CN105288615A - 一种疫苗佐剂及利用其制成的佐剂疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药与医学工程技术领域，涉及一种疫苗佐剂及利用其制成的佐剂疫苗。其有效成分为太子参为主料的中药提取物，按下述步骤制得：（i）、将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥后粉碎；（ii）、将步骤（i）获得的中药粉按固液比g/ml=1:10-1:30加入乙醇进行超声；（iii）、将步骤（ii）超声后获得的中药乙醇分散液进行烘干后，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界CO₂萃取，萃取操作参数为：夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1-3%，萃取温度35-50℃，萃取压力10-25MPa，CO₂流量2-4L/h，萃取时间0.5-2h；所述夹带剂为乙醇、乙二醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种。本发明疫苗佐剂，用于免疫小鼠和鸭，小鼠和鸭不仅能健康成长，且其体内抗血清中较长时间内可检测到抗体。

Description

一种疫苗佐剂及利用其制成的佐剂疫苗

技术领域

本发明属于医药与医学工程技术领域，特别涉及一种疫苗佐剂及利用其制成的佐剂疫苗。

背景技术

现代养殖业已成为全球一大产业，且规模呈不断扩展态势。疫苗的应用对于养殖业控制动物疾病的流行起到了非常重要的作用，除传统的减毒疫苗外，新型疫苗不断得到开发利用，如多肽疫苗、DNA疫苗和灭活蛋白疫苗等。这些疫苗虽然比传统疫苗安全，但其和传统疫苗一样都存在免疫原性较弱，致使诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，有必要配合安全高效的佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答。

目前常用的免疫佐剂大致有几十种，如常用的有铝盐及矿物质佐剂（氢氧化铝、氯化钙硫酸锌）、油佐剂（弗式佐剂、白油）、左旋咪哇、蜂胶、转移因子和干扰素等。然而，油乳类和铝盐矿物类化学佐剂副作用较大，皮下注射时常有持续性肉芽肿、不能很好地吸收、也不能有效刺激保护性T细胞免疫。这些反应较多与佐剂引起对特定抗原的免疫应答、产生炎症反应的细胞因子,从而导致炎症反应的产生有关。此外，这一类佐剂在机体内降解吸收慢、残留时间长、影响畜禽的外观及食用安全。因此，开发研制新型免疫佐剂以增强疫苗免疫效力并减少疫苗的毒副作用是未来的发展趋势，理想的佐剂应该有以下特征：①作用于弱免疫性抗原，促进体液或细胞免疫应答，不引起有害的副作用；②能以不同途径免疫，也能用于不同抗原；③在免疫抑制个体中发挥作用；④应用于食用动物不应有毒素残留；⑤能有效影响免疫反应质量；⑥稳定且易生产。

中药是我国的国粹，具有天然、无毒、无副作用的突出特点，一些补中益气中药可提高免疫系统组织细胞的活性、提高机体免疫力，可研究成为新的疫苗佐剂。如鲍国连等人将中药方剂应用到对鸭疫里氏杆菌疫苗的免疫佐剂实验中，证明其可提高受免疫鸭的抗体水平，且对鸭生长没有任何负面影响。另外还有专利ZL201210116643.3、ZL200710027063.6和ZL200810059353.3等分别对中药巴戟天、人参等8种中药、木鳖子的提取物作为主要有效成分用于免疫佐剂，均取得了理想的效果。

中药太子参为石竹科孩儿属植物孩儿参的干燥根，别名孩儿参、童参、双批七、四叶参或米参，为珍贵中药，富含多种人体必需氨基酸、活性多糖和皂苷类化合物等，具有益气生津、补肺健脾的功效，特点为益气但不提升，生津但不助湿，扶正但不恋邪，补虚又不峻猛。主治心悸自汗，疲倦乏力，脾虚食少，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳等症。

发明内容

本发明的目的在于提供一种疫苗佐剂及利用其制成的佐剂疫苗。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种疫苗佐剂，其有效成分为太子参为主料的中药提取物，所述太子参为主料的中药提取物按下述步骤制备而得：

