CN108553504A - 参芪粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种参芪粉,所述参芪粉的制备方法包括如下步骤:(1)将党参、黄芪饮片按照质量比为1:4的处方混合,加8倍量水,浸泡、煎煮回流,过滤分别收集滤渣、滤液;(2)在步骤(1)制得的滤渣中再加8倍量水,煎煮回流,过滤分别收集滤渣、滤液;(3)在步骤(2)制得的滤渣中再加8倍量水,煎煮回流,过滤分别收集滤渣、滤液;(4)合并步骤(1)、(2)、(3)所得的滤液,减压浓缩成浓缩液,之后喷雾干燥,制得所述参芪粉。本发明参芪粉在临床中用于预防免疫抑制疾病和调节动物免疫力,使动物健康,减少疾病的发生和抗生素的使用量,具有良好的经济效益和生态效益。
Description
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域,尤其是涉及一种以党参和黄芪为原料,经 过水煎煮制得的提取物及其制备方法。
背景技术
上世纪40年代开始,化学合成药物及抗生素的应用曾带动了畜牧业迅猛发 展。随着消费者环保意识和健康意识的增强,有药物残留的肉食品销路明显受 阻,养殖业经济利益受到威胁。养殖业面临产业结构升级与调整,向绿色生态 养殖发展。
随着畜牧业的发展,畜禽疾病也越来越复杂,其中有许多疾病具有免疫抑制 性。免疫抑制,就是在一种或多种致病因素的作用下,畜禽免疫系统受损,导 致暂时性的或持久性的免疫应答功能紊乱。在这类疾病中,有的临床症状表现 明显,其危害性容易被人们所认识和重视,而有些疾病则不表现明显的临床症 状,但由于造成的免疫抑制使机体的免疫力下降,容易使家禽感染其它继发症, 造成治疗难度大,死亡率高,给养殖业造成巨大的经济损失。现代医学研究表 明,许多中药具有免疫增强作用,能刺激免疫系统,提高免疫系统组织细胞活 性,增加机体免疫细胞的生长及抗体的合成。
党参、黄芪是常用的补气药,党参味甘性平,具有补中益气、健脾益肺功能; 黄芪味甘性温,具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托毒排脓、敛疮生肌等 功能。党参主要含党参多糖、黄酮类、生物碱和挥发油等成分,具有增强免疫、 抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。黄芪主要含黄芪多糖,是黄芪发挥免疫 增强作用的主要成分,此外还有黄芪皂甙、黄酮类、氨基酸、微量元素等多种 成分,具有增强免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种功能,能影响 动物胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官的发育,促进淋巴细胞转化和增殖及巨噬 细胞吞噬功能,提高动物机体的细胞免疫和体液免疫能力。黄芪党参汤在民间 常用于提高人体免疫力,用于体弱者和病后恢复期的病人提高机体抵抗力,增 强体质。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明申请人提供了一种参芪粉及其制备方 法。本发明以党参、黄芪为原料研制开发出参芪提取物拟用作动物免疫增强剂, 在临床中用于预防免疫抑制疾病和调节动物免疫力,使动物健康,减少疾病的 发生和抗生素的使用量,具有良好的经济效益和生态效益。
本发明的技术方案如下:
一种参芪粉,所述参芪粉以党参、黄芪为原料,经过水煎煮提取制得;所述 党参与黄芪的质量比为1:4。
一种所述参芪粉的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将党参、黄芪饮片按照质量比为1:4的处方混合,加8倍量水,浸泡 30min,之后煎煮回流提取30min,过滤分别收集滤渣、滤液;
(2)在步骤(1)制得的滤渣中再加8倍量水,煎煮回流提取30min,过滤 分别收集滤渣、滤液;
(3)在步骤(2)制得的滤渣中再加8倍量水,煎煮回流提取30min,过滤 分别收集滤渣、滤液;
(4)合并步骤(1)、(2)、(3)所得的滤液,减压浓缩成浓缩液,之后喷雾 干燥,制得所述参芪粉。
所述浸泡温度为30~35℃,煎煮回流温度95~100℃。
所述减压浓缩的条件为:一效温度:85℃、二效温度:75℃、一效真空负压:0.04MPa、二效真空负压:0.08MPa,循环冷却水0.2MPa条件下浓缩8小时。
