CN103110942B - 一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法，包含病毒液灭活、复方中药提取物的制备、水相制备、油相制备、乳化步骤。该制备方法将复方中药提取物作为免疫增强剂添加到灭活的鸡新城疫疫苗中，可引起较好的细胞免疫应答，能增强机体的免疫功能，使抗体提早产生，并明显提高抗体滴度。

Description

一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及属于兽用生物制品培育技术领域，涉及一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法，具体涉及一种将复方中药提取物作为免疫增强剂添加到灭活鸡新城疫疫苗中制备灭活鸡新城疫疫苗的方法。

背景技术

免疫增强剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。现存生物性、细菌性、化学性、营养性的免疫增强剂中，许多具有较好的佐剂活性，但是还存在许多弊端。铝盐佐剂虽然能吸附抗原缓慢释放，较长时间刺激免疫细胞，增强机体的体液免疫反应，但也有许多不足，不适用于许多新型疫苗。首先铝盐佐剂不能冻干，其次其制备的铝胶批次间差异很大，既难以控制质量，又难以对佐剂效果作出准确评价，再次铝盐佐剂主要刺激相关抗体的产生，不能刺激细胞活性，即只能增强体液免疫，不能增强细胞免疫，而且会增加超敏反应的危险；弗氏完全佐剂是细胞免疫的强刺激剂，弗氏不完全佐剂能刺激体液免疫，这两种佐剂均能引起慢性肉芽肿和溃疡，且有对结核菌素致敏以及潜在的致癌作用等毒副作用，限制了其使用范围；细胞因子类免疫增强剂，如IL-2、FIN等虽然有较好的免疫增强效果，但是生产成本很高，虽作用产生快，但持续时间短，而且它们毕竟是外源性的免疫物质，对机体有不同程度的影响，长期使用还会降低机体对其的敏感性；其他一些微生物类免疫增强剂以及脂质体等均存在多方面的缺陷和不足，研制开发安全有效的新型免疫增强剂是非常必要的。

我国中药资源丰富、品种繁多。据报道，我国中草药的品种达12807种，其中植物药11146种，动物药1581种，矿物药80种，居世界之首；其中近200种中草药具有免疫活性。中药的来源天然性和安全可靠性是举世公认的特点。中药的许多复方、单味乃至有效成分都具有免疫增强作用。近年来国内外学者对中药成分进行了广泛的研究，发现中药的多种成分具有免疫增强作用，例如，多糖类成分能提高机体细胞免疫和体液免疫功能，促进干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子的产生，增强红细胞免疫功能，提高NK细胞、LAK细胞的活性；皂苷类成分能激活T淋巴细胞、巨噬细胞，提高抗体水平，促进细胞因子的表达，调节神经内分泌免疫网络功能；黄酮类成分能增强或调节机体免疫功能，还具有抗肿瘤、抗病毒及防治自身免疫病等作用，因而完全可以开发为新型免疫增强剂。研究表明，从中草药中提取的多糖，如甘草多糖、人参多糖、黄芪多糖、刺五加多糖、牛膝多糖、香菇多糖、灵芝多糖、猪苓多糖、云芝多糖、当归多糖等相继被报道具有免疫增强作用；甙类，如人参皂甙、黄芪皂甙、白芍总甙、淫羊藿甙、雷公藤甙、大豆皂甙等都有免疫增强作用；生物碱及挥发性成分，如苦豆草中分离到的总生物碱及大蒜中提取的大蒜素，都能增强巨噬细胞的吞噬功能；小檗碱、大黄素、丹参素、甘草酸激活单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子，从而增强机体的免疫功能；目前广泛应用的大豆异黄酮等均具有免疫增强作用。

复方中药提取物用作免疫增强剂制备灭活鸡新城疫疫苗，尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法，具体为一种将复方中药提取物作为免疫增强剂添加到灭活鸡新城疫疫苗中制备灭活鸡新城疫疫苗的方法。该疫苗免疫激发功能更强，免疫效力更强，免疫持续期更长。

本发明是通过下述的技术方案来实现的：

一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法，包含如下步骤：

（a）病毒液灭活

（a1）制备病毒液：将新城疫种毒稀释后，摇匀，尿囊腔内接种SPF鸡胚，每胚接种0.1ml，置37℃孵化器继续孵育，收获48～120h死胚及120h后活胚的尿囊液于无菌容器中，取样后置-20℃冻结保存；