（i）、干燥和粉碎：将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥后，以质量比计，按太子参︰淫羊藿︰黄芪︰灵芝=5-7︰0.5-1.5︰1.5-2.5︰0.5-1.5的固定比例混合并粉碎；

（ii）、超声预处理：将步骤（i）获得的中药粉按固液比g/ml=1:10-1:30加入乙醇进行超声；

（iii）、低温超临界CO₂萃取：将步骤（ii）超声后获得的中药乙醇分散液进行烘干后，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界CO₂萃取，萃取操作参数为：夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1-3%，萃取温度35-50℃，萃取压力10-25MPa，CO₂流量2-4L/h，萃取时间0.5-2h；所述夹带剂为乙醇、乙二醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种；待萃取结束后，减压回收夹带剂，即得太子参为主料的中药提取物。

较好地，步骤（i）中：干燥至水分的质量百分含量不高于10%；粉碎目数为65-80目。步骤（ii）中：乙醇为体积纯度为85%以上的乙醇；超声时的参数为：超声功率50-200W，超声频率20-40kHz，超声时间30-50min。步骤（iii）中：烘干时的温度为60-80℃，夹带剂的体积纯度为80-100%；若夹带剂为多种时，等体积比混合使用。

利用所述疫苗佐剂制备而成的佐剂疫苗：将疫苗佐剂先与无菌去离子水按体积比例1：5-10混匀，获得疫苗佐剂稀释液；再将疫苗佐剂稀释液直接和疫苗混合，即制得佐剂疫苗；其中所述疫苗佐剂在制备得到的佐剂疫苗中所占的体积比为2.5-8%。

较好地，所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗，更优选为鸭疫里氏杆菌减毒疫苗，O型口蹄疫灭活疫苗，O型口蹄疫多肽疫苗或O型口蹄疫DNA疫苗。

本发明采取太子参为主料的中药提取物做疫苗佐剂的有效成分，用于免疫小鼠和鸭，小鼠和鸭不仅能健康成长，且其体内抗血清中较长时间内可检测到高滴度抗体；适用于不同免疫疫苗抗原，具有绿色无残留、长效、稳定等实际应用功效。

附图说明

图1为O型口蹄疫灭活疫苗免疫小鼠后血清抗体效价随时间变化柱形图；

图2为O型口蹄疫多肽疫苗免疫小鼠后血清抗体效价随时间变化柱形图；

图3为O型口蹄疫DNA疫苗免疫小鼠后血清抗体效价随时间变化柱形图；

图4为鸭疫里氏杆菌减毒疫苗免疫鸭后血清抗体效价随时间变化柱形图。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。

以下实施例中的太子参购自于福建省宁德市柘荣县。

实施例1

先将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥，水分质量百分含量不高于10%；干燥后，以质量比计，按太子参︰淫羊藿︰黄芪︰灵芝=5︰1.5︰2︰1.5的固定比例混合并粉碎，粉碎目数为70目；再按固液比g/ml=1:15加入体积纯度85%的乙醇进行超声预处理，超声功率90W，超声频率25kHz，超声时间45min；然后将预处理后的太子参进行60℃烘干，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界CO₂萃取过程，萃取温度45℃，萃取压力25MPa，CO₂流量2.5L/h，萃取时间1.5h，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1.5%，夹带剂为乙二醇；待萃取结束后，减压回收乙二醇，即得太子参为主料的中药提取物。

将太子参为主料的中药提取物先与无菌去离子水按体积比例1：10混匀，且过滤膜除菌；最终将除菌后的太子参为主料的中药提取物稀释液分别与O型口蹄疫灭活疫苗、O型口蹄疫多肽疫苗、O型口蹄疫DNA疫苗及鸭疫里氏杆菌减毒疫苗进行体积比1:25混合制成相应的太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗。