所述浓缩液的相对密度为1.01。
本发明有益的技术效果在于:
本发明参芪粉,是立足于国内外养殖情况,适应当前畜牧业的需求,同时作 为一种天然药物疗效确切、无毒、无残留,为保障动物健康和养殖业的健康发 展提供保障,同时对引导无公害生态养殖,促进产业结构升级也有一定的意义。
本发明参芪粉是由党参和黄芪提取制备的中药制剂。党参主要含党参多糖、 黄酮类、生物碱和挥发油等成分,具有增强免疫、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等 药理作用。黄芪主要含黄芪多糖,是黄芪发挥免疫增强作用的主要成分,此外 还有黄芪皂甙、黄酮类、氨基酸、微量元素等多种成分,具有增强免疫、抗肿 瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种功能,能影响动物胸腺、脾脏和法氏囊等 免疫器官的发育,促进淋巴细胞转化和增殖及巨噬细胞吞噬功能,提高动物机 体的细胞免疫和体液免疫能力,黄芪皂苷能增强巨噬细胞的免疫作用,通过升 高细胞内Ca2+浓度激活巨噬细胞发挥免疫调节作用。因此,参芪粉增强免疫的 效果可靠。
用参芪粉配合新城疫疫苗免疫雏鸡,多个剂量组在多个时间点的抗体效价显 著高于不给药的免疫对照组和给予左旋咪唑-黄芪多糖的药物对照组,表明参芪 粉有较好的增强体液免疫作用。健康观察和增重测定结果显示,参芪粉对鸡的 健康和生长无不良影响,尤其是前几个高剂量组的日均增重多显著高于药物对 照组、免疫对照和空白对照组,表明参芪粉有较好的促进增重作用,临床应用 安全。各剂量组相比,以0.1%比例饮水组的效果最好,其次为0.125%和0.075% 组。因此,0.1%比例饮水可以作为临床试验的最佳剂量。
附图说明
图1为本发明制备方法的流程图。
图2为本发明亚毒性测试中高剂量组小鼠肝脏切片(×200)。
图3为本发明亚毒性测试中高剂量组小鼠肾脏切片(×400)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。
实施例1
一种参芪粉,所述参芪粉以党参、黄芪为原料,经过水煎煮提取制得;制备 方法包括如下步骤:
(1)将20g党参、80g黄芪饮片混合,加8倍量水,30℃条件下浸泡30min, 之后95℃煎煮回流提取30min,过滤分别收集滤渣、滤液;
(2)在步骤(1)制得的滤渣中再加8倍量水,100℃煎煮回流提取30min, 过滤分别收集滤渣、滤液;
(3)在步骤(2)制得的滤渣中再加8倍量水,100℃煎煮回流提取30min, 过滤分别收集滤渣、滤液;
(4)合并步骤(1)、(2)、(3)所得的滤液,减压浓缩(一效温度:85℃、 二效温度:75℃、一效真空负压:0.04MPa、二效真空负压:0.08MPa,循环冷 却水0.2MPa)8h,至相对密度为1.01,制得浓缩液,之后喷雾干燥,制得所述 参芪粉。
测试例:
(1)稳定性测试:将实施例1制得的参芪粉置于温度为40±2℃、相对湿度 为75%±5%的药物稳定性实验箱内,分别在第0月、1月、2月、3月和6月末 各取样一次,参照“参芪粉”质量标准方法(农业部第1796号公告),采用蒸 发光散射检测器检测黄芪甲苷含量,采用苯酚-硫酸法测定参芪混合提取物中多 糖的含量,产品加速稳定性结果见表1。
表1
检查项目 | 0月 | 1月 | 2月 | 3月 | 6月 |
性状 | 符合规定 | 符合规定 | 有轻微结块现象 | 出现整体结块 | 整体结块且较硬 |
黄芪甲苷鉴别 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
党参炔苷鉴别 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
水分(%) | 7.43 | 7.26 | 7.57 | 8.30 | 8.53 |
黄芪甲苷含量(%) | 0.20 | 0.21 | 0.19 | 0.20 | 0.18 |
总多糖含量测定(%) | 75.72 | 76.12 | 75.49 | 75.82 | 76.15 |
将本发明实施例1所得参芪粉置于温度为25±2℃、湿度为60±5%的人工气 候箱中,分别于第0月、3月、6月末各取样一次,照“参芪粉”质量标准(草案) 方法,依法测定,长期稳定性实验结果见表2。
表2
检查项目 | 0月 | 3月 | 6月 | 9月 | 12月 |