（a2）灭活：将结冻保存的胚液化冻，澄清过滤处理后灭活，未冻结保存的直接灭活，分别向胚液桶内加入40%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，然后在37℃灭活24～26小时，期间振摇5～6次；

（a3）灭活阻断：将过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使硫代硫酸钠溶液的终浓度为2%，充分混匀后，置5℃保存，同时取样进行灭活检验；

（b）复方中药提取物的制备

（b1）提取：将复方中药洗净烘干后，经粉碎、过筛，得到40～80目的中药粉末；将中药粉末与蒸馏水按重量1∶4的比例混合后浸泡1～2小时，并在溶液温度55～65℃、超声波功率150瓦下，超声提取40-50分钟；

（b2）精制：将上述提取液过滤，对上清液减压浓缩至原体积的1/3～1/2，向浓缩液中加入95％以上的乙醇，加入量为浓缩液体积的5-8倍，常温静置2～4小时，获得沉淀物；最后，将沉淀物冷冻干燥，粉碎得到复方中药提取物粉末；

（c）水相制备：将复方中药提取物加到灭活好的病毒液中，混匀，得混合溶液，备用；取混合溶液96份，加入0.01%的叠氮钠和0.015%的氧氟沙星晃匀，然后加入20～30℃左右的吐温－80 4份，充分振摇，使吐温－80完全溶解为止，得水相，备用；

（d）油相制备：取注射用白油94份，加硬脂酸铝0.5份，混合后，加司班-80 6份，121℃ 30min高压灭菌，得油相，备用；

（e）乳化：将油相打入乳化罐中，开动混合机低速转动搅拌，同时加入水相，加完后提转速乳化30～100min，即得灭活鸡新城疫疫苗。

步骤（b）中所述的复方中药提取物的中药选自黄芪、枸杞、刺五加、甘草、当归中的任意两种或几种。

本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗免疫学价结果：

本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗，通过RBC-C3bR花环、RBC-IC花环、淋巴细胞数量及ND抗体水平进行评价，本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗与常规疫苗的效果差异十分明显：

①本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗RBC-C3bR花环（6.96±0.166）比常规疫苗组（5.16±0.283）高，与常规疫苗相比差异显著（0.01＜P＜0.05）。

②本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗RBC-IC花环（6.35±0.176）比常规疫苗组（7.64±0.220）低，与常规疫苗相比差异显著（0.01＜P＜0.05）。

③本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗淋巴细胞数量（15.56±4.05）比常规疫苗组（29.37±6.14）低，与常规疫苗相比差异极显著（P＜0.01）。

④本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗ND抗体比常规疫苗组产生早，且比其高约2log2。

分析结果可见，对新城疫灭活疫苗来讲，本发明制备方法制备的灭活鸡新城疫疫苗可引起较好的细胞免疫应答，能增强机体的免疫功能，使抗体提早产生，并明显提高抗体滴度。由此说明，在新城疫灭活疫苗方面，复方中药提取物作为免疫增强剂的效果明显优于常规佐剂。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

  将病毒液加入复方中药提取物，混合后作为抗原，按常规方法加入油佐剂乳化即可获取灭活疫苗。

实施例1：灭活鸡新城疫疫苗的制备

（a）病毒液灭活：

（a1）制备病毒液：将新城疫种毒稀释后，摇匀，采用自动接种机尿囊腔内接种SPF鸡胚，每胚接种0.1ml，置37℃孵化器继续孵育，收获48～120h死胚及120h后活胚的尿囊液于无菌容器中，取样后置-20℃冻结保存；

（a2）灭活：将结冻保存的胚液化冻，澄清过滤处理后灭活，未冻结保存的直接灭活，分别向胚液桶内加入40%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，然后在37℃灭活24～26小时（以放入温室开始计时），期间振摇5～6次；

（a3）灭活阻断：将过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使硫代硫酸钠的终浓度为2%，充分混匀后，置5℃保存，同时取样进行灭活检验。

（b）复方中药提取物的制备

（b1）提取：将黄芪、枸杞、刺五加、甘草、当归各等份洗净烘干后，经粉碎、过筛，得到40～80目的中药粉末；将中药粉末与蒸馏水按重量1∶4的比例混合后浸泡1～2小时，并在溶液温度55～65℃、超声波功率150瓦下，超声提取40～50分钟；

