CN101869590B

CN101869590B - 中药藿蜂酮免疫增强剂

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Publication number: CN101869590B
Application number: CN2010102119888A
Authority: CN
Inventors: 胡元亮; 刘家国; 范云鹏; 王德云; 张宝康
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2030-06-28
Also published as: CN101869590A

Abstract

本发明涉及一种中药藿蜂酮免疫增强剂，简称为藿蜂酮增免剂，属于畜禽免疫佐剂领域。每1000ml药液由淫羊藿15g，酒制蜂胶5g制成。淫羊藿水煎2次，合并滤液，浓缩，制成870ml；酒制蜂胶加乙醇溶解，过滤，浓缩，制成130ml，与淫羊藿提取液混合，制得。通过免疫试验证明，藿蜂酮增免剂在体外能显著刺激鸡淋巴细胞增殖，配合新城疫苗免疫雏鸡，能显著提高血清抗体效价，促进淋巴细胞增殖，增强雏鸡细胞免疫和体液免疫，提高疫苗的免疫应答。

Description

中药藿蜂酮免疫增强剂

一、技术领域

本发明涉及一种中药藿蜂酮免疫增强剂，由淫羊藿提取物和蜂胶黄酮制成，简称为藿蜂酮增免剂，属于畜禽免疫佐剂领域。

二、背景技术

畜禽传染病一直是危害畜牧业发展的首要问题，尤其是当前流行的重大病毒性传染病，迄今尚无有效的治疗方法，疫苗预防仍是最主要的措施。由于种种原因，多数疫苗只有与免疫增强剂或免疫佐剂配合应用才能发挥良好的防疫效果。但是，目前国内外广泛使用的油乳类、铝胶类等化学性免疫佐剂常有副作用大、局部刺激强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研制开发高效、安全的新型免疫增强剂成为亟待解决的问题。研究表明，许多中药具有免疫增强作用，具备高效、安全的优势。但是尚无名副其实的中药免疫增强剂产品问市，而且一些具有增强免疫作用的方剂多处方复杂、给药不便等不足。本发明通过多年的努力，从组分药筛选到方剂筛选和剂型筛选，结合成本和方便应用等方面综合比较，研制成功由淫羊藿提取物和蜂胶黄酮制成的藿蜂酮增免剂。

三、发明内容

技术问题本发明针对当前动物疫病防控现有技术中急需高效、安全的免疫增强剂或疫苗佐剂的问题，提供一种由淫羊藿提取物和蜂胶黄酮制成的新型中药免疫增强剂。

技术方案本发明一种新型中药免疫增强剂，其特征在于，每1000ml药液由淫羊藿15g、酒制蜂胶5g制成。药液中的多糖、黄酮质量比含量均不低于0.07％。

生产每1000ml药液的工艺流程为：淫羊藿水煎2次，合并滤液，85℃减压浓缩至835ml，加丙三醇35ml混匀；酒制蜂胶加95％乙醇75ml使溶解，静置，滤过，滤液回收乙醇至65ml，加入聚乙二醇-400 65ml，混匀，缓慢加入到淫羊藿溶液中，混匀，分装，灭菌，获得。

淫羊藿多糖的提取工艺为加淫羊藿20倍质量水煎煮2次，第一次1.5小时、第二次1小时。

有益效果本发明的基础工作首先选择有增强免疫作用的中药成分，比较它们的增强免疫作用，筛选出作用较好的淫羊藿多糖、蜂胶黄酮，按不同比例组成多个复方，通过系列试验比较，证明复方的效果强于单味药，筛选出效果最好的组方配比。为简化工艺、节约成本和充分利用资源，以淫羊藿提取物(含同量淫羊藿多糖)替代方中的淫羊藿多糖，通过临床试验比较证明，其增强免疫效果与原方的差异不显著，确定了藿蜂酮增免剂的处方。

通过正交试验和反复比较确定了淫羊藿提取物和蜂胶黄酮的提取条件，在尽量少用有机溶剂用量的前提下确定了藿蜂酮增免剂的生产工艺。

比较了藿蜂酮增免剂与2个制备药有效成分方剂的免疫增强作用，证明藿蜂酮增免剂在体外能显著促进鸡外周血淋巴细胞增殖，从而增强细胞免疫，效果优于2个对照方剂(表1、表2)；配合新城疫疫苗免疫雏鸡，能显著提高血清抗体效价、促进淋巴细胞增殖，增强雏鸡的细胞免疫和体液免疫，提高新城疫苗的免疫应答(表3、表4)。

