CN106727985B - 一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液 - Google Patents

一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒病活疫苗稀释液，其每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物1‑5g、枸杞多糖5‑10g、黄芪皂苷Ⅱ 20‑80mg和聚肌胞1‑5g。本发明猪细小病毒病活疫苗用稀释液不仅生产方便，成本低，使用方便安全，还可以降低不同批次疫苗间的差异，提高疫苗免疫的整体效果。

Description

一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
背景技术
猪细小病毒（Porcine parvovirus , PPV）属于细小病毒科( Paruovirdae )细小病毒属（Parvovirus），是引起猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一，尤其是初产母猪的繁殖障碍，表现为母猪受胎率降低，产活仔数减少和/或出现早产、流产、畸形胎、死胎、木乃伊胎、弱仔等。该病毒在环境中可存活数月之久，且对大多数消毒剂具有较强抵抗力，目前该病毒已遍布全世界，给养猪业带来巨大的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展。PPV具有单一的血清型，免疫接种是预防本病的主要措施。
猪细小病毒病活疫苗在使用时需要用疫苗稀释剂进行稀释，目前通常选用注射用水或生理盐水，但这样稀释出的疫苗，免疫效价整齐度不高，不同批次疫苗间的差异较大，且接种发病猪后存在应激反应和过敏反应，大大降低了猪细小病毒病活疫苗的免疫效果。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液，该稀释液可有效减少不同批次疫苗间的差异，提高疫苗抗体效价整齐度，减少接种发病猪的应激反应和过敏反应。
为解决上述技术问题，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物1-5g、枸杞多糖5-10g 、黄芪皂苷Ⅱ 20-80mg和聚肌胞1-5g。
进一步的，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物2-4g、枸杞多糖6-8g 、黄芪皂苷Ⅱ 30-60mg和聚肌胞2-3g。
进一步的，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物3g、枸杞多糖7.5g 、黄芪皂苷Ⅱ 50mg和聚肌胞2.5g。
其中，本发明所述双花连翘提取物的提取包括以下步骤：按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入10-12倍量50-60%的乙醇，超声提取10-15min，收集提取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
其中，本发明所述枸杞多糖的制备包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：8-15加入蒸馏水，以300-350W的功率微波提取5-10min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
其中，本发明所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
本发明中黄芪皂苷Ⅱ由成都曼斯特生物科技有限公司生产销售， 聚肌胞由南京奥多福尼生物科技有限公司生产销售。
本发明的有益效果：
中药免疫增强剂主要为补益类药物，可以通过激活一种或多种免疫活性细胞，增强机体的免疫功能，使低下的免疫功能上调至正常水平。还可以作为辅助药物与一些疫苗合用，增强免疫应答，提高免疫效应。本发明所提供的稀释液中添加有姬松茸多糖、穿心莲提取物、人参皂苷Rh2和姜黄素，均为中药免疫增强剂，通过各组分科学合理的配比，可有效激活机体免疫活性细胞，增强免疫性能。因为本发明不仅可以降低疫苗批间差异性，提高整体免疫水平，还可以提高疫苗的免疫效果，延长疫苗保护期。此外，本发明易生产，成本低廉，且使用方便。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。本发明中所述实施例仅用于说明解释本发明而不对本发明的范围构成限制。
实施例1:
1、制备双花连翘提取物，包括以下步骤：
按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入10倍量60%的乙醇，超声提取15min，收集提取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
2、制备枸杞多糖，包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：8加入蒸馏水，以300W的功率微波提取10min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠6g、氯化钾0.05g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.05g、氯化钙0.05g和六水氯化镁0.05g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：双花连翘提取物1g、枸杞多糖5g 、黄芪皂苷Ⅱ 20mg和聚肌胞1g；
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
实施例2：
1、制备双花连翘提取物，包括以下步骤：
按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入12倍量50%的乙醇，超声提取10min，收集提取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
2、制备枸杞多糖，包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1： 15加入蒸馏水，以350W的功率微波提取5min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g和六水氯化镁0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：双花连翘提取物5g、枸杞多糖10g 、黄芪皂苷Ⅱ 80mg和聚肌胞5g；
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
实施例3：
1、制备双花连翘提取物，包括以下步骤：
按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入11倍量55%的乙醇，超声提取13min，收集提取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
2、制备枸杞多糖，包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：10加入蒸馏水，以330W的功率微波提取8min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠8g、氯化钾0.35g、磷酸氢二钠1.1g、磷酸二氢钾0.25g、氯化钙0.12g和六水氯化镁0.15g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：双花连翘提取物3g、枸杞多糖7.5g 、黄芪皂苷Ⅱ 50mg和聚肌胞2.5g。
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
免疫效果对比试验：
利用本发明实施例1至3所制备的猪细小病毒病活疫苗用稀释液分别将猪细小病毒病活疫苗稀释至1头份/ml，备用。利用PH=7的磷酸盐缓冲液将猪细小病毒病活疫苗稀释至1头份/ml，备用。将50头经检测猪细小病毒病抗体、抗原呈双阴性的28日龄健康断奶仔猪分为五组，每组10头，A组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；B组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；C组注射实施例3制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；D组注射用pH=7的磷酸盐缓冲液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；E组作为空白对照组，注射pH=7的磷酸盐缓冲液1.0ml/头。各组分别在免疫后7d、14d、21d、28d、60d、90d、150d和180d采血，分离血清，测其PPV HI抗体，结果如表1所示。
表1 HI测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：“-”表示HI抗体效价低于检测限。
安全性试验：
利用本发明实施例1至3所制备的猪细小病毒病活疫苗用稀释液分别将猪细小病毒病活疫苗稀释至1头份/ml，备用。将70头经检测猪细小病毒病抗体、抗原呈双阴性的28日龄健康断奶仔猪分为七组，每组10头，第一组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗3.0ml/头；第二组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗5.0ml/头；第三组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗3.0ml/头；第四组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗5.0ml/头；第五组注射实施例3制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗3.0ml/头；第六组注射实施例3制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗5.0ml/头；第七组不注射，作为对照组。免疫后进行跟踪观察5天，观察记录猪的体温、采食、精神状况及生长发育情况，结果如表2所示。
表2 安全性测试结果
Figure 460034DEST_PATH_IMAGE002
注：无体温升高，采食、精神状况及生长发育情况即可视为正常。
综上可知，本发明不仅生产方便、成本低廉、使用方便安全，还可有效降低不同批次疫苗间的差异，提高疫苗免疫的整体效果。
需说明的是，本发明中所用黄芪皂苷Ⅱ购买于成都曼斯特生物科技有限公司，聚肌胞购于南京奥多福尼生物科技有限公司。本发明中未提及的具体实验方法，按常规实验方法进行。

Claims (4)

1.一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中由双花连翘提取物1-5g、枸杞多糖5-10g 、黄芪皂苷Ⅱ 20-80mg和聚肌胞1-5g组成；
所述双花连翘提取物的提取由以下步骤制得：按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入10-12倍量50-60%的乙醇，超声提取10-15min，收集提取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物；
所述枸杞多糖的制备由以下步骤制得：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：8-15加入蒸馏水，以300-350W的功率微波提取5-10min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
2.根据权利要求1所述的一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物2-4g、枸杞多糖6-8g 、黄芪皂苷Ⅱ 30-60mg和聚肌胞2-3g。
3.根据权利要求1所述的一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物3g、枸杞多糖7.5g 、黄芪皂苷Ⅱ 50mg和聚肌胞2.5g。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液，其特征在于所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
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