（b2）精制：将上述提取液过滤，对上清液减压浓缩至原体积的1/3～1/2，向浓缩液中加入95％以上的乙醇，加入量为浓缩液体积的5-8倍，常温静置2～4小时，获得沉淀物；最后，将沉淀物冷冻干燥，粉碎得到复方中药提取物粉末，每100g中药粉末可获得提取物约8g。

（c）水相制备：将复方中药提取物加到灭活好的病毒液中，每毫升病毒液中提取物的加量为1.5mg，混匀，得混合溶液，备用；取混合溶液96份，加入0.01%的叠氮钠和0.015%的氧氟沙星晃匀，然后加入20～30℃左右的吐温－80 4份，充分振摇，使吐温－80完全溶解为止，得水相，备用；

（d）  油相制备：取注射用白油94份，加硬脂酸铝0.5份，混合后，加司班-80 6份，121℃ 30min高压灭菌，得油相，备用；

（e）  乳化：将油相打入乳化罐中，开动混合机低速转动搅拌，同时徐徐加入水相，加完后提转速乳化30～100min，即得本发明灭活鸡新城疫疫苗。

实施例2：

检验项目	标准规定	检验结果
			外观	乳白略显黄色乳剂	乳白略显黄色乳剂
剂型	油包水型	油包水型
			黏度	应符合规定	符合规定
稳定性	吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml	无水相析出

A、安全检验

用30～60日龄SPF鸡6只，每只肌肉或颈背部皮下注射疫苗1.0ml,观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。

检验结果：未出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。

B、效力检验：采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

(1）血清学方法  用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下注射疫苗20μl (1/25羽份)，另5只做对照。接种后21～28日，每只鸡各采血分离血清，按中国兽药典》附录进行HI抗体效价测定。对照鸡HI抗体效价均应不高于1∶4，免疫鸡HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶16。

(2）免疫攻毒法  用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl (1/25羽份)，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射新城疫病毒北京株（CVCC AV1611）强毒0.5ml（含105.0ELD50），观察14日。对照鸡应全部死亡，免疫组应至少保护7只。

检验结果：对照鸡HI抗体效价均低于1∶4，免疫鸡HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64。

Claims (1)

1.一种灭活鸡新城疫疫苗的制备方法，包含如下步骤：

（a）病毒液灭活

（a1）制备病毒液：将新城疫种毒稀释后，摇匀，尿囊腔内接种SPF鸡胚，每胚接种0.1ml，置37℃孵化器继续孵育，收获48～120h死胚及120h后活胚的尿囊液于无菌容器中，取样后置-20℃冻结保存；

（a2）灭活：将结冻保存的胚液化冻，澄清过滤处理后灭活，未冻结保存的直接灭活，分别向胚液桶内加入40%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，然后在37℃灭活24～26小时，期间振摇5～6次；

（a3）灭活阻断：将过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使硫代硫酸钠溶液的终浓度为2%，充分混匀后，置5℃保存，同时取样进行灭活检验；

（b）复方中药提取物的制备

（b1）提取：将复方中药洗净烘干后，经粉碎、过筛，得到40～80目的中药粉末；将中药粉末与蒸馏水按重量1∶4的比例混合后浸泡1～2小时，并在溶液温度55～65℃、超声波功率150瓦下，超声提取40-50分钟；

（b2）精制：将上述提取液过滤，对上清液减压浓缩至原体积的1/3～1/2，向浓缩液中加入95％以上的乙醇，加入量为浓缩液体积的5-8倍，常温静置2～4小时，获得沉淀物；最后，将沉淀物冷冻干燥，粉碎得到复方中药提取物粉末；

（c）水相制备：将复方中药提取物加到灭活好的病毒液中，混匀，得混合溶液，备用；取混合溶液96份，加入0.01%的叠氮钠和0.015%的氧氟沙星晃匀，然后加入20～30℃的吐温-80 4份，充分振摇，使吐温－80完全溶解为止，得水相，备用；

（d）油相制备：取注射用白油94份，加硬脂酸铝0.5份，混合后，加司班-80 6份，121℃ 30min高压灭菌，得油相，备用；

（e）乳化：将油相打入乳化罐中，开动混合机低速转动搅拌，同时加入水相，加完后提转速乳化30～100min，即得灭活鸡新城疫疫苗；

步骤（b）中所述的复方中药提取物的中药为等份的黄芪、枸杞、刺五加、甘草和当归。