制效果有所增加。新型抑制剂LLE 02-0.01‰喷洒14天后，水葫芦每棵新增叶片数和新增芽数与对照相比均分别下降了约63％与50％。并且，主效成分有效浓度为0.01-0.10‰的新型抑制剂均可有效抑制水葫芦，且其抑制效果与浓度成正比，用户可根据实际情况选取合适的配比浓度。

表6.不同浓度的抑制剂LLE 02对水葫芦叶和芽生长影响(平均值±标准差)

实施例6.新型抑制剂对水葫芦叶中过氧化物酶的活性的影响

1材料与方法

1.1试验材料及试剂的制备方法：实验材料及试剂制备方法同实施例4，主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100，用醋酸调节pH为5.0-5.2。主效成分母液包括：100mg/ml肉桂酸，100mg/ml香豆酸和50mg/ml水杨酸溶解于二甲亚砜溶剂中，稀释液为0.1mol/L的醋酸缓冲液(pH为5.2)，保湿剂为甘油，表面活性剂的成分是1％的SDS水溶液。

1.2过氧化物酶活性测定：测定方法参照Vecchi LD(1977)的方法[18]。用新型抑制剂(LLE 02)喷洒水葫芦三天后，选取第4张叶片测定过氧化物酶活性，液氮研磨，加5mL Tris-HCl缓冲液磨成匀浆，10000×g离心15min后，取上清液作为待测酶液。测定酶活反应体系，3mL反应混合液(0.2M磷酸缓冲液50mL，过氧化氢0.028mL，愈创木酚0.019mL)加入酶液0.1mL后立即计时，每隔1min测定OD₄₇₀，以每分钟内OD₄₇₀变化0.01为一个POD活性单位(U)。

2试验结果

如图4所示，新型制剂(LLE 02)与已有专利的马缨丹叶提取液(LLE 01)处理三天后，水葫芦叶片过氧化物酶活性明显升高，约提高了一倍。可能是抑制剂对水葫芦是一种胁迫，叶片中H₂O₂积累(图5，叶片染色情况反映出H₂O₂积累程度，颜色越深表示H₂O₂积累越多)，表现为POD活性的增高。过氧化氢不仅具有损伤生物大分子产生细胞毒害的能力，而且还被证明可以作为信号分子，在气孔运动、生物和非生物胁迫应答、细胞程序性死亡、激素应答以及生长发育调控过程中起重要作用[17]。这可能是本发明的抑制剂抑制水葫芦的快速繁殖并加速其死亡的生物学机理的一个方面。

实施例7.新型水葫芦生物抑制剂对嘉定区野外河道中的水葫芦生长影响试验

1材料与方法

1.1试验材料：实验材料及试剂制备方法同实施例3。主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100，用醋酸调节pH为5.0-5.2。主效成分母液包括：100mg/ml 6-甲基香豆素和50mg/ml水杨酸溶解于二甲亚砜溶剂中，稀释液为0.1mol/L的醋酸缓冲液(pH 5.2)，保湿剂为甘油，表面活性剂的成分是1％的SDS水溶液。

1.2试验方法：分别于2008年5-11月期间在上海市嘉定区华亭镇的面积约为3-4亩的河道中，首先采用人工放养的方法在河道中养殖水葫芦，7-9月间水葫芦长满了整河道的水面后，进行药剂喷洒实验，用药量为0.20L/m²，连续喷洒7天(每天喷洒次数一次)，后分别于10天，20天，30天，60天观察统计水葫芦的生长情况。干重和鲜重的测定和统计方法同实施例3。

2试验结果

经观察水葫芦的密度为30棵/平方米左右。用抑制剂LLE 02喷洒20天后，98％的老叶死亡，50％左右的叶芽死亡，水葫芦的开花结籽受到明显抑制(图6和图7)，新增叶片数目比对照减少约90％，叶片长度比对照减少50％左右(图7)。喷药后30天，对水葫芦的鲜重与干重进行了统计，结果显示鲜重比对照减少了50％，干重比对照减少了45％，与抑制剂LLE 01相似(表7)。在喷药停止后，2个月水葫芦的生长虽然有所恢复但仍然明显小于对照(图6，图8)。