性状 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
黄芪甲苷鉴别 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
党参炔苷鉴别 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
水分(%) | 7.45 | 7.64 | 7.48 | 7.82 | 7.94 |
黄芪甲苷含量(%) | 0.20 | 0.20 | 0.21 | 0.18 | 0.19 |
总多糖含量(%) | 75.72 | 76.18 | 75.93 | 76.06 | 76.23 |
(2)主要药效学和安全药理学体内试验:选用购自南京汤泉农垦种鸡场的1 日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡,饲养至14日龄时取300只,随机分为10组,每 组30只,空白对照组隔离饲养,不做任何处理;其余9组分别用NDV-Ⅳ(中 牧股份南京药械厂产品,批号090820)滴鼻、点眼免疫(3羽份/羽),本发明参 芪粉的7个剂量组分别按0.2%、0.175%、0.15%、0.125%、0.1%、0.075%和0.05% 的比例饮服参芪粉,药物对照组按0.2%的比例饮服盐酸左旋咪唑-黄芪多糖(湖 南威克尔生物科技有限公司产品,每袋100g,含盐酸左旋咪唑5g、黄芪多糖8g, 批号20090112),连用7天。给药后分别观察鸡的健康状况、血清抗体效价和增 重情况。
(2.1)健康状况:给药后每天观察鸡的精神、活动、采食、饮水和发病死亡 情况,死亡鸡剖检。通过观察发现整个试验期间,各组鸡均精神活泼、采食、 饮水和粪便正常,未出现发病和死亡,尤其是高剂量组的鸡生长最好,未见任 何不良反应。
(2.2)清抗体效价:分别于免疫后第7d(D7)、14d(D14)、21d(D21)和 28d(D28)每组随机抽取6羽翼静脉采血,分离血清,用β-微量法检测ND-HI 抗体效价。测试结果见表3。
(2.3)增重情况:分别于免疫前、免疫后第7d(W1)、14d(W2)、21d(W3)、 28d(W4)每组随机抽取15只称重,计算平均体重,作为末重,以前一时间点平 均体重为始重计算平均日增重。平均日增重(g/d/羽)=(平均末重-平均始重) ÷饲喂天数。测试结果见表4。
表3
注:同列数据上标无相同字母者差异显著(P<0.05),下同。
由表3可以看出,免疫后第7d,参芪粉除0.175%组外其余剂量组的抗体效 价均显著高于免疫对照组和药物对照组(P<0.05),以0.1%组最高,显著高于 除0.075%外的其余剂量组;免疫后第14d,参芪粉前6个剂量组的抗体效价均 显著高于免疫对照组和药物对照组(P<0.05),以0.1%组最高,显著高于除 0.125%组外的其余剂量组;免疫后第21d,0.1%、0.125%、0.075%和0.15%组 的抗体效价显著高于免疫对照组和药物对照组(P<0.05),以0.1%组最高,显 著高于除0.125%组外的其余剂量组(P<0.05);免疫后第28d,0.1%、0.125%、 0.15%和0.2%组的抗体效价显著高于免疫对照组和药物对照组(P<0.05);以 0.1%组最高,显著高于除0.125%组外的其余剂量组(P<0.05)。
表4
组别 | W1 | W2 | W3 | W4 |
0.2% | 8.64±0.08a | 9.83±0.48a | 12.16±0.68a | 8.79±0.41a |
0.175% | 8.08±0.44b | 9.64±0.32a | 11.90±0.60ab | 8.64±0.54a |
0.15% | 7.32±0.42cde | 9.62±0.35a | 11.76±0.42ab | 8.47±0.32a |
0.125% | 7.72±0.23bcd | 9.76±0.20a | 11.56±0.49abc | 8.39±0.24a |
0.1% | 7.78±0.26bcd | 9.62±0.42a | 11.06±0.49bcd | 8.24±0.18ab |
0.075% | 7.52±0.37bcde | 8.79±0.42b | 10.73±0.52cde | 7.79±0.38bc |
0.05% | 7.26±0.22de | 7.85±0.51cd | 9.76±0.55f | 7.36±0.22c |
