CN104069177A

CN104069177A - 复方姬松茸多糖口服液及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104069177A
Application number: CN201410318115.5A
Authority: CN
Inventors: 马吉飞; 郜鹏云; 马彦娜; 范惠章; 秦文安; 葛秀国
Original assignee: Tianjin Agricultural University
Current assignee: Tianjin Agricultural University
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2014-10-01

Abstract

本发明公开了一种复方姬松茸多糖口服液及其应用，它是由姬松茸5-15份，黄芪15-45份，黄芩5-18份，香菇10-38份，板蓝根10-30份，金银花10-20份，甘草10-35份的中药材组成，本发明的试验结果表明：复方姬松茸多糖提取物对沙门氏菌抑制效果较强，大肠杆菌次之，猪链球菌最弱，其MIC分别为0.075g/mL、0.075g/mL、0.3g/mL。本发明的药理实验证明：复方姬松茸多糖口服液对脏器无明显病变。复方姬松茸多糖口服液能够增强鸡的免疫功能，其最佳给药剂量为0.28g/Kg-2.8g/Kg。特别是第2周低剂量组与对照组比较有显著差异，说明复方姬松茸多糖口服液在一定剂量范围内，具有促进鸡生长的作用。

Description

复方姬松茸多糖口服液及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，特别是涉及复方姬松茸多糖口服液及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着我国经济迅猛发展，人民的生活水平不断提高，对肉、蛋、奶的需求量不断上升，我国的畜牧养殖业也在紧随发展扩大。但是，很多问题也随之而来。首先，畜禽疾病种类增多，混合感染增多，微生物的突变株不断增多，对畜禽的危害日益严重。其次，随着抗生素的广泛使用，畜禽中耐药菌株不断出现，并且有药物残留，对人的身体健康有严重危害。再次，病毒毒力增强和病原抗原表型不断发生变化，造成了畜禽免疫接种失败，无法起到免疫保护作用我国基层兽医工作者专业知识缺乏，畜禽防疫技术和设备相对落后。这些因素导致我国畜牧养殖业发展缓慢。

我国畜禽疾病防治原则为：预防为主，防治结合。目前，我国疫苗研究成果丰富，很多养殖场长发疾病已经有了特异性疫苗，从而很大程度上减少了疾病的发生。对于畜禽疾病的治疗，我国养殖场使用的药物西药居多，其中尤以抗生素使用做广泛。抗生素对畜禽细菌性疾病治疗有显著作用，并且能改善肠道菌群，增加肠道吸收面积，降低某些营养成分的需求量等。但是，抗生素带来的副作用却不容忽视。由于抗生素的长期和大量使用，造成机体微环境发生变化。细菌为适应新环境，自身结构发生变化，从而对抗生素产生耐药性。这种耐药菌可能会向人传播，对人的身体健康造成严重威胁。抗生素在动物机体内的一部分代谢物会储存在组织或细胞内，动物加工成食物被人食用后，会对人的身体健康造成危害，主要表现在：对人体产生毒性作用；使人体发生过敏反应；造成三致，致癌、致畸、致突变。动物机体过度使用抗生素，会造成机体肠道菌群紊乱，导致肠道疾病，影响营养物质的吸收，制约动物的健康生长。

中草药是我国传统中医理论与实践的产物，具有显著的治病效果。现代大量研究表明，中草药不仅能调节机体生理生化功能，促进机体生长发育，而且具有不容易产生耐药性、无药物残留、无毒性、抗病毒、抑菌消炎、抗氧化、抗过敏、提高机体免疫力等作用。其主要有效作用成分有多糖类、生物碱类、黄酮类、皂苷类、有机酸类等，这些成分能够增强体质和机体抗病能力，降低饲料配给。中草药在畜禽养殖中应用与抗生素相比，有很大优势。抗生素和化学合成的抗病原微生物药物都有使微生物产生耐药性的弊端。而中草药是通过扶正祛邪，恢复机体阴阳平衡。中草药通过破坏病原微生物细胞壁或细胞膜系统、抑制功能蛋白的合成、阻碍遗传物质合成等杀灭病原微生物。以组方配伍原则和配伍禁忌为指导，利用中药间相使、相恶、相杀等相互作用，达到治疗疾病的目的。中草药是经过人类筛选的天然有机物质，保持了其自身结构、自然状态和生物活性。在用于治疗疾病之前，会采用各种炮制方法，去除对机体的有害因子，保持药效性，在临床应用上减少或避免了毒副作用，不会在畜禽机体内形成有害残留，达到扶正祛邪，健康食用的功能。