实施例2

先将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥，水分质量百分含量不高于10%；干燥后，以质量比计，按太子参︰淫羊藿︰黄芪︰灵芝=6︰1︰2︰1的固定比例混合并粉碎，粉碎目数为80目；再按固液比g/ml=1:20加入体积纯度85%的乙醇进行超声预处理，超声功率100W，超声频率30kHz，超声时间40min；然后将预处理后的太子参进行60℃烘干，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界CO₂萃取过程，萃取温度40℃，萃取压力20MPa，CO₂流量3L/h，萃取时间1h，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为2%，夹带剂为无水乙醇；待萃取结束后，减压回收无水乙醇，即得太子参为主料的中药提取物。

将太子参为主料的中药提取物先与无菌去离子水按体积比例1：5混匀，且过滤膜除菌；最终将除菌后的太子参为主料的中药提取物稀释液分别与O型口蹄疫灭活疫苗、O型口蹄疫多肽疫苗、O型口蹄疫DNA疫苗及鸭疫里氏杆菌减毒苗进行体积比1:20混合制成相应的太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗。

作为对照，将不完全弗氏佐剂先与无菌去离子水按体积比例1：5混匀，且过滤膜除菌；最终将除菌后的不完全弗氏佐剂稀释液分别与O型口蹄疫灭活疫苗、O型口蹄疫多肽疫苗、O型口蹄疫DNA疫苗及鸭疫里氏杆菌减毒疫苗进行体积比1:20混合制成相应的不完全弗氏佐剂疫苗。

实施例3

以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂O型口蹄疫灭活疫苗与不完全弗氏佐剂O型口蹄疫灭活疫苗进行对比试验：

将168只昆明系小鼠（培养于福建贝迪药业有限公司动物培养实验室）随机分为4组，每组42只，公母各半。第一组：空白对照组，即不进行任何处理；第二组：仅注射O型口蹄疫灭活疫苗组；第三组：太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂O型口蹄疫灭活疫苗；第四组：不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂O型口蹄疫灭活疫苗。采用肌肉注射方法免疫小鼠，且第二组、第三组和第四组的注射量均为0.3mL／只，一免后15d每组取14只小鼠进行眼球采血，6000rpm／min离心10min分离出血清，检测抗体效价；剩余小鼠进行二次免疫，二免后15d每组取14只进行眼球采血，分离出血清，检测抗体效价；14只于二免后15d眼球采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图1。

实施例4

以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂O型口蹄疫多肽疫苗与不完全弗氏佐剂O型口蹄疫多肽疫苗进行对比试验：

将168只昆明系小鼠（培养于福建贝迪药业有限公司动物培养实验室）随机分为4组，每组42只，公母各半。第一组：空白对照组，即不进行任何处理；第二组：仅注射O型口蹄疫多肽疫苗组；第三组：太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂O型口蹄疫多肽疫苗；第四组：不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂O型口蹄疫多肽疫苗。采用肌肉注射方法免疫小鼠，且第二组、第三组和第四组的注射量均为0.3mL／只，一免后15d每组取14只小鼠进行眼球采血，6000rpm／min离心10min分离出血清，检测抗体效价；剩余小鼠进行二次免疫，二免后15d每组取14只进行眼球采血，分离出血清，检测抗体效价；14只于二免后15d眼球采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图2。

实施例5

以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂O型口蹄疫DNA疫苗与不完全弗氏佐剂O型口蹄疫DNA疫苗进行对比试验：

将168只昆明系小鼠（培养于福建贝迪药业有限公司动物培养实验室）随机分为4组，每组42只，公母各半。第一组：空白对照组，即不进行任何处理；第二组：仅注射O型口蹄疫DNA疫苗组；第三组：太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂O型口蹄疫DNA疫苗；第四组：不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂O型口蹄疫DNA疫苗。采用肌肉注射方法免疫小鼠，且第二组、第三组和第四组的注射量均为0.3mL／只，一免后15d每组取14只小鼠进行眼球采血，6000rpm／min离心10min分离出血清，检测抗体效价；剩余小鼠进行二次免疫，二免后15d每组取14只进行眼球采血，分离出血清，检测抗体效价；14只于二免后15d眼球采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图3。

