CN108570114B - 一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，仅用泡桐花药材进行多糖提取制备成中药免疫增强剂，并取18日龄非免疫雏鸡使用新城疫Ⅳ滴鼻、点眼首次免疫，32日龄时进行二次免疫，每次免疫的同时，给雏鸡经口灌服泡桐花多糖中药免疫增强剂，给药剂量为12.5‑50mg/kg体重，每日1次，连续给药3天。在首免后的第7天、第14天、第21天和第28天进行测定，发现泡桐花多糖可明显促进鸡外周血和脾脏淋巴细胞增值，提升ND‑HI抗体水平，提高免疫器官指数，提高血清中IL‑4、IL‑6、

Description

一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途
技术领域
本发明属于免疫增强剂领域，尤其涉及一种禽畜使用的中药免疫增强剂。
背景技术
近些年来，我国畜牧业飞速发展，随之而来重大动物疫病给畜牧业造成的风险日渐突出，尤其是近年来禽流感、鸡新城疫、猪繁殖与呼吸道综合征、猪圆环病毒病、猪瘟等畜禽传染病的流行，畜牧业遭受巨大冲击，甚至危及到了公共卫生安全，使我国畜牧业当前和未来的健康发展受到严重影响。这些危害大的疫病，绝大多数属于病毒性传染病，且一些属于免疫抑制性疾病。迄今为止，人们还没有找到有特效的治疗药物。除了加强饲养管理外，给动物接种疫苗是预防和控制动物疫病的一项重要的、有效的手段。而提高疫苗的免疫效果和增强动物机体的抗病能力是动物产生高水平免疫保护力的重要措施，因此免疫增强剂成为近些年来研究的热点问题。
免疫增强剂是通过一定途径来提高机体对抗原或微生物特异性反应的一类物质，也称免疫佐剂。一些传统的免疫佐剂存在许多不尽人意之处，如弗氏完全佐剂和铝盐佐剂，不能诱发很强的细胞免疫，也不能诱发迟发型超敏反应；弗氏不完全佐剂表现黏稠，能造成组织损伤，还可能有致癌作用。其后蜂胶佐剂、乳酸杆菌DNA免疫佐剂和脂质体佐剂被广泛研究，但以上三种佐剂成本较高，效果不太稳定，限制了其在临床广泛的应用。
中药是我国传统医学的瑰宝，物质基础为天然产物，具有结构丰富、活性独特、毒副性低、作用靶点多样等特点，是创新药物的重要来源。随着人们健康意识的增强，以中药或中药成分为代表的兽用免疫增强剂以其优异的免疫功效、安全、无残留而倍受重视，成为近年来我国新兽药研发的主要研究方向。
在专利号为CN201310365016.8的专利中，提供的一种提高肉鸡免疫力的中草药制剂，这种药剂主要用于添加在禽畜日常饲料中，且是全程添加。除该专利外，另外也已公开了多项中药免疫增强剂的技术方案，但是这类技免疫增强剂在使用过程中，都是全程添加于禽畜饲料中，这便要求每日喂养前都需要在饲料中加入中药增强剂并且混合搅拌，以达到充分混合的目的，及其不方便。同时，虽然每天增加的量少，但是养殖全程喂养所需的中药剂量还是很大，并且每天的量越小其混合难度越大，存在严重不足。
发明内容
为解决以上问题，本发明旨在提供一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，取泡桐花药材提取其多糖制成中药免疫增强剂，其步骤如下：
（1）取泡桐花药材，加水润湿洗涤去泥浆；
（2）加入润湿前泡桐花药材10倍重量的水，并进行2次煎煮，每次煎煮结束后将煎液滤过；将2次滤液合并，并进行浓缩得到浓缩液；
（3）将浓缩液进行离心并取上液；
（4）在离心下液中加入离心下液4倍重量的乙醇，并进行搅拌，搅拌后静置12h以上；
（5）将静置液的上液取出丢弃后，再取出静置液的下液得膏状物；
（6）将膏状物在75℃温度下减压干燥至恒重，再粉碎即得粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂；
（7）使用硫酸苯酚法测定粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量；
（8）取18日龄非免疫雏鸡，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂；
（9）待步骤（8）中的雏鸡到达32日龄时，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行二次免疫，二次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂。
较佳的，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为25mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含25mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂：假如通过步骤（7）中测定泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量为50%，则每1kg重的雏鸡灌服50mg的泡桐花多糖中药免疫增强剂；假如通过步骤（7）中测定的泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量为60%，则每1kg重的雏鸡灌服41.67mg的泡桐花多糖中药免疫增强剂。
较佳的，步骤（2）中两次煎煮的具体步骤如下：第一次煎煮时，加入润湿前泡桐花药材10倍重量的水，并煎煮2h；第二次煎煮时，加入润湿前泡桐花药材10倍重量的水，并煎煮1h。
较佳的，上述步骤（1）中润湿前泡桐花药材重量以g计算，步骤（2）中浓缩得到浓缩液体积以mL计算，则步骤（2）中浓缩后的浓缩液体积数值与润湿前泡桐花药材重量数值相同。
较佳的，上述步骤（4）中乙醇浓度为95%。