药物对照 | 7.89±0.29bc | 8.39±0.39bc | 9.27±0.48f | 7.37±0.17c |
免疫对照 | 7.33±0.29cde | 7.59±0.52d | 10.14±0.56def | 7.17±0.25c |
空白对照 | 7.02±0.35e | 7.37±0.30d | 10.06±0.18ef | 7.40±0.42c |
由表4可以看出,免疫后第1周,参芪粉0.2%和0.175%组的平均日增重显 著高于免疫对照组和空白对照组(P<0.05),0.2%组显著高于药物对照组 (P<0.05);免疫后第2周,参芪粉前6个剂量组的平均日增重显著高于免疫对 照组和空白对照组(P<0.05),前5个剂量组显著高于药物对照组(P<0.05);免 疫后第3周,参芪粉前4个剂量组的平均日增重显著高于免疫对照组和空白对 照组(P<0.05),前6个剂量组显著高于药物对照组(P<0.05);免疫后第4周, 参芪粉前5个剂量组的平均日增重显著高于药物对照组、免疫对照组和空白对 照组(P<0.05)。
(3)安全药理学体外试验:将本发明实施例1所得参芪粉用三蒸水配成250 μg·mL-1溶液,100℃煮沸30min消毒,临用前用RPMI1640培养液自125μg·mL-1倍比稀释至0.123μg·mL-1共11个浓度,测定其最大安全浓度。
(3.1)对淋巴细胞安全浓度的测定:用MTT法,取成年鸡心脏无菌采血, 肝素抗凝,血样用Hank’s液稀释1倍,小心加在淋巴细胞分离液上层,2000rpm 离心20min,吸取中间云雾状白细胞层,用Hank's液洗2遍,1500rpm离心15 min。细胞计数活细胞大于90%后,用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个·mL-1,加入到96孔细胞培养板中,每孔100μL,然后每孔加入各浓度参芪粉 100μL,每个样品重复4孔,另设细胞对照孔。将细胞板置于39.5℃、5%CO2条件下培养44h,每孔加入MTT 30μL,继续培养4h后,每孔加裂解液DMSO100 μL,将细胞板置于微量震荡器上震荡5min使沉淀完全溶解,在酶联免疫仪上 检测570nm处的吸光度(A570值)。选择A570值不显著小于细胞对照组的浓度作 为参芪粉的最大安全浓度。测试结果见表5。
(3.2)淋巴细胞增殖测定:用MTT法,根据安全浓度测定结果,将参芪粉 用RPMI1640培养液自7.813μg·mL-1倍比稀释至0.016μg·mL-1共10个浓度备 用。淋巴细胞制备过程同上,活细胞计数后用RPMI1640培养液调整细胞浓度 为5×106个·mL-1,分为2份,其中1份加入PHA(终浓度为10μg·mL-1),然后 分别加入到96孔细胞培养板中,每孔100μL,然后每孔加入各浓度参芪粉100 μL,每个样品重复4孔,另设细胞对照和PHA的对照孔,同上法测定A570值。 测试结果见表6。
表5
注:同列数据标注无相同字母者差异显著(P<0.05)。
由表5可以看出,参芪粉在125~15.625μg·mL-1范围内的A570值显著小于细 胞对照组(P<0.05),在7.813μg·mL-1时的A570值不显著小于细胞对照组,因此 可将该浓度定为参芪粉的最大安全浓度。在0.977~0.245μg·mL-1时的A570值显 著大于细胞对照组(P<0.05),表明此浓度范围内能显著促进淋巴细胞增殖。
表6
注:同列数据标注无相同字母者差异显著(P<0.05)。
由表6可以看出,参芪粉在7.813~0.016μg·mL-110个浓度组的A570值均显 著高于细胞对照组(P<0.05),表明参芪粉单独能显著刺激淋巴细胞增殖。参芪 粉+PHA在7.813~1.953μg·mL-1组的A570值显著大于PHA对照组(P<0.05), 说明参芪粉在这些浓度能协同PHA显著刺激淋巴细胞增殖。
(4)急性毒性试验:将本发明实施例1制得的参芪粉用蒸馏水溶解,稀释 成0.8g·mL-1的药液,取小鼠20只,雌雄各半,适应3天后,每只小鼠每次灌 服0.6mL参芪粉药液,12h内灌服2次,给药后每天观察小鼠的毒性反应及死 亡情况,如有死亡,剖检观察病理变化,连续观察14天。
通过试验发现,小鼠在灌药后有精神沉郁、扎堆等不适反应,但很快恢复正 常。此后再未出现任何异常反应,14天内所有小鼠无死亡。小鼠一日内总给药 量为0.96g,相当于48g/kg·W。这说明小鼠对参芪粉的最大耐受量为48g/kg·W。 根据规定,LD50在5g/kg·W以上者为实际无毒,而参芪粉的最大耐受量为48 g/kg·W,远远大于5g/kg·W,因此认为参芪粉无毒,临床应用安全。