表7.新型药剂(LLE 02)处理后30天水葫芦鲜重与干重的变化(平均数±标准差)

试剂名称	统计植株数(棵)	鲜重(g/棵)	干重(g/棵)
				LLE 02	54	83±20	6.8±1.1
LLE 01	32	93±13	6.1±1.1
				对照	33	168±46	12.3±2.1

实施例8.新型水葫芦生物抑制剂对松江区野外池塘中的水葫芦生长影响试验

1材料与方法

1.1试验材料及试剂的制备方法：实验材料及试剂制备方法同实施例4，主效成分母液∶稀释液∶保湿剂∶表面活性剂＝1∶9399∶500∶100，用醋酸调节pH为5.0-5.2。主效成分母液包括：100mg/ml肉桂酸，100mg/ml香豆酸和50mg/ml水杨酸溶解于二甲亚砜溶剂中，稀释液为0.1mol/L的醋酸缓冲液(pH 5.2)，保湿剂为甘油，表面活性剂的成分是1％的SDS水溶液。

1.2试验方法：分别于2009年6-11月期间，在上海市松江区新桥镇的一个封闭池塘内进行实验，池塘的面积约为1亩。每个处理在一个泡沫板围成的区域(面积为3m²)内进行，每个处理平均隔成3个小区域作为平行组，起初每个小区域内放入30棵长势一致的水葫芦(每棵7张叶片，根长20cm左右)。每日中午进行喷洒(喷洒剂量0.15L/m²)。喷洒两周后每个处理组中随机选取30棵水葫芦统计干重，拍照与统计枯叶指数，每组实验重复3次。

1.3枯叶指数统计：试验调查中叶片采用分级统计方法，分级标准如下：

0级：全叶绿色；1级：绿色面积占叶面积80％以上；2级：绿色面积占叶面积60％-79％；3级：绿色面积占叶面积40％-59％；4级：绿色面积占叶面积20％-39％；5级：绿色面积占叶面积19％以下，计算公式如下：

枯叶指数＝∑(各级枯叶数×相对级数值)÷(调查总叶数×5)×100

2试验结果

喷洒对水葫芦繁殖有明显的抑制作用，喷药7天后，两种抑制剂(LLE 01和LLE 02)的枯叶指数均大于55％，喷药14天和21天后枯叶指数均为80％左右(图9，表8)。随机选取30棵水葫芦，同时统计平均每棵干重，抑制剂LLE 01和抑制剂LLE 02喷洒21天后每棵水葫芦的干重分别下降了66％和60％(图10)。由此可见，在封闭的池塘中制剂LLE 02也具有与制剂LLE 01一样的抑制水葫芦生长的作用。

表8.新型水葫芦抑制剂(LLE 02)对封闭池塘中水葫芦叶的影响

实施例9.水葫芦生物抑制剂对水体生物的安全性试验

取实施例1中的马缨丹叶水提取液(10g鲜重的马缨丹叶于100ml去离子水中提取)委托上海水产大学进行了对水体生物的安全性试验。试验对象为南美白对虾(P.vanname)与蒙古裸腹蚤(Moina mongolica)。试验用水为曝气自来水。按常规方法测得pH为7.3-7.5，硬度为4.6德国度，试验水温分别为25±0.5℃与22±3℃。本实验制剂对水葫芦叶面喷洒落入40cm深水中最大的浓度为60μl/L。

试验结果是：马缨丹叶水提取液对南美白对虾的安全浓度为235μl/L，对蒙古裸腹蚤的安全浓度为5.1ml/l。由此证明了马缨丹叶水提取液中的各种成分对南美白对虾和蒙古裸腹蚤的毒性非常低。

根据实施例1中HPLC分析测定的结果，本研究用的马缨丹叶中各活性成分的含量(肉桂酸0.89mg/g FW；香豆酸0.11mg/g FW；6-甲基香豆素0.028mg/gFW；水杨酸0.02mg/g FW)计算出每种活性成分的安全浓度如下表：