实施例6

以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗与不完全弗氏佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗进行对比试验。

将72羽健康72日龄试验鸭（由福建贝迪动物药品厂动物饲养场提供）随机分为4组，每组18羽。第一组：空白对照组，即不进行任何处理；第二组：仅注射鸭疫里氏杆菌减毒疫苗组；第三组：太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗；第四组：不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗。且第二组、第三组和第四组的注射量均为1mL／羽。采用颈部皮下注射方法免疫鸭子，一免后15d每组取6只鸭子进行颈静脉采血，6000rpm／min离心10min分离出血清，检测抗体效价。剩余鸭子进行二次免疫，二免后15d每组取6只进行颈静脉采血，分离出血清，检测抗体效价；6只于二免后15d颈静脉采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图4。

从图1-4可以看出：在免疫小鼠时，第一组，即不进行任何处理时，效价极低，几乎检测不到；太子参为主料的中药提取物做免疫佐剂，分别与减毒疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗进行体积比1:20混合，免疫小鼠和鸭，小鼠和鸭不仅能健康成长，且其体内抗血清检测发现小鼠抗血清中较长时间内可检测到高滴度抗体，与对照组不完全弗氏佐剂做免疫佐剂对比，两者之间不存在显著差异。因此，太子参为主料的中药提取物可作为主要有效成分用于制备免疫佐剂，即太子参为主料的中药提取物可用于制备免疫佐剂，是一种可以增强抗原免疫保护效果的安全有效的疫苗佐剂。可应用于传统的减毒疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗的免疫保护中。

Claims (7)

1.一种疫苗佐剂，其特征在于：其有效成分为太子参为主料的中药提取物，所述太子参为主料的中药提取物按下述步骤制备而得：

（i）、干燥和粉碎：将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥后，以质量比计，按太子参︰淫羊藿︰黄芪︰灵芝=5-7︰0.5-1.5︰1.5-2.5︰0.5-1.5的固定比例混合并粉碎；

（ii）、超声预处理：将步骤（i）获得的中药粉按固液比g/ml=1:10-1:30加入乙醇进行超声；

（iii）、低温超临界CO₂萃取：将步骤（ii）超声后获得的中药乙醇分散液进行烘干后，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界CO₂萃取，萃取操作参数为：夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1-3%，萃取温度35-50℃，萃取压力10-25MPa，CO₂流量2-4L/h，萃取时间0.5-2h；所述夹带剂为乙醇、乙二醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种；待萃取结束后，减压回收夹带剂，即得太子参为主料的中药提取物。

2.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于步骤（i）中：干燥至水分的质量百分含量不高于10%；粉碎目数为65-80目。

3.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于步骤（ii）中：乙醇为体积纯度为85%以上的乙醇；超声时的参数为：超声功率50-200W，超声频率20-40kHz，超声时间30-50min。

4.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于步骤（iii）中：烘干时的温度为60-80℃，夹带剂的体积纯度为80-100%；若夹带剂为多种时，等体积比混合使用。

5.利用如权利要求1-4之任一所述疫苗佐剂制成的佐剂疫苗，其特征在于：将疫苗佐剂先与无菌去离子水按体积比1：5-10混匀，获得疫苗佐剂稀释液；再将疫苗佐剂稀释液直接和疫苗混合，即制得佐剂疫苗；其中所述疫苗佐剂在制备得到的佐剂疫苗中所占的体积比为2.5-8%。

6.如权利要求5所述的佐剂疫苗，其特征在于：所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗。

7.如权利要求6所述的佐剂疫苗，其特征在于：所述疫苗为鸭疫里氏杆菌减毒疫苗，O型口蹄疫灭活疫苗，O型口蹄疫多肽疫苗或O型口蹄疫DNA疫苗。