CN106074402A - 一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。该猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品中每1000mlPBS包含以下组分：枸杞多糖5‑10g、黄芪皂苷1‑4g、穿心莲内酯1‑2g、香菇多糖4‑8g、脂质体5‑10g和冻干保护剂10‑30g。本发明具有以下有益效果：1）本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异。2）本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪细小病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。

Description

一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法。
背景技术
猪细小病毒（Porcine parvovirus , PPV ）属于细小病毒科( Paruovirdae )细小病毒属（Parvovirus），是引起猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一，尤其是初产母猪的繁殖障碍，表现为母猪受胎率降低，产活仔数减少和（或）出现早产、流产、畸形胎、死胎、木乃伊胎、弱仔等。目前该病已遍布全世界，且猪是唯一的易感动物，给养猪业带来巨大的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展。PPV具有单一的血清型，免疫接种是预防本病的主要措施。
脂质体是由脂质双分子层组成的、内部为水相的闭合囊泡，将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状药物载体制剂。该制剂具有生物膜的功能和特性，不仅可以提高药物的靶向性、降低药物毒性和提高被包封药物的稳定性，还可以作为具有生物降解性和生物相容性载药系统。脂质体进入机体后被吞噬细胞摄取，集中于主要免疫器官，有利于将抗原传递给抗原处理细胞或其他免疫活性细胞，来促进激活、增强细胞免疫和体液免疫。
黄芪是一味重要的中药，具有益卫固表、利水清肿、托毒生肌、补中益气等功效，民间常用于治疗自汗、盗汗、血痹、浮肿、痛疽不溃或溃久不敛、内份带虚、脾虚泄泻及一切气衰血虚之症。黄芪皂苷为黄芪的主要活性成分之一，黄芪皂苷不仅可以促进淋巴增殖和抗体的增加，还能促进体液和细胞免疫应答反应。
多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具 有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。
兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是批次间的稳定性，然而在实际生产过程中难以控制半成品的批次间稳定性，究其原因主要是在接种活体生物时的比例不确定，也就是说接种量不稳定导致生产出半成品有较大的差异，本发明宗旨在于减少猪细小病毒增殖过程中批次间差异，促进病毒的繁殖，提高病毒的病毒含量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS包含以下组分：枸杞多糖5-10g、黄芪皂苷1-4g、穿心莲内酯1-2g、香菇多糖4-8g、脂质体5-10g和冻干保护剂10-30g。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS包含以下组分：枸杞多糖6-8g、黄芪皂苷2-3g、穿心莲内酯1-2g、香菇多糖5-7g、脂质体6-8g和冻干保护剂12-26g。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤得到：称取大豆卵磷脂和胆固醇，加入无水乙醇中， 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的磷酸盐缓冲液，超声处理即得脂质体。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的冻干保护剂由海藻糖和蔗糖按照重量比3-6:4-5混合得到。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于称取大豆卵磷脂4-5g和胆固醇1-3g，并加入500-700ml的无水乙醇中；向脂质体膜中加入200-300ml的pH 7的磷酸盐缓冲液。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：取所述重量的各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到猪细小病毒病弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品。
所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
本发明涉及的组分均为现有产品，其中枸杞多糖购于西安欣禄生物科技有限公司，黄芪皂苷购于成都普瑞法科技开发有限公司，穿心莲内酯购于彭州市茂源生物科技有限公司，香菇多糖购于西安欣禄生物科技有限公司。
本发明具有以下有益效果：
1）本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异。
2）本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪细小病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：pH 7磷酸盐缓冲液的制备
取氯化钠8g、氯化钾0.3g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.3g、氯化钙0.3g、含6个结晶水的氯化镁0.1g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例2：pH 7磷酸盐缓冲液的制备
取氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例3：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂4g和胆固醇2g，放入至烧杯中，并加入无水乙醇500ml中, 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的磷酸盐缓冲液200ml（实施例1制得），超声处理即得脂质体。
实施例4：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂5g和胆固醇2.5g，放入至烧杯中，并加入无水乙醇625ml中, 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的磷酸盐缓冲液250ml（实施例2制得），超声处理即得脂质体。
实施例5：一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
取枸杞多糖5g、黄芪皂苷2g、穿心莲内酯1g、香菇多糖4g、脂质体（实施例3制得）5g、海藻糖6g和蔗糖8g充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例1制得）中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品。