(5)亚慢性毒性试验:将本发明实施例1制得的参芪粉药粉用蒸馏水溶解, 稀释成0.6、0.3和0.075g/mL,根据急性毒性试验结果和临床用药剂量,拟定高、 中、低剂量分别为15.0、7.5和1.875g/kg·W。选清洁级健康ICR小鼠80只, 体重18~22g,购于南通大学实验动物中心,合格证号SCXK(苏)2008-0010。预 饲7天后随机分为4组,每组20只,雌雄各半,分笼饲养。参芪粉的高、中、 低剂量组分别灌服的高、中、低浓度的参芪粉药液0.5mL,对照组灌服等量生 理盐水,每天1次,连续灌胃28天。停药后观察14天。观察小鼠的健康情况、 增重情况、器官、血液指标等。
(5.1)健康情况:每天观察小鼠的活动、采食、饮水、发病和死亡情况,对 死亡小鼠剖检,记录病理变化。结果发现小鼠在前3次灌药后有轻微精神不振、 扎堆、粪便稀软等不适现象,此后未见异常,整个试验期间各组小鼠精神良好, 无死亡。
(5.2)增重情况:在给药期间和观察期间,参芪粉3个剂量组小鼠的平均增 重稍低于对照组,但无显著差异(P>0.05),结果如表7所示。
表7
注:同列数据上标字母不同者差异显著(P<0.05)。下同。
(5.3)器官指数的变化:停药后第1天,各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾 指数均无显著差异(P>0.05);停药后第14天,各组小鼠的心、肝、脾、肺、 肾指数均无显著差异(P>0.05)检测结果分别见表8、9。
表8(n=6)
表9(n=6)
(5.4)血液学指标的变化:停药后第1天,参芪粉中剂量组小鼠的L Y显 著高于其余各组(P<0.05),各组小鼠的WBC、RBC、HB、PLT均无显著差异 (P>0.05)(表10)。停药后第14天,各组小鼠的WBC、RBC、HB、PLT和L Y 均无显著差异(P>0.05)(表10、11)。
表10
表11
(5.5)血液生化指标:停药后第1天,各组小鼠的ALT、AST、ALP和 BUN均无显著差异(P>0.05)(表12)。停药后第14天,各组小鼠的AST、ALP 和BUN均无显著差异(P>0.05)(表13)。
表12
表13
(5.6)剖检和组织学变化:在停药后第1和14天,剖检见各组小鼠各器官 的颜色、大小、硬度均正常,未见出血、肿胀、坏死等眼观病理变化。组织学 检查,心、肝、脾、肺、肾的切片未见明显的病理变化(图2、图3)。
试验结果显示,用参芪粉灌胃,小鼠仅在前3次灌药后有不适现象,属于 灌药刺激反应。连续给药28天及停药后14天,各组小鼠均无死亡,平均增重、 器官指数、血清生化指标均无显著差异,剖检和组织学观察未见明显的病理变 化,多数血液学指标无显著差异,表明参芪粉无明显的亚慢性毒性。
血液学检查发现,在停药后第1天中剂量组的淋巴细胞百分率显著高于对 照组。淋巴细胞是机体的免疫细胞,主要参与机体的特殊免疫反应,本试验结 果说明参芪粉还有一定的增强免疫作用。
本试验中参芪粉的3个剂量都远远大于临床用药剂量,且给药时间长达4 周,在给药后和给药后2周内小鼠各项指标无显著异常,证明长期服用参芪粉 没有明显的毒副作用,临床应用安全。
(6)增强鸡新城疫疫苗免疫效果试验:选用购自南京汤泉农垦种鸡场的1 日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡,饲养至14日龄时(测得母源抗体效价3.3log2) 选取600只,随机分为6组。空白对照组60只隔离饲养,不做任何处理。其余 5组,每组90只(免疫对照组另加90只用于攻毒剂量测定),设3个重复,均 用新城疫IV系苗滴鼻点眼免疫,2羽份/羽;28日龄重复免疫;在免疫的同时, 3个药物试验组开始饮服高(0.15%)、中(0.1%)、低(0.05%)剂量的参芪粉, 药物对照组开始饮服盐酸左旋咪唑-黄芪多糖粉(0.1%)(湖南威克尔生物科技有限公司产品,每袋100g,含盐酸左旋咪唑5g、黄芪多糖8g,批号20090112), 连续7天,免疫对照组不给药;42日龄时,各组留取60只,用新城疫强毒攻毒, 同时3个药物试验组和药物对照组饮服相应药物,连续7天,免疫对照组不给 药。分别于首免后第7(D7)、14(D14)、21(D21)和28(D28)d采血,用β- 微量法和MTT法测定血清新城疫抗体效价和外周血淋巴细胞增殖。42日龄时各 组留取60只,用新城疫强毒攻毒,同时饮服相应药物,连续7d。每天观察新城 疫的发病和死亡情况,连续观察14d,统计发病率、死亡率和免疫保护率。