发明内容

一种复方姬松茸多糖口服液，其特征在于它是由下述重量份数的中药材组成：

姬松茸 1-20 黄芪 1-50

黄芩 2-20 香菇 1-50

板蓝根 5-30 金银花 2-25

甘草 1-40

本发明一个优选的中药材组成：

姬松茸 1-15 黄芪 1-45

黄芩 2-18 香菇 1-38

板蓝根 5-30 金银花 2-20

甘草 1-35

本发明另一个优选的中药材组成：

姬松茸 5-15 黄芪 15-45

黄芩 5-18 香菇 10-38

板蓝根 10-30 金银花 10-20

甘草 10-35

本发明更进一步公开了复方姬松茸多糖口服液的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）姬松茸多糖的提取

称取姬松茸蘑菇10kg，粉碎粒度为40目，粉碎后1斤留样，9.5kg干粉用做提取多糖。料水比为1：20，即7斤姬松茸干粉比70kg水，浸提温度为100℃，浸提时间为3h；2500r/min离心10min，减压浓缩；95%乙醇醇沉浓缩液，醇沉比为1:3，醇沉时间为24h；多糖沉淀进行干燥。

（2）黄芪多糖的提取

称取黄芪50g, 粉碎粒度为40目，干粉加入8倍量水浸泡12h,回流提取2h,滤出溶液,药材再加入5倍量的水回流提取2h,弃去滤渣合并滤液,浓缩得到浓缩液50mL；浓缩液进行超速离心,分离过滤的滤液并进行75%乙醇醇沉，室温静置12h；沉淀干燥。

（3）香菇多糖的提取

称取香菇50g，粉碎粒度为40目，干香菇粉按1:25料液比，于95℃水浴浸提3h，提取两次；抽滤,上清液加入3倍95%乙醇，醇析；离心醇析液，将所得沉淀于50℃鼓风干燥箱中干燥。

（4）复方姬松茸多糖提取物：

按处方量将黄芩、板蓝根、甘草加水煎煮1.5h，过滤，滤液另器收集；金银花与上述药渣加水煎煮二次，每次0.5h，合并煎液，静置过滤；滤液减压浓缩至约800mL，浓缩液加入姬松茸粗多糖1g，香菇粗多糖2g，黄芪粗多糖2g，加入蒸馏液至1000ml，灌装，高压灭菌即得。

本发明更进一步公开了复方姬松茸多糖口服液在制备提高家禽、家畜机体免疫药物中的应用。特别是在促进家禽、家畜生长的方面的应用。其中的家禽指的是：鸡、鸭、鹅；家畜指的是：马、牛、羊、驴、骡、猪、狗。优选在促进鸡生长方面的应用。实验结果：表明复方姬松茸多糖口服液对鸡的新陈代谢与生理活动无毒害作用，有增加免疫功能，促进鸡生长的作用。

本发明选择的姬松茸是产于南美巴西的一类药用和食用真菌，其口感好，味道鲜美。姬松茸水提物多糖具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、提高机体免疫力等功效。姬松茸多糖与1,6-二磷酸果糖结合对小鼠体内乳酸脱氢酶有显著增强作用，能够提高机体抗疲劳能力。

黄芪多糖是从草药黄芪中提取的水溶性杂多糖，具有抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力等功效。黄芪多糖能够增加特异性乙型肝炎病毒抗体和T细胞增殖活性，同时，可以刺激树突状细胞的成熟，是乙型肝炎病毒DNA疫苗潜在佐剂。黄芪多糖能够显著抑制BALB/c小鼠体内H22肝癌的固体肿瘤增长，脾脏、胸腺指数和巨噬细胞吞噬能力也显著提高，同时，能够促进血清中IL-2、IL-12、TNF-α的分泌，从而抑制肿瘤的恶化。黄芪多糖在体内抑制CD4⁺C和D25⁺T细胞增殖与其浓度和时间呈梯度关系，黄芪多糖可能通过恢复细胞因子平衡和人肝癌微环境中FOXp3的表达。