本发明提供的这种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其有益效果如下：
（1）在雏鸡首免（18日龄）、二免（32日龄）新城疫疫苗时，连续3天给它们灌服泡桐花多糖，在首免后的第7天、第14天（即二免日）、第21天和第28天进行测定，发现泡桐花多糖可明显促进鸡外周血和脾脏淋巴细胞增值，提升ND-HI抗体水平，提高免疫器官指数，提高血清中IL-4、IL-6、
Figure DEST_PATH_IMAGE001
等细胞因子浓度，提高雏鸡十二指肠SIgA含量，从而提高机体的免疫能力，增强疫苗的免疫效果。
（2）经过研究发现使用直接提取出的泡桐花多糖亦可达到增强疫苗的免疫效果，而无需再增加其他中药材的多糖，降低了免疫增强剂的制备成本，且省去将不同种中药材活性成分混合的步骤，大大提高了制备速率。
（3）只需在首次免疫及二次免疫时使用特定量的泡桐花多糖便可达到增强免疫的效果，其相对全程添加于饲料中而言，省去每日都需要混合饲料的麻烦，并且对于禽畜而言，所服食的免疫增强剂总量也减少了，其养殖成本也降低了。
具体实施方式
实施例一
一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其包括如下步骤：
（1）取500g泡桐花药材，加水润湿洗涤去泥浆；
（2）加入5kg重量的水，并进行第一次煎煮，煎煮结束后将煎液滤过；再次加入5kg重量的水进行第二次煎煮，煎煮结束后将煎液滤过；随后将2次滤液合并，并进行浓缩得到500mL的浓缩液；
（3）将浓缩液进行离心并取上液；
（4）在离心下液中加入离心下液4倍重量的乙醇，并进行搅拌，搅拌后静置12h以上；其中乙醇浓度为95%；
（5）将静置液的上液取出丢弃后，再取出静置液的下液得膏状物；
（6）将膏状物在75℃温度下减压干燥至恒重，再粉碎即得粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂；
7）使用硫酸苯酚法测定粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量；
（8）取18日龄非免疫雏鸡，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为12.5mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂；
（9）待步骤（8）中的雏鸡到达32日龄时，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行二次免疫，二次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为12.5mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂。
实施例二
一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其包括如下步骤：
（1）取500g泡桐花药材，加水润湿洗涤去泥浆；
（2）加入5kg重量的水，并进行第一次煎煮，煎煮结束后将煎液滤过；再次加入5kg重量的水进行第二次煎煮，煎煮结束后将煎液滤过；随后将2次滤液合并，并进行浓缩得到500mL的浓缩液；
（3）将浓缩液进行离心并取上液；
（4）在离心下液中加入离心下液4倍重量的乙醇，并进行搅拌，搅拌后静置12h以上；其中乙醇浓度为95%；
（5）将静置液的上液取出丢弃后，再取出静置液的下液得膏状物；
（6）将膏状物在75℃温度下减压干燥至恒重，再粉碎即得粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂；
7）使用硫酸苯酚法测定粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量；
（8）取18日龄非免疫雏鸡，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为25mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含25mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂；
（9）待步骤（8）中的雏鸡到达32日龄时，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行二次免疫，二次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为25mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含25mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂。
实施例三
一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其包括如下步骤：
（1）取500g泡桐花药材，加水润湿洗涤去泥浆；
（2）加入5kg重量的水，并进行第一次煎煮，煎煮结束后将煎液滤过；再次加入5kg重量的水进行第二次煎煮，煎煮结束后将煎液滤过；随后将2次滤液合并，并进行浓缩得到500mL的浓缩液；
（3）将浓缩液进行离心并取上液；
（4）在离心下液中加入离心下液4倍重量的乙醇，并进行搅拌，搅拌后静置12h以上；其中乙醇浓度为95%；
（5）将静置液的上液取出丢弃后，再取出静置液的下液得膏状物；
（6）将膏状物在75℃温度下减压干燥至恒重，再粉碎即得粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂；
