CN108567793B - 一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种灵芝多糖中药免疫增强剂的制备与使用方法，仅用赤灵芝子实体材料提取其中的多糖制备成中药免疫增强剂，并取14日龄非免疫雏鸡使用新城疫Ⅳ滴鼻、点眼首次免疫，28日龄时进行二次免疫，每次免疫的同时给雏鸡经口灌服灵芝多糖溶液，给药剂量为12.5‑50mg/kg体重，每日1次，连续给药3天。在首免后的第7天、第14天、第21天和第28天进行测定，发现灵芝多糖可明显促进鸡外周血和脾脏淋巴细胞增值，提升ND‑HI抗体水平，提高免疫器官指数，提高血清中IL‑4、IL‑6、IFN‑g等细胞因子浓度，提高十二指肠SIgA含量，从而提高机体的免疫能力，增强疫苗的免疫效果。

Description

一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途
技术领域
本发明属于免疫增强剂领域，尤其涉及一种禽畜使用的中药免疫增强剂。
背景技术
畜禽传染性疾病尤其是病毒性疾病，是危害畜牧业发展的首要问题，也给畜禽养殖业带来巨大损失。因病毒具有独特的生物特征和发病机理，目前还没有针对病毒性疾病有效的治疗方法，所以疫苗接种则成了主要的预防措施。但临床因各种原因，免疫失败现象经常出现。为提高机体对抗原或微生物特异性反应，使机体获得更好的免疫保护作用，免疫增强剂应运而生。免疫增强剂是通过一定途径来提高机体对抗原或微生物特异性反应的一类物质，也称免疫佐剂。目前国内外广泛使用的化学性免疫增强剂有Al(OH)3、AlPO4等，但他们具有一定的残留，且对机体组织有一定的刺激、损伤、致癌作用。其后蜂胶佐剂、乳酸杆菌DNA免疫佐剂和脂质体佐剂被广泛研究，但以上三种佐剂成本较高，效果不太稳定，限制了其在临床广泛的应用。因此寻找高效、安全、无耐药性，在畜产品中无残留，但又能提高疫苗的免疫保护率的免疫增强剂，成为当前畜禽生产中迫切需要解决的问题。
在专利号为CN201310365016.8的专利中，提供的一种提高肉鸡免疫力的中草药制剂，这种药剂主要用于添加在禽畜日常饲料中，且是全程添加。除该专利外，另外也已公开了多项中药免疫增强剂的技术方案，但是这类技免疫增强剂在使用过程中，都是全程添加于禽畜饲料中，这便要求每日喂养前都需要在饲料中加入中药增强剂并且混合搅拌，以达到充分混合的目的，使用时及其不便。虽然每天增加的量少，但是养殖全程喂养所需的中药剂量还是很大，并且量越小其混合难度越大，存在严重不足。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其步骤如下：
（1）取赤灵芝子实体根茎洗净、切块，置于105℃烘箱灭酶5 min；灭酶结束后置于55℃烘箱干燥，粉碎，过40目筛；
（2）加入5倍体积分数95%乙醇水浴加热，除去小分子单糖和脂肪，过滤，滤渣至阴凉通风处晾干，并于4℃下密封放置备用；
（3）取经预处理后灵芝干燥粉末10g，然后将药材粉末置于100mL圆底烧瓶中按料液比1:20加入蒸馏水，恒温水浴100℃中提取1 h，过滤，重复操作3次；
（4）合并提取液，浓缩至150mL，再缓缓加入3倍体积即450mL的95%乙醇混合，边加边搅拌，静置12 h；
（5）将步骤（4）中静置12h后的提取液在3000r/min的离心机下离心15min，随后用蒸馏水透析3d；
（6）收集所得成分置于水浴锅上80℃将乙醇彻底挥尽，得膏状物；
（7）将膏状物冷冻干燥至恒重，即得粗制灵芝多糖中药免疫增强剂，使用硫酸苯酚法测定粗制灵芝多糖中药免疫增强剂中的灵芝多糖含量；
（8）取1日龄非免疫雏鸡，饲养至14日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时，给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg灵芝多糖的中药免疫增强剂；
（9）28日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行进行二次免疫，二次免疫时给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg灵芝多糖的中药免疫增强剂。
较佳的，步骤（8）、步骤（9）中，首次免疫、二次免疫时罐服的灵芝多糖中药免疫增强剂浓度相同。
较佳的，灵芝多糖中药免疫增强剂的浓度为25 mg·kg-1体重。
本发明提供的这种灵芝多糖中药免疫增强剂的使用方法，其有益效果如下：