结果显示,参芪粉高、中剂量能显著提高抗体效价,促进淋巴细胞增殖,提 高新城疫苗的免疫效果,对雏鸡有一定的促进增重作用,在多数时间点的效果 优于药物对照组,高、中剂量组之间多无显著差异。表明参芪粉高、中剂量有 较好的增强免疫作用。鉴于高、中剂量之间多无显著差异,建议中剂量作为临 床应用剂量。
(6.1)新城疫抗体效价:分别于首免后第7d(D7)、14d(D14)、21d(D21)、 28d(D28)每组随机抽取12只(每个重复4只),翼静脉采血,分离血清,用 β-微量法测定新城疫抗体效价。结果见表14。
表14(log2)
组别 | D7 | D14 | D21 | D28 |
药物高剂量 | 5.67±0.52a | 7.00±0.00a | 7.17±0.41b | 7.83±0.41a |
药物中剂量 | 5.83±0.41a | 7.33±0.52a | 7.83±0.75a | 8.17±0.75a |
药物低剂量 | 4.17±0.41bc | 5.33±0.52b | 5.83±0.41cd | 6.17±0.41c |
药物对照 | 4.33±0.52b | 5.50±0.55b | 6.17±0.75c | 6.83±0.75b |
免疫对照 | 3.67±0.51c | 5.17±0.41b | 5.50±0.55d | 5.67±0.52d |
空白对照 | 2.50±0.55d | 2.40±0.54c | 2.20±0.45e | 2.00±0.00e |
注:同列数据上标无相同字母者差异显著(P<0.05),下同。
由表14可以看出,在首免后第7天(D7),参芪粉高、中剂量组和药物对照 组的抗体效价显著高于免疫对照组(P<0.05),高、中剂量组显著高于药物对照 组(P<0.05),高、中剂量组之间无显著差异(P>0.05);在D14,参芪粉高、 中剂量组的抗体效价显著高于其余各组(P<0.05),高、中剂量组之间无显著差 异(P>0.05);在D21,参芪粉高、中剂量组和药物对照组的抗体效价显著高于 其余各组(P<0.05),中剂量组显著高于高剂量组和药物对照组(P<0.05);在 D28,参芪粉3个剂量组和药物对照组的抗体效价显著高于免疫对照组(P< 0.05),高、中剂量组之间无显著差异(P>0.05)。
(6.2)外周血淋巴细胞增殖:分别于首免后第7d(D7)、14d(D14)、21d (D21)、28d(D28),每组随机抽取6只(每个重复2只),心脏采血,肝素抗 凝,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖。主要步骤为:分离淋巴细胞,活细胞 计数,调整细胞浓度为2.5×106个·mL-1,加入到96孔细胞培养板中,80μL/孔, 每孔再加20μL PHA(终浓度为10μg·mL-1),每个样品重复6孔,39.5℃、5%CO2培养44h,每孔加入20μL MTT(终浓度为1.0mg·mL-1),继续培养4h,每孔加裂解液二甲亚砜(DMSO)100μL,在酶联免疫仪上检测570nm处的吸光度 (A570值),作为淋巴细胞增殖的指标。测试结果见表15。
表15(A570值)
组别 | D7 | D14 | D21 | D28 |
药物高剂量 | 0.288±0.024a | 0.262±0.008a | 0.225±0.012a | 0.249±0.019a |
药物中剂量 | 0.278±0.023a | 0.254±0.018ab | 0.217±0.007a | 0.240±0.017a |
药物低剂量 | 0.217±0.015bc | 0.185±0.009c | 0.194±0.010ab | 0.190±0.015b |
药物对照 | 0.253±0.020ab | 0.229±0.010b | 0.173±0.015b | 0.156±0.016b |
免疫对照 | 0.207±0.005bc | 0.196±0.006c | 0.171±0.010b | 0.158±0.020b |
空白对照 | 0.187±0.008c | 0.182±0.006c | 0.165±0.001b | 0.146±0.013b |