7）使用硫酸苯酚法测定粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量；
（8）取18日龄非免疫雏鸡，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含50mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂；
（9）待步骤（8）中的雏鸡到达32日龄时，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行二次免疫，二次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含50mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂。
试验例：
1、取200只1日龄非免疫雏鸡饲养，随机分为5组，每组40只；
2、第一组为空白对照组（BC组），不用新城疫免疫疫苗；
3、第二组为免疫对照组（VC组），18日龄时使用新城疫疫苗Ⅳ进行首次免疫，32日龄时进行二次免疫；
4、第三组为实施例一组（12.5mg/kg剂量组），按照实施例一中的步骤制备并使用泡桐花多糖中药免疫增强剂；
5、第四组为实施例二组（25mg/kg剂量组），按照实施例二中的步骤制备并使用泡桐花多糖中药免疫增强剂；
6、第五组为实施例三组（50mg/kg剂量组），按照实施例三中的步骤制备并使用泡桐花多糖中药免疫增强剂。
各项检测数据如下：
（1）泡桐花多糖对外周血淋巴细胞转化功能的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：1、竖排相同字母代表组间差异不显著，表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9同。
、D7为首次免疫后第七天；D14为首次免疫后第14天；D21为首次免疫后第21天；D28为首次免疫后第28天，表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9同。
由表1可以看出，在D7，泡桐花多糖50 mg/kg、12.5 mg/kg剂量组的吸光值均大于BC组。在D14，12.5mg/kg剂量组的吸光值显著大于空白对照（P＜0.05），也大于免疫对照组。在D21，各多糖剂量组的吸光值都大于免疫对照组和空白对照组。在D28，12.5mg/kg剂量组的吸光值显著大于空白对照组（P＜0.05）。
（2）泡桐花多糖对脾脏淋巴细胞转化功能的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表2可以看出，在D7，泡桐花多糖各剂量组的吸光值均大于BC组，其中25 mg/kg、12.5 mg/kg剂量组的吸光值均大于免疫对照组。在D14，25mg/kg剂量组的吸光值显著大于空白对照组（P＜0.05）和免疫对照组（P＜0.05）。在D21，2 mg/kg、50mg/kg剂量组的吸光值显著大于空白对照组（P＜0.05），也大于免疫对照组。在D28，12.5mg/kg剂量组的吸光值显著大于空白对照组（P＜0.05）和免疫对照组（P＜0.05）。
（3）泡桐花多糖对鸡血清ND-HI抗体效价的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由表3可以看出，在上述四个时间点中，泡桐花多糖各剂量组的抗体效价均显著高于空白组（P＜0.05）。在D7，25mg/kg和50mg/kg剂量组的效价高于免疫对照组，在D14，各个剂量组的效价均高于免疫对照组，其中50mg/kg剂量组的效价高于其他多糖组。在D21，D28，各个剂量组的效价均高于免疫对照组，其中25mg/kg剂量组的效价高于其他多糖组。
（4）泡桐花多糖对免疫器官指数的影响
①脾脏指数
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表4可以看出，在D14，泡桐花多糖各剂量组的数值均大于空白对照组。在D21，泡桐花多糖50 mg/kg剂量组的数值显著大于空白对照组（P＜0.05），其中50mg/kg、12.5mg/kg剂量组的数值均大于免疫对照组。在D28，25mg/kg剂量组的数值大于空白对照组和免疫对照组。
②法氏囊指数
Figure DEST_PATH_IMAGE006
由表5可以看出，在D7，50mg/kg、12.5mg/kg剂量组的数值大于空白对照组和，免疫对照组，其中12.5 mg/kg剂量组的指数最大。在D14，12.5mg/kg、25mg/kg剂量组的指数大于空白对照组，其中12.5mg/kg剂量组指数大于免疫对照组，且数值最大。在D21，12.5mg/kg剂量组指数大于空白对照组。在D28，各多糖剂量组指数均大于空白对照组，其中50mg/kg、25mg/kg剂量组指数大于免疫对照组。
（5）泡桐花多糖对血清中细胞因子浓度的影响
①血清中IL-4浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE007
由表6可以看出，在D7，各剂量组鸡血清中IL-4浓度均高于空白对照组和免疫对照组，其中25mg/kg剂量组的IL-4浓度显著高于空白对照组(P＜0.05)。在D14，各剂量组鸡血清中IL-4浓度均高于空白对照组和免疫对照组，其中25 mg/kg剂量组差异显著(P＜0.05)。在D21、D28，各剂量组鸡血清中IL-4浓度均高于空白对照组和免疫对照组，但差异不显著，其中25 mg/kg剂量组的IL-4浓度最高。
②血清中IL-6浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE008