（1）在雏鸡首免（14日龄）、二免（28日龄）新城疫疫苗时，连续3天给它们灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，在首免后的第7天、第14天（即二免时间）、第21天和第28天进行测定，发现灵芝多糖可明显促进外周血淋巴细胞增值，提升抗体水平，提高免疫器官指数。在二免后14天，灵芝多糖能够显著促进免疫雏鸡外周血淋巴细胞中IL-6、IFN-γ mRNA的表达，提高十二指肠和盲肠扁桃体的SIgA细胞阳性数，从而提高机体的免疫能力，增强疫苗的免疫效果。
（2）经过研究发现直接使用灵芝多糖亦可达到增强疫苗的免疫效果，而无需再增加其他中药材的多糖，降低了免疫增强剂的制备成本，且省去将不同种中药材多糖混合的步骤，大大提高了制备速率。
（3）只需在首次免疫及二次免疫时使用特定量的灵芝多糖中药免疫增强剂便可达到增强免疫的效果，其相对全程增加于饲料中而言，省去每日都需要混合饲料的麻烦，并且对于禽畜而言，所服食的免疫增强剂量也减少了，其养殖成本也降低了。
附图说明
图1为各组雏鸡血清抗体效价变化(Log2)折线图；
图2为各组IL-6 mRNA表达量的变化柱形图；
图3为各组IFN-γ mRNA表达量的变化柱形图；
图4为各组盲肠扁桃体SIgA阳性细胞数量变化柱形图；
图5为各组十二指肠SIgA阳性细胞数量变化柱形图。
具体实施方式
实施例一
一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其步骤如下：
（1）取赤灵芝子实体根茎洗净、切块，置于105℃烘箱灭酶5 min；灭酶结束后置于55℃烘箱干燥，粉碎，过40目筛；
（2）加入5倍体积分数95%乙醇水浴加热，除去小分子单糖和脂肪，过滤，滤渣至阴凉通风处晾干，并于4℃下密封放置备用；
（3）取经预处理后灵芝干燥粉末10g，然后将药材粉末置于100mL圆底烧瓶中按料液比1:20加入蒸馏水，恒温水浴100℃中提取1 h，过滤，重复操作3次；
（4）合并提取液，浓缩至150mL，再缓缓加入3倍体积即450mL的95%乙醇混合，边加边搅拌，静置12 h；
（5）将步骤（4）中静置12h后的提取液在3000r/min的离心机下离心15min，随后用蒸馏水透析3d；
（6）收集所得成分置于水浴锅上80℃将乙醇彻底挥尽，得膏状物；
（7）将膏状物冷冻干燥至恒重，即得粗制灵芝多糖中药免疫增强剂，使用硫酸苯酚法测定粗制灵芝多糖中药免疫增强剂中的灵芝多糖含量；
（8）取1日龄非免疫雏鸡，饲养至14日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时，给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为12.5mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg灵芝多糖的中药免疫增强剂；
（9）28日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行进行二次免疫，二次免疫时给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为12.5mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg灵芝多糖的中药免疫增强剂。
实施例二
一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其步骤如下：
（1）取赤灵芝子实体根茎洗净、切块，置于105℃烘箱灭酶5 min；灭酶结束后置于55℃烘箱干燥，粉碎，过40目筛；
（2）加入5倍体积分数95%乙醇水浴加热，除去小分子单糖和脂肪，过滤，滤渣至阴凉通风处晾干，并于4℃下密封放置备用；
（3）取经预处理后灵芝干燥粉末10g，然后将药材粉末置于100mL圆底烧瓶中按料液比1:20加入蒸馏水，恒温水浴100℃中提取1 h，过滤，重复操作3次；
（4）合并提取液，浓缩至150mL，再缓缓加入3倍体积即450mL的95%乙醇混合，边加边搅拌，静置12 h；
（5）将步骤（4）中静置12h后的提取液在3000r/min的离心机下离心15min，随后用蒸馏水透析3d；
（6）收集所得成分置于水浴锅上80℃将乙醇彻底挥尽，得膏状物；
（7）将膏状物冷冻干燥至恒重，即得粗制灵芝多糖中药免疫增强剂，使用硫酸苯酚法测定粗制灵芝多糖中药免疫增强剂中的灵芝多糖含量；