由表15数据可以看出,在D7,参芪粉高、中剂量组的A570值显著大于除药 物对照组外的其余各组(P<0.05),高、中剂量组之间无显著差异;在D14,参 芪粉高、中剂量组和药物对照组的A570值显著大于免疫对照组(P<0.05),高、 中剂量之间无显著差异,高剂量组显著大于药物对照组(P<0.05);在D21,参 芪粉高、中剂量组的A570值显著大于除低剂量组外的其余各组(P<0.05),两组 之间无显著差异;在D28,参芪粉高、中剂量组的A570值显著大于其余各组(P< 0.05),两组之间无显著差异。
(6.3)免疫保护效果:攻毒剂量筛选:32日龄时,从免疫对照组随机抽取 90只,均分为3组,根据以往攻毒成功的经验,分别胸肌注射104、105、106EID50的NDV 0.5mL,观察10d。测得各组的死亡率分别为3.3%、6.7%和10%,选 择106EID50作为攻毒剂量。
攻毒试验:42日龄时,每组留取60只,分别每羽胸肌注射106EID50的NDV 0.5mL。每天观察各组鸡的发病和死亡情况,死亡鸡剖检观察病理变化,连续观 察14d,计算发病率、死亡率和免疫保护率。免疫保护率=存活健康鸡数/样本数。 测试结果如表16所示。
表16
攻毒后第3d(D3),免疫对照组和药物对照组鸡开始零星出现绿色稀便,但 精神和饮食正常;到D4时,少部分鸡只聚堆、羽毛松乱、精神沉郁,采食下降。 参芪粉高、中剂量组发病率较低。
到D5时,免疫对照组和药物对照组鸡开始出现零星死亡。死亡鸡剖检,可 见口腔、鼻孔有黏液,喉头和气管黏膜充血,直肠粘膜和盲肠扁桃体出血,少 数病鸡腺胃乳头出血,黏膜、浆膜出血。到D10时,死亡停止。
至D14时,所有存活鸡全部恢复正常。参芪粉高、中剂量组的免疫保护率为 100%,显著高于其余3组(P<0.05)。
(6.4)增重效果:分别于14、28、42、56日龄时,各组以重复为单位称重, 分别计算14~28、29~42、43~56日龄3个时间段的平均日增重。平均日增重 (g/d/羽)=(平均末重-平均始重)/饲喂天数。测试结果见表17。
表17(g)
组别 | 14~28d | 29~42d | 43~56d |
药物高剂量 | 10.82±0.74a | 12.06±0.68a | 10.48±1.12b |
药物中剂量 | 10.18±0.04ab | 11.61±0.23ab | 10.18±1.36b |
药物低剂量 | 9.61±0.24abc | 9.36±1.06c | 9.24±1.07b |
药物对照 | 9.08±0.31bc | 11.11±0.89ab | 8.98±0.85b |
免疫对照 | 8.62±0.80c | 9.25±0.21c | 8.52±0.81b |
空白对照 | 8.21±0.09c | 10.08±0.09bc | 16.84±1.27a |
在14~28日龄,参芪粉高、中剂量组的日均增重显著大于免疫对照组和空 白对照组(P<0.05),高剂量组显著大于药物对照组(P<0.05),高、中剂量组 之间无显著差异(P>0.05);在29~42日龄,参芪粉高、中剂量组和药物对照 组的日均增重显著大于免疫对照组(P<0.05),3组之间无显著差异(P>0.05); 在43~56日龄,各攻毒组存活鸡的平均日增重显著低于空白对照组,参芪粉3 个剂量组大于免疫对照组和药物对照组,3组之间无显著差异(P>0.05)。
(7)增强猪瘟疫苗免疫效果试验:由无锡南洋农畜有限公司猪场提供20日 龄仔猪150头,随机分为5组,每组30头,各组均用猪瘟疫苗免疫,1头份/头。 同时,3个药物剂量组按0.3%、0.2%和0.1%的比例混饲参芪粉,药物对照组按 0.1%的比例混饲盐酸左旋咪唑-黄芪多糖可溶性粉(湖南威克尔生物科技有限公 司产品,每袋100g,含盐酸左旋咪唑5g、黄芪多糖8g,批号20090112),连续 3d;疫苗对照组,不给药;首免后30d进行二免,1头份/头,同时重复以上给 药3d分别于首免后10d(D10)、20d(D20)、30d(D30)、40d(D40)、50d(D50)、 60d(D60)、70d(D70),每组随机抽取6头,耳缘静脉采血,分离血清,按试 剂盒说明书用正向间接凝集法测定猪瘟抗体效价。同时每组随机抽取6头称重, 统计各组每月的日均增重。