香菇是担子菌纲香菇菌属香菇菌，为药用兼食用菌。古籍中对香菇已有记载：益气不饥、治风破血和益胃助食。现代医学证明，香菇多糖在提高机体免疫力和抗癌方面有显著功效。香菇多糖与S-1联合使用能够显著诱导人口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡，降低TS和DPDmRNA的表达，升高OPRTmRNA的表达，具有明显抑癌效果。

金银花为植物忍冬的花蕾部分，其味甘性寒，中医上用于清热解毒，疏风散热。现代医学则用于抑菌消炎、抗过敏、调节糖代谢等。金银花花蕾及其醇提物有抗过敏特性。

传统中药板蓝根属十字花科植物菘蓝的根，最早记载于《神农本草经》中，具有清热解毒，凉血利咽的作用。现代医学表明，板蓝根的活性成分甾醇类物质、生物碱和多糖，具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗内毒素、抗氧化等作用。

甘草又名甜草，为豆科植物、光果和胀果甘草的根茎。其最早记载于《神农本草经》中性味甘平，归心、肺、脾经，具有清热解毒、止咳祛痰、补脾益气等作用。现代医学研究表明，甘草的活性成分主要为黄酮类和皂苷类化合物，具有抗病毒、抗炎、抑菌、降血糖等作用。

黄芩，又名山茶根，唇形科黄芩属，其味苦性寒，具有清热燥湿、止血、泻火解毒的作用。现代医学表明，黄芩具有抗癌、抑菌、抗氧化、抗溶血等作用。黄芩醇提取物能够抑制金黄色葡萄球菌生长，其MIC＞2048μg/mL，并且能够抑制金黄色葡萄球菌培养物上的αHL溶血活性，呈浓度依赖关系，但不能抑制αHL的表达。其还具有对金黄色葡萄球菌诱导的A549细胞损伤的缓解作用。

本发明考察了复方姬松茸多糖口服液的用量范围对疗效的影响（单位份数）：

试验的疗效情况如下：

试验编号	沙门氏菌	大肠杆菌	猪链球菌
				试验	0.075g/mL	0.075g/mL	0.3g/mL

结论：

（1）组成相同选择不同的用量对疗效有一定的影响

（2）最后选的的配方组成为:

姬松茸 1-15 黄芪 1-45

黄芩 2-18 香菇 1-38

板蓝根 5-30 金银花 2-20

甘草 1-35。

本发明更加详细的描述如下：

第一部分：

复方姬松茸多糖口服液的制作工艺与加速稳定性试验研究

1 材料与仪器

1.1 试验材料

姬松茸、黄芪、香菇、板蓝根、金银花、黄芩、甘草

98%浓硫酸(天津市盛淼精细化工有限公司)、蒽酮试剂(上海申翔化学试剂有限公司)、葡萄糖(AR)(中国食品药品检定研究院)。

1.2 试验仪器

巨峰高速粉碎机，天津市中药机械厂制造；DZFZ9 全自动电热蒸汽发生器，上海佳田制造有限公司；LD4-40北京医用离心机；减压浓缩仪，骏泰轻工；RE-52AA旋转蒸发仪，上海雅荣生化设备仪器有限公司；DHG-9143鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司。

分光光度计(T6新世纪)；DHG-9143鼓风干燥箱；Sartorius PB-10P^H计；XMT-DA恒温水浴箱。

2 试验方法

2.1 多糖的提取

2.1.1 姬松茸多糖的提取

称取姬松茸蘑菇10kg，粉碎粒度为40目，粉碎后0.5kg留样，9.5kg干粉用做提取多糖。料水比为1：20，即3.5kg姬松茸干粉比70kg水，浸提温度为100℃，浸提时间为3h；2500r/min离心10min，减压浓缩；95%乙醇醇沉浓缩液，醇沉比为1:3，醇沉时间为24h；多糖沉淀进行干燥。