（8）取1日龄非免疫雏鸡，饲养至14日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时，给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为25mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含25mg灵芝多糖的中药免疫增强剂；
（9）28日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行进行二次免疫，二次免疫时给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为25mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含25mg灵芝多糖的中药免疫增强剂。
实施例三
一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其步骤如下：
（1）取赤灵芝子实体根茎洗净、切块，置于105℃烘箱灭酶5 min；灭酶结束后置于55℃烘箱干燥，粉碎，过40目筛；
（2）加入5倍体积分数95%乙醇水浴加热，除去小分子单糖和脂肪，过滤，滤渣至阴凉通风处晾干，并于4℃下密封放置备用；
（3）取经预处理后灵芝干燥粉末10g，然后将药材粉末置于100mL圆底烧瓶中按料液比1:20加入蒸馏水，恒温水浴100℃中提取1 h，过滤，重复操作3次；
（4）合并提取液，浓缩至150mL，再缓缓加入3倍体积即450mL的95%乙醇混合，边加边搅拌，静置12 h；
（5）将步骤（4）中静置12h后的提取液在3000r/min的离心机下离心15min，随后用蒸馏水透析3d；
（6）收集所得成分置于水浴锅上80℃将乙醇彻底挥尽，得膏状物；
（7）将膏状物冷冻干燥至恒重，即得粗制灵芝多糖中药免疫增强剂，使用硫酸苯酚法测定粗制灵芝多糖中药免疫增强剂中的灵芝多糖含量；
（8）取1日龄非免疫雏鸡，饲养至14日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时，给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含50mg灵芝多糖的中药免疫增强剂；
（9）28日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行进行二次免疫，二次免疫时给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含50mg灵芝多糖的中药免疫增强剂。
试验例：
1、取1日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡225只，随机分为5组，每组45只；
2、第一组为空白对照组（BC），不用新城疫免疫疫苗；
3、第二组为免疫对照组（VC），14日龄时使用新城疫Ⅳ滴鼻、点眼，进行首次免疫，28日龄时进行二次免疫；
4、第三组为实施例一组，14日龄时按照实施例一的步骤使用新城疫疫苗进行首次免疫，并连续灌服三日实施例一中的灵芝多糖中药免疫增强剂，28日龄时按照实施例一的步骤使用新城疫疫苗进行二次免疫，并连续灌服三日实施例一中的灵芝多糖中药免疫增强剂；
5、第四组为实施例二组，14日龄时按照实施例二的步骤使用新城疫疫苗进行首次免疫，并连续灌服三日实施例二中的灵芝多糖中药免疫增强剂，28日龄时按照实施例二的步骤使用新城疫疫苗进行二次免疫，并连续灌服三日实施例二中的灵芝多糖中药免疫增强剂。
6、第五组为实施例三组，14日龄时按照实施例二的步骤使用新城疫疫苗进行首次免疫，并连续灌服三日实施例二中的灵芝多糖中药免疫增强剂，28日龄时按照实施例二的步骤使用新城疫疫苗进行二次免疫，并连续灌服三日实施例三中的灵芝多糖中药免疫增强剂。
各项检测数据如下：
（1）灵芝多糖对外周血淋巴细胞转化功能的影响
表1 雏鸡外周血淋巴细胞增殖测定（A570）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：1、竖排相同字母代表组间差异不显著，表2、3、4、5同。
2、D7为首次免疫后第七天；D14为首次免疫后第14天；D21为首次免疫后第21天；D28为首次免疫后第28天，表2、3、4、5同。