比较了藿蜂酮增免剂不同剂量对新城疫疫苗的免疫增强作用，证明藿蜂酮增免剂在合适的剂量能显著提高免疫雏鸡的血清抗体效价，促进淋巴细胞增殖，增强鸡的细胞免疫和体液免疫，提高新城疫疫苗的免疫效果；0.75mg为雏鸡的最佳剂量(表5、表6)。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.与化学佐剂相比，藿蜂酮增免剂效果可靠，而且来源于天然中药，无毒副作用，无药残隐患，保障动物源食品安全；生产对环境无污染，符合绿色环保的要求。

2.与传统中药方剂相比，藿蜂酮增免剂处方精练，成分明确，质量可控，剂型先进，给药方便。

3.与同类中药成分方剂相比，藿蜂酮增免剂功效提高，单用或配合新城疫疫苗免疫雏鸡，能显著增强细胞免疫和体液免疫，提高疫苗的免疫应答。

四、具体实施方式

1.制备工艺

(1)淫羊藿提取物的制备以淫羊藿提取物和淫羊藿多糖的得率为指标，对加水量、煮沸时间和提取次数进行正交试验，确定淫羊藿提取物的最佳提取工艺为加20倍水煎煮2次，第一次1.5h、第二次1h。称取淫羊藿饮片15g，按以上工艺水煎，合并滤液，85℃减压浓缩至835ml，得到淫羊藿提取物溶液。

(2)蜂胶黄酮的制备在反复比较的基础上，确定蜂胶黄酮的提取工艺。称取酒制蜂胶5g，加95％乙醇75ml使溶解，静置，滤过，滤液回收乙醇至65ml，得到蜂胶黄酮溶液。

(3)药液制备通过反复比较，确定藿蜂酮增免剂的生产工艺。取淫羊藿提取液，加丙三醇35ml，混匀；取蜂胶黄酮溶液，加入聚乙二醇-400 65ml，混匀，缓慢加入到淫羊藿溶液中，混匀，分装，灭菌，获得。分别用苯酚-硫酸法、用芦丁法测定药液中的多糖、黄酮含量，两者的含量不低于0.07％。

2.增强免疫效果比较

(1)体外增强免疫效果

方法：在组分药筛选、方剂反复筛选的基础上，确定藿蜂酮增免剂的处方，另制备两个制备药的有效成分的方剂，对照方1由淫羊藿黄酮加蜂胶黄酮组成，对照方2由淫羊藿黄酮加蜂胶粗提物组成。首先测定3个方剂对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度，然后将3个方剂用细胞培养液(RPMI1640)分别稀释成15.625、7.813、3.906、1.953和0.977μg·mL^-1共5种浓度，分别加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中，用MTT法测定淋巴细胞增殖(A₅₇₀值)，作为淋巴细胞增殖的指标；并计算刺激指数(stimulating index，SI，SI＝试验孔A₅₇₀均值/对照孔A₅₇₀均值)，比较3个方剂的作用强弱。

结果：①淋巴细胞增殖的变化：藿蜂酮增免剂在0.977、7.813和15.625μg·mL^-1时的细胞A₅₇₀值显著大于细胞对照组(P＜0.05)，而2个对照方在低浓度时的A₅₇₀值大于细胞对照组，但差异不显著(表1)。

表1各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

注：同列数据标注不含相同字母者差异显著(P＜0.05)，以下表同。

②刺激指数的比较：藿蜂酮增免剂在15.625、和0.977μg·mL^-1时的刺激指数显著大于2个对照方组(P＜0.05)，在其余3个浓度多稍大于2个对照方组(表2)。

表23个方剂刺激鸡淋巴细胞增殖效果的比较(SI)

以上结果表明，藿蜂酮增免剂在体外能显著刺激鸡外周血淋巴细胞增殖，从而增强细胞免疫，效果优于2个对照方

(2)体内增强免疫效果

方法：14日龄免疫健康罗曼蛋公鸡250羽，随机均分为5组，除空白组外均用新城疫IV苗滴鼻、点眼免疫(3羽份/羽)，28日龄二免。在首次免疫的同时，藿蜂酮增免剂、对照方1和对照方2组分别同时肌肉注射相应药物，0.5mL/羽，免疫对照组和空白对照组注射等量生理盐水，分别于免疫后第7(D₇)、14(D₁₄)、21(D₂₁)和28(D₂₈)天每组随机抽取6羽采血，用β-微量法测定血清ND-HI抗体效价，用MTT法测定外周血T淋巴细胞增殖。