由表7可以看出，在D7，泡桐花多糖25mg/kg、12.5mg/kg剂量组血清中IL-6浓度均显著高于免疫对照组(P＜0.05)和BC组(P＜0.05)。在D14、D21，各泡桐花多糖剂量组鸡血清中IL-6浓度均高于空白对照组和免疫对照组，但差异不显著。在D28，各泡桐花多糖剂量组鸡血清中IL-6浓度均高于空白对照组，其中25mg/kg、12.5mg/kg剂量组血清中IL-6浓度高于免疫对照组，12.5mg/kg剂量组血清中IL-6浓度显著高于空白对照组(P＜0.05)。
③血清中
Figure 994015DEST_PATH_IMAGE001
浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE009
由表8可以看出，在D7，D21，各泡桐花多糖剂量组鸡血清中
Figure 458625DEST_PATH_IMAGE001
浓度均高于空白对照组和免疫对照组，但差异不显著。在D14，泡桐花多糖25mg/kg、12.5mg/kg剂量组血清中IFN-γ浓度均高于免疫对照组，且显著高于空白对照组(P＜0.05)。在D28，各泡桐花多糖剂量组鸡血清中
Figure 503942DEST_PATH_IMAGE001
浓度均高于空白对照组，但差异不显著。
（6）泡桐花多糖对十二指肠黏膜SIgA浓度的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE010
由表9可以看出，在D7，泡桐花多糖25mg/kg剂量组鸡十二指肠黏膜SIgA浓度高于空白对照组和免疫对照组。在D14，各泡桐花多糖剂量组鸡十二指肠黏膜中SIgA浓度均高于空白对照组和免疫对照组，但差异不显著，其中50mg/kg剂量组SIgA浓度均最高。在D21，泡桐花多糖25mg/kg、50mg/kg剂量组鸡十二指肠黏膜中SIgA浓度均高于空白对照组和免疫对照组，其中25mg/kg剂量组SIgA浓度最高。在D28，泡桐花多糖25mg/kg剂量组鸡十二指肠黏膜中SIgA浓度高于免疫对照组，且显著高于空白对照组(P＜0.05)。
结论：综上所述在雏鸡首免、二免新城疫疫苗时，同时经口灌服泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天。在12.5-50mg/kg体重的给药剂量范围内，泡桐花多糖明显可促进鸡外周血和脾脏淋巴细胞增值，提升ND-HI抗体水平，提高免疫器官指数，提高血清中IL-4、IL-6、
Figure 695889DEST_PATH_IMAGE001
等细胞因子浓度，提高十二指肠SIgA含量，从而提高机体的免疫能力，增强疫苗的免疫效果。
以上仅为本发明较佳的实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明说明书内容所作的等效变化与装饰，皆应属于本发明覆盖的范围内。

Claims (5)

1.一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于取泡桐花药材提取其多糖制成中药免疫增强剂，其步骤如下：
（1）取泡桐花药材，加水润湿洗涤去泥浆；
（2）加入润湿前泡桐花药材10倍重量的水，并进行2次煎煮，每次煎煮结束后将煎液滤过；将2次滤液合并，并进行浓缩得到浓缩液；
（3）将浓缩液进行离心并取上液；
（4）在离心下液中加入离心下液4倍重量的乙醇，并进行搅拌，搅拌后静置12h以上；
（5）将静置液的上液取出丢弃后，再取出静置液的下液得膏状物；
（6）将膏状物在75℃温度下减压干燥至恒重，再粉碎即得粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂；
（7）使用硫酸苯酚法测定粗制泡桐花多糖中药免疫增强剂中的泡桐花多糖含量；
（8）取18日龄非免疫雏鸡，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂；
（9）待步骤（8）中的雏鸡到达32日龄时，使用新城疫疫苗滴鼻和点眼进行二次免疫，二次免疫的同时给雏鸡经口灌服上述泡桐花多糖中药免疫增强剂，每日1次，连续给药3天，每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂。
2.根据权利要求1中所述的一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于每次给药剂量以泡桐花多糖中药免疫增强剂中所含的泡桐花多糖计则其给药计量为25mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含25mg泡桐花多糖的中药免疫增强剂。
3.根据权利要求1中所述的一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于步骤（2）中两次煎煮的具体步骤如下：第一次煎煮时，加入润湿前泡桐花药材10倍重量的水，并煎煮2h；第二次煎煮时，加入润湿前泡桐花药材10倍重量的水，并煎煮1h。
4.根据权利要求1中所述的一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于上述步骤（1）中润湿前泡桐花药材重量以g计算，步骤（2）中浓缩得到浓缩液体积以mL计算，则步骤（2）中浓缩后的浓缩液体积数值与润湿前泡桐花药材重量数值相同。
5.根据权利要求1中所述的一种泡桐花多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于上述步骤（4）中乙醇浓度为95%。
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