由表1可以看出，首免后第7天和第14天，高中低三个多糖组的吸光度值均显著大于空白对照组（P< 0.05）和免疫对照组（P<0.05），其中中剂量组（25 mg·kg-1）吸光度值均显著大于高剂量组（50 mg·kg-1）（P< 0.05）和低剂量组（12.5 mg·kg-1）（P< 0.05）；首免后第21天，三个多糖组的吸光度值均显著大于空白对照组（P< 0.05），但与免疫对照组差异不显著，三个多糖组的吸光度值差异也不显著，但以中剂量组（25 mg·kg-1）吸光度值最高；首免后第28天，三个多糖组的吸光度值均显著大于空白对照组（P< 0.05），其中高剂量组（50 mg·kg-1）、中剂量组（25 mg·kg-1）的吸光度值显著大于免疫对照组（P< 0.05），低剂量组与免疫对照组差异不显著。
（2）灵芝多糖对鸡血清ND-HI抗体效价的影响
表2 各组雏鸡血清抗体效价变化(Log2)
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由表2和图1可以看出，首免后第7天，三个多糖组的抗体效价显著高于空白对照组（P< 0.05)，高剂量组（50 mg·kg-1）、中剂量多糖组（25 mg·kg-1）的抗体效价显著高于免疫对照组（P< 0.05)；首免后第14天，多糖组的抗体效价均显著高于空白对照组（P< 0.05)，中剂量多糖组（25 mg·kg-1）的抗体效价显著大于免疫对照组（P< 0.05)，高、低剂量组与免疫对照组差异不显著；首免后第21天，所有多糖组抗体效价均显著大于空白对照组（P<0.05)，但与免疫对照组差异不显著；首免后第28天，三个多糖组的抗体效价显著高于空白对照组（P< 0.05)，中剂量多糖组（25 mg·kg-1）的抗体效价显著大于免疫对照组（P<0.05)。
（3）灵芝多糖对免疫雏鸡免疫器官指数的影响
表3 雏鸡免疫器官指数变化
Figure DEST_PATH_IMAGE003
免疫雏鸡器官指数的动态变化见表3。首免后的第28天，高剂量组（50 mg·kg-1）的法氏囊指数、胸腺指数及脾脏指数与空白对照组和免疫对照组差异不显著。中剂量组（25 mg·kg-1）的法氏囊指数、胸腺指数及脾脏指数均显著大于空白对照组（P< 0.05)，胸腺指数显著大于免疫对照组（P< 0.05)；低剂量组（12.5 mg·kg-1）的法氏囊指数、脾脏指数均显著大于空白对照组（P< 0.05)，但与免疫对照组差异不显著，其胸腺指数大于空白对照组和免疫对照组，但差异均不显著。各多糖组之间相比，中剂量组（25 mg·kg-1）的法氏囊指数、胸腺指数及脾脏指数均高于高剂量组和低剂量组。
（4）灵芝多糖对免疫雏鸡外周血淋巴细胞因子表达的影响
①对免疫雏鸡外周血淋巴细胞IL-6 mRNA表达影响
表4赤灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞中IL-6 mRNA表达的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注：同列数据后所标字母相异表示差异显著（P <0.05），所标字母相同表示差异不显著（P>0.05）。
由表4、图2可以看出，高中低三个多糖组的鸡外周血淋巴细胞中IL-6 mRNA的相对表达量显著高于空白对照组（P<0.05），其中GLP在50、25 mg·kg-1时，雏鸡外周血淋巴细胞中IL-6 mRNA的相对表达量显著高于免疫对照组（P<0.05），GLP在12.5 mg·kg-1时，雏鸡外周血淋巴细胞中IL-6 mRNA的相对表达量高于免疫对照组，但与免疫对照组差异不显著。三个多糖组中，GLP在50mg·kg-1时，雏鸡外周血淋巴细胞中IL-6 mRNA的相对表达量高于25、12.5 mg·kg-1g剂量组，但差异不显著。
②对免疫雏鸡外周血淋巴细胞IFN-γ mRNA表达影响
表5 赤灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞中IFN-γ mRNA表达的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
注：同列数据后所标字母相异表示差异显著（P <0.05），所标字母相同表示差异不显著（P>0.05）。