实施例6：一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
取枸杞多糖7g、黄芪皂苷3g、穿心莲内酯1g、香菇多糖6g、脂质体（实施例3制得）7g、海藻糖12g和蔗糖10g充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例1制得）中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品。
实施例7：一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备
取枸杞多糖9g、黄芪皂苷4g、穿心莲内酯2g、香菇多糖8g、脂质体（实施例4制得）8g、海藻糖12g和蔗糖12g充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例2制得）中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品。
试验例1 本发明脂质体稀释液冻干制品的应用
1材料
1.1猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品
按本发明实施例5-7制得。
1.2 猪细小病毒（BQ-C株），PK-15细胞，购自ATCC。
1.3 豚鼠 500g左右，购自浙江省试验动物中心，试验前均经PPV HI 抗体检测为阴性。
2 方法
2.1包封率的测定
分别取空白的冻干脂质体和处理过的脂质体冻干粉，用磷酸盐缓冲液进行复溶，超速离心，取上清，按一定比例稀释，测定其吸光度（参考兽药典），平均每个样品测3次，算其平均值。
2.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干粉复溶后，在透射电镜（×20000）下观察
2.3 细胞培养及接毒
按常规细胞培养方法培养PK-15细胞；在细胞传代后分为12瓶，共分4组，每组3瓶，将本发明实施例3-5制备的脂质体稀释液冻干制品置于磷酸盐缓冲液进行复溶，分别将A、B、C 3种不同批次的病毒稀释成1000 TCID50/ml、1500 TCID50/ml、2000 TCID50/ml ，进行接种。第一组，采用本发明实施例5制备的脂质体稀释液对3种不同批次的PPV进行稀释接种；第二组，采用本发明实施例6制备的脂质体稀释液对3种不同批次PPV进行稀释接种；第三组，采用本发明实施例7制备的脂质体稀释液对3不同批次PPV进行稀释接种；第四组，对照组，采用无血清的细胞培养液对3不同批次PPV进行稀释接种，将以上各组分别置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养60h、72h和80h之后进行收毒。
2.4 TCID50测定
将传代消化后的细胞稀释成105～106 个/m L之后，转入96孔培养板中，按 0. 2 m L/孔；将收获的四组病毒液分别作连续的10倍稀释 ，按0.2 mL /孔 接种，置37℃、5% CO2中培养，每天观察细胞病变并记录，按Reed-Muench 法计算TCID50。
2.5 免疫原性测定
收获2.3提到的培养72h 任一批次四组病毒液经检验合格，分别进行灭活、乳化后制作成疫苗成品用来测定疫苗的免疫原性。选用20只豚鼠（PPV HI抗体为阴性），分4组，每组5只。第Ⅰ组采用经本发明实施例5制备的脂质体稀释液处理过的PPV灭活乳化后制成的疫苗进行免疫；第Ⅱ组采用经本发明实施例6制备的脂质体稀释液处理过的PPV灭活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅲ组为采用经本发明实施例7制备的脂质体稀释液处理过的PPV灭活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅳ组，疫苗对照组，未经脂质体处理灭活后制成的疫苗免疫；各组均按0.2ml/只进行免疫，14d后再以同等剂量加强免疫一次。在首免一周后采血，每隔7d采一次血，直至第49d，采血后分离其血清，测其PPV HI抗体。
3 结果
3.1包封率结果
按照公式：包封率（％）＝系统中包封的药量（A1）/ 系统中包封与未包封的总药量（A2）×100％，结果见表1。
表1包封率测定结果
3.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干制品为单室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致。
表2 形态观察和粒径测定结果
3.3TCID50测定结果
表3 TCID50测定结果
3.4HI测定结果
备注:“-”表示HI抗体效价太低，测定不出来。
4 结论
综上所述，本发明猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制作工艺具有很好的重复性，该脂质体稀释液冻干制品不仅可以降低半成品间的批次差异，还可以促进猪细小病毒的繁殖，提高其病毒含量，增强疫苗的免疫原性。

Claims (8)

1.一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS包含以下组分：枸杞多糖5-10g、黄芪皂苷1-4g、穿心莲内酯1-2g、香菇多糖4-8g、脂质体5-10g和冻干保护剂10-30g。
2.如权利要求1所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS包含以下组分：枸杞多糖6-8g、黄芪皂苷2-3g、穿心莲内酯1-2g、香菇多糖5-7g、脂质体6-8g和冻干保护剂12-26g。
3.如权利要求1或2所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤得到：称取大豆卵磷脂和胆固醇，加入无水乙醇中， 在60℃水浴下搅拌至完全溶解，形成均一溶液；通过减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，使壁上形成均匀脂质体膜，向脂质体膜中加入pH 7的磷酸盐缓冲液，超声处理即得脂质体。
4.如权利要求1或2所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的冻干保护剂由海藻糖和蔗糖按照重量比3-6:4-5混合得到。
5.如权利要求3所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于称取大豆卵磷脂4-5g和胆固醇1-3g，并加入500-700ml的无水乙醇中；向脂质体膜中加入200-300ml的pH 7的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求5所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
7.如权利要求1-6任一所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：取所述重量的各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到猪细小病毒病弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品。
8.如权利要求7所述的一种猪细小病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
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