表9本发明制剂各活性成分的安全浓度

表9表示上述各活性成分全部溶入水中浓度，本制剂使用浓度：肉桂酸、香豆酸、6-甲基香豆素和水杨酸分别为0.05‰，0.05‰，0.05‰和0.01‰，使用量为0.05～0.60升/平方米。如果水深为0.5米(每平方米水的体积为500L)，每天喷洒本制剂1次，制剂全部落入水中，每升水中将含有本制剂的各活性成分分别为：肉桂酸、香豆素与6-甲基香豆素的浓度为5×10^-6mg至6×10^-5mg，水杨酸的浓度为10^-6mg。与表9中各活性成分的安全浓度相比，连续使用本制剂7-10天对于南美白对虾与蒙古裸腹蚤是安全的。

实施例10.制剂成本计算

本发明制剂还具有原料容易获得、成本低廉的优势。以含0.01g肉桂酸、水杨酸、香豆酸、6-甲基香豆素为主效成分；50ml甘油为保湿剂；6g HAC为稀释剂；0.1g SDS为表面活性剂的制剂为例，计算成本如下：

原料单价：

甘油4元/L；HAC 10元/kg；SDS 10元/kg；肉桂酸40元/kg；水杨酸20元/kg；香豆酸50元/kg；6-甲基香豆素50元/Kg。

1L制剂的原料用量及成本：

甘油50ml(0.2元)；HAC 6g(0.06元)；SDS 0.1g(0.001元)；肉桂酸、水杨酸、香豆酸、6-甲基香豆素各0.01g(总共0.0016元)

合计：0.206元/L，喷洒量约为0.15L/m2/d

通过上述计算可知，采用本发明制剂的成本非常低廉，尤其在大规模使用时可极大减低总体成本。

实施例结论

综合上述10个实施例的结果，得到如下的结论：

本发明人通过分析马缨丹叶提取液明确了其主效成分主要为肉桂酸、香豆酸、水杨酸和6-甲基香豆素，并通过进一步研究证明了这些单一酚酸化合物对水葫芦具有一定的抑制作用。

在此基础上，发明人选取马缨丹叶提取液的主要作用成分，按一定的比例进行配比形成新的水葫芦生物抑制剂(LLE 02)。该制剂与马缨丹提取液相比能够抑制水葫芦叶芽的生长，降低水葫芦叶片中叶绿素的含量，增加叶片中过氧化氢的含量，加速水葫芦叶片的衰老死亡。

本发明的新制剂成分清楚，生产过程更简单，质量也容易控制，喷洒的效果更为稳定。对野外开放的河道与封闭的池塘中的水葫芦生长均有明显的抑制作用，可以作为水葫芦治理的制剂。本制剂的主效成分是马缨丹叶的次生代谢产物，是天然产物，对于环境安全，且活性强，所以本试剂制剂(LLE 02)作为水葫芦的天然植物源除草剂具有潜在的应用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims

1.一种用于防治水葫芦的组合物，所述组合物包含对水葫芦具有防治作用的活性成分和农药学上可接受的载体或辅剂，其中，所述活性成分由以重量份计10：10：10：10的肉桂酸、香豆酸、水杨酸和6-甲基香豆素组成。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述农药学上可接受的载体或辅剂选自：稀释剂、保湿剂、表面活性剂或助溶解剂。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的活性成分、稀释剂、保湿剂和表面活性剂之间的体积比为1：(5000-15000)：(100-1000)：(1-200)。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述肉桂酸、香豆酸和水杨酸的体积之和占所述组合物总体积的0.01～10.0‰。

5.一种制备防治水葫芦的组合物的方法，所述方法包括混合以下对水葫芦具有防治作用的活性成分和农药学上可接受的载体或辅剂，其中，所述活性成分由以重量份计10：10：10：10的肉桂酸、香豆酸、水杨酸和6-甲基香豆素组成。

6.一种防治水葫芦的方法，所述方法包括将权利要求1-4中任一项所述的组合物施用到水葫芦上、施用到长有水葫芦的区域或可能会长有水葫芦的区域中。

7.肉桂酸和/或其衍生物香豆酸在制备防治水葫芦的组合物中的用途。