赤灵芝多糖对免疫雏鸡外周血淋巴细胞中IFN-γ mRNA表达的影响见表5，图3，GLP在50、25 mg·kg-1时，免疫雏鸡外周血淋巴细胞中IFN-γ mRNA的相对表达量显著高于空白对照组（P<0.05）和免疫对照组（P<0.05），GLP在12.5 mg·kg-1时，免疫雏鸡外周血淋巴细胞中IFN-γ mRNA的相对表达量显著高于空白对照组（P<0.05），但与免疫对照组差异不显著。三个多糖组中，GLP在25 mg·kg-1时，免疫雏鸡外周血淋巴细胞中IFN-γ mRNA的相对表达量显著高于50、12.5 mg·kg-1g剂量组（P<0.05）。
（5）灵芝多糖对盲肠扁桃体和十二指肠黏膜SIgA的影响
①对免疫雏鸡盲肠扁桃体SIgA阳性细胞数变化影响
二免后第14天，各组盲肠扁桃体切片中棕色细胞为SIgA阳性细胞，各组盲肠扁桃体SIgA阳性细胞数量见图4。3个赤灵芝多糖组盲肠扁桃体SIgA阳性细胞数量显著高于空白对照组和免疫对照组（P<0.05），表明赤灵芝多糖在50、25、12.5 mg·kg-1的剂量时能够显著增加盲肠扁桃体SIgA阳性细胞的数量，其中赤灵芝多糖在25 mg·kg-1剂量时盲肠扁桃体SIgA阳性细胞数量最多。
②对免疫雏鸡十二指肠SIgA阳性细胞数变化影响
染色后，SIgA细胞主要分布于十二指肠的绒毛基部固有层，各组十二指肠SIgA阳性细胞数量及其分布见图5。各赤灵芝多糖组十二指肠SIgA阳性细胞数量显著高于空白对照组（P<0.05），也显著高于免疫对照组（P<0.05），表明赤灵芝多糖在50、25、12.5 mg·kg-1的剂量时能够增加十二指肠SIgA阳性细胞的数量。
结论：在雏鸡首免、二免新城疫疫苗时，同时经口灌服灵芝多糖，连续给药3天。在12.5-50 mg·kg-1的剂量范围内，灵芝多糖能显著提高鸡新城疫疫苗免疫雏鸡的血清抗体效价，促进免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖，提高免疫器官指数，促进免疫雏鸡外周血淋巴细胞IL-6、IFN-γ mRNA的表达，提高免疫雏鸡十二指肠和盲肠扁桃体的SIgA阳性细胞数量，提高免疫雏鸡的黏膜免疫功能，提升机体免疫力。
以上仅为本发明较佳的实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明说明书内容所作的等效变化与装饰，皆应属于本发明覆盖的范围内。

Claims (3)

1.一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于其步骤如下：
（1）取赤灵芝子实体根茎洗净、切块，置于105℃烘箱灭酶5 min；灭酶结束后置于55℃烘箱干燥，粉碎，过40目筛；
（2）加入5倍体积分数95%乙醇水浴加热，除去小分子单糖和脂肪，过滤，滤渣至阴凉通风处晾干，并于4℃下密封放置备用；
（3）取经预处理后灵芝干燥粉末10g，然后将药材粉末置于100mL圆底烧瓶中按料液比1:20加入蒸馏水，恒温水浴100℃中提取1 h，过滤，重复操作3次；
（4）合并提取液，浓缩至150mL，再缓缓加入3倍体积即450mL的95%乙醇混合，边加边搅拌，静置12 h；
（5）将步骤（4）中静置12h后的提取液在3000r/min的离心机下离心15min，随后用蒸馏水透析3d；
（6）收集所得成分置于水浴锅上80℃将乙醇彻底挥尽，得膏状物；
（7）将膏状物冷冻干燥至恒重，即得粗制灵芝多糖中药免疫增强剂，使用硫酸苯酚法测定粗制灵芝多糖中药免疫增强剂中的灵芝多糖含量；
（8）取1日龄非免疫雏鸡，饲养至14日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行首次免疫，首次免疫的同时，给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg灵芝多糖的中药免疫增强剂；
（9）28日龄时用新城疫Ⅳ滴鼻和点眼进行二次免疫，二次免疫时给雏鸡经口灌服灵芝多糖中药免疫增强剂，连续给药3天，每次给药剂量以灵芝多糖中药免疫增强剂中所含的灵芝多糖计则其给药计量为12.5-50mg/kg体重，即1kg重的雏鸡灌服包含12.5mg-50mg灵芝多糖的中药免疫增强剂。
2.根据权利要求1中所述的一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于步骤（8）、步骤（9）中，首次免疫、二次免疫时灌 服的灵芝多糖中药免疫增强剂浓度相同。
3.根据权利要求1中所述的一种灵芝多糖用于制备中药免疫增强剂的用途，其特征在于灵芝多糖中药免疫增强剂的浓度为25 mg·kg-1体重。
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