结果：①抗体效价的变化：藿蜂酮增免剂组在首次免疫后4个时间点的抗体效价最高均为最高。在首次免疫后第7天(D₇)显著高于免疫对照和空白对照组(P＜0.05)，分别比2个对照方高0.5个滴度；在其后3个时间点显著高于其余各组(P＜0.05)；在D₁₄，分别比对照方1、对照方2高1.5、1.33个滴度；在D₂₁，分别比对照方1、对照方2高1.33、1.0个滴度；在D₂₈，分别比对照方1、对照方2高0.84、0.67个滴度(表3)。

表3各组血清抗体效价的变化(Log₂)

②淋巴细胞增殖的变化：藿蜂酮增免剂组在首次免疫后4个时间点的A₅₇₀值均为最高，在首次免疫后第7天(D₇)显著高于免疫对照和空白对照组(P＜0.05)，稍高于2个对照方组；再其后的3个时间点均显著高于其余各组(P＜0.05)(表4)。

表4各组淋巴细胞增殖的动态变化(A₅₇₀值)

以上结果表明，藿蜂酮增免剂配合新城疫疫苗免疫雏鸡，能显著提高血清抗体效价，促进淋巴细胞增殖，增强雏鸡的细胞免疫和体液免疫，提高新城疫苗的免疫应答。

5.藿蜂酮增免剂最佳剂量的筛选

方法：将藿蜂酮增免剂分别制成3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5和0.25mg/ml 7种浓度。取14日龄免疫健康罗曼蛋公鸡270羽，随机均分为9组，除空白组外均用新城疫IV苗滴鼻、点眼免疫(2羽份/羽)，28日龄二免。在首次免疫的同时，藿蜂酮增免剂的7个剂量组分别同时肌肉注射相应浓度的药物0.5mL，即分别每羽1.5、1.25、1.0、0.75、0.5、0.25和0.125mg，免疫对照组和空白对照组注射等量生理盐水，分别于首次免疫后第7(D₇)、14(D₁₄)、21(D₂₁)和28(D₂₈)天采血，用β-微量法测定各组的血清ND-HI抗体效价，用MTT法测定1.25、0.75、0.25mg组的淋巴细胞增殖。

结果：(1)血清抗体效价的变化：藿蜂酮增免剂各剂量组在各时间点的抗体效价多明显或显著高于免疫对照组和空白对照组，0.75mg组在各时间点的抗体效价均为最高；在首次免疫后第7天(D₇)，0.75、1.0和1.5mg组高于免疫对照组和空白对照(P＜0.05)；在D₁₄，0.75mg组显著高于其余各组(P＜0.05)；在D₂₁，0.75、1.0、1.25和1.5mg组显著高于免疫对照组和空白对照(P＜0.05)；在D₂₈，0.75mg组显著高于免疫对照组和空白对照(P＜0.05)(表5)。

表5各组血清抗体效价的变化(log₂)

(2)淋巴细胞增殖的变化：藿蜂酮增免剂各剂量组在各时间点的A₅₇₀值多明显或显著高于免疫对照组和空白对照组。在首次免疫后第7天(D₇)，藿蜂酮增免剂3个剂量组的A₅₇₀值均显著大于免疫对照组(P＜0.05)；在D₁₄，0.75、0.25mg组显著大于免疫对照组(P＜0.05)；在D₂₁，0.75、1.25mg组的显著大于其余3组(P＜0.05)；在D₂₈，0.75mg组显著大于其余各组(P＜0.05)(表6)。

表6淋巴细胞增殖的变化

以上结果表明，藿蜂酮增免剂在合适的剂量能显著提高新城疫疫苗免疫雏鸡的血清抗体效价，促进淋巴细胞增殖，增强雏鸡的细胞免疫和体液免疫功能，提高新城疫疫苗的免疫效果；雏鸡每次肌肉注射0.75mg为最佳剂量。

Claims

1.一种中药藿蜂酮免疫增强剂，由淫羊藿提取物和蜂胶黄酮制成，简称为藿蜂酮增免剂，其特征在于，每1000ml药液由淫羊藿15g和酒制蜂胶5g制成，其制备方法为：

称取淫羊藿饮片15g，加20倍水煎煮2次，第一次1.5h、第二次1h，合并滤液，85℃减压浓缩至835ml，得到淫羊藿提取物溶液；

称取酒制蜂胶5g，加95％乙醇75ml使溶解，静置，滤过，滤液回收乙醇至65ml，得到蜂胶黄酮溶液；

取淫羊藿提取液，加丙三醇35ml，混匀；取蜂胶黄酮溶液，加入65ml的聚乙二醇-400，混匀，缓慢加入到淫羊藿溶液中，混匀，分装，灭菌，获得。

2.根据权利要求1所述的中药藿蜂酮免疫增强剂，其特征在于，药液中的多糖、黄酮质量比含量均不低于0.07％。