结果显示,用参芪粉配合猪瘟疫苗免疫仔猪,高、中剂量组在多个时间点的 抗体效价显著高于左旋咪唑-黄芪多糖的药物对照组和免疫对照组,前期高剂量 组的效价最高,后期中剂量组的效价最高;高、中剂量组仔猪的日增重多显著 高于药物对照组和免疫对照组,前期中剂量组的日增重最高,后期高剂量组的 日增重最高,表明参芪粉高、中剂量有较好的增强免疫和促进增重作用。鉴于 高、中剂量组之间多无显著差异,建议中剂量为临床应用剂量。
(7.1)猪瘟血清抗体效价:分别于首免后10d(D10)、20d(D20)、30d(D30)、 40d(D40)、50d(D50)、60d(D60)、70d(D70),每组随机抽取6头,耳缘静 脉采血,分离血清,按试剂盒说明书用正向间接凝集法测定猪瘟抗体效价。测 试结果如表18所示。
表18
注:同行数据上标无相同字母者表示差异显著(P<0.05)。
首免后第10d(D10),参芪粉高剂量组抗体效价显著高于免疫对照组(P< 0.05)、高于药物对照组(P>0.05);在D20,参芪粉高、中剂量组抗体效价显著 高于免疫对照组(P<0.05)、高于药物对照组(P>0.05),高、中剂量组之间的 差异不显著(P>0.05);在D30,参芪粉3个剂量组的抗体效价高于免疫对照组 和药物对照组(P>0.05);在D40,参芪粉高、中剂量组和药物对照组抗体效价 显著高于免疫对照组(P<0.05),高、中剂量组之间的差异不显著(P>0.05); 在D50~D70,参芪粉高、中剂量组抗体效价显著高于免疫对照组(P<0.05),中 剂量组显著高于药物对照组(P<0.05)、稍高于高剂量组(P>0.05)。
(7.2)增重变化:分别于首免前和首免后30、60、90d每组随机抽取6头 称重,计算平均日增重的变化。结果见表19所示。
表19
组别 | 25~55日龄 | 55~85日龄 | 85~115日龄 |
药物高剂量组 | 0.364±0.006b | 0.568±0.005a | 0.837±0.011a |
药物中剂量组 | 0.410±0.016a | 0.544±0.025ab | 0.832±0.015a |
药物低剂量组 | 0.326±0.003c | 0.552±0.013ab | 0.814±0.013b |
药物对照组 | 0.296±0.021d | 0.554±0.021ab | 0.809±0.017b |
免疫对照组 | 0.308±0.020d | 0.537±0.025b | 0.806±0.009b |
注:同列数据上标无相同字母者表示差异显著(P<0.05)
在25~55日龄,参芪粉3个剂量组的平均日增重均显著高于药物对照组和 免疫对照组(P<0.05),中剂量组显著高于高、低剂量组(P<0.05),高剂量组 显著高于低剂量组(P<0.05);在55~85日龄,参芪粉高剂量组的平均日增重 显著高于免疫对照组(P<0.05)、高于药物对照组(P>0.05);在85~115日龄, 参芪粉高、中剂量组的平均日增重均显著高于药物对照组和免疫对照组(P< 0.05)。
Claims (5)
1.一种参芪粉,其特征在于,所述参芪粉以党参、黄芪为原料,经过水煎煮提取制得;所述党参与黄芪的质量比为1:4。
2.一种权利要求1所述参芪粉的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将党参、黄芪饮片按照质量比为1:4的处方混合,加8倍量水,浸泡30min,之后煎煮回流提取30min,过滤分别收集滤渣、滤液;
(2)在步骤(1)制得的滤渣中再加8倍量水,煎煮回流提取30min,过滤分别收集滤渣、滤液;
(3)在步骤(2)制得的滤渣中再加8倍量水,煎煮回流提取30min,过滤分别收集滤渣、滤液;
(4)合并步骤(1)、(2)、(3)所得的滤液,减压浓缩成浓缩液,之后喷雾干燥,制得所述参芪粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述浸泡温度为30~35℃,煎煮回流温度95~100℃。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述减压浓缩的条件为:一效温度:85℃、二效温度:75℃、一效真空负压:0.04MPa、二效真空负压:0.08MPa,循环冷却水0.2MPa条件下浓缩8小时。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述浓缩液的相对密度为1.01。
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