2.1.2 黄芪多糖的提取

2.1.3 香菇多糖的提取

2.2 复方姬松茸多糖口服液的制作工艺

黄芩、板蓝根、甘草加水煎煮1.5h，过滤，滤液另器收集；金银花与上述药渣加水煎煮二次，每次0.5h，合并煎液，静置过滤；滤液减压浓缩至约800mL，浓缩液加入姬松茸粗多糖1g，香菇粗多糖2g，黄芪粗多糖2g，加入蒸馏液至1000ml，灌装，高压灭菌即得。

2.3 葡萄糖标准溶液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL。量取20mL并定容至100mL，得到浓度为0.2mg/mL的葡萄糖标准溶液。

2.4 蒽酮试剂的配制

精密称取蒽酮0.2g，加入80%浓硫酸100mL，完全溶解后，置于棕色瓶内，现用现配。

2.5 标准曲线的绘制

依次量取葡萄糖标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2mL置于10mL干燥试管中，分别加蒸馏水至2mL，沿管壁加入4mL现配的蒽酮试剂，100℃水浴反应10min，冷却至室温后，静置20min，以蒽酮试剂为空白对照，于620nm处测吸光度，以吸光度Y为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线(郭晓蕾等，2010)。

2.6 糖含量的测定

用移液管吸取2mL口服液于10mL干燥试管中，沿管壁加入4mL现配的蒽酮试剂，100℃水浴反应10min，冷却至室温后，静置20min，以蒽酮试剂为空白对照，于620nm处测吸光度(张红等，2012)。

2.7 加速试验

取20130315、20130316、20130317三种不同批次的口服液，模拟上市包装，置于40℃±2℃，75%±5%RH条件下放置6个月，在试验期间的第1、2、3、6月末取样测试复方姬松茸多糖口服液的性状、均匀度、PH、多糖含量。

3 试验结果

3.1 多糖提取率与复方姬松茸多糖口服液的物理特性

姬松茸粗多糖提取率为14.95%；黄芪粗多糖提取率为6.16%；香菇粗多糖的提取率为10.66%；所得复方姬松茸多糖口服液为棕褐色液体、溶液均一、具有芳香气味。

3.2标准曲线的绘制及回归方程的建立

绘制标准曲线，通过数据的线性回归分析，得到多糖浓度—吸光度的回归方程：y=0.0476x+0.0001，相关系数R²=0.9971，说明方程线性良好。

3.3加速试验对PH值变化

试验中，对复方姬松茸多糖口服液0、1、2、3、6个月的PH值进行了测定，结果分别为 4.21±0.25、4.25±0.17、4.22±0.21、4.20±0.40、4.12±0.67。经方差分析，第6个月与0个月比较，PH值具有显著差异(P＜0.05)。

3.4 加速试验对多糖含量变化

试验中，对复方姬松茸多糖口服液0、1、2、3、6个月的多糖含量进行了测定，结果分别为15.12.00±0.00、20.72±9.70、20.72±9.70、20.72±9.70、34.72±4.84。经方差分析，第6个月与0个月比较，多糖含量具有显著差异(P＞0.05)。

3.5 性状和均匀度变化

在6个月的加速试验中，复方姬松茸多糖口服液均为棕褐色液体，均匀度均一。

4 讨论

稳定性试验是中药新药研究的重要部分，是考察药剂在温度、湿度等因素下随时间变化的规律，其中加速试验是在40℃±2℃，75%±5%RH条件下评价药剂质量的重要稳定性试验之一。加速试验可以在较短时间内，为新药剂的质量评价，贮存条件等提供试验依据。

试验对复方姬松茸多糖口服液进行了6个月的加速研究，得出其性状，均一度均未发生明显变化，而第6个月PH值和多糖含量与0月比较，有显著差异性(P＜0.05)。其中第6个月PH值降低，但未超过规定范围(许真之等，1996)；多糖含量差异不显著。

试验研究表明，复方姬松茸多糖口服液在6个月加速贮藏试验过程中稳定性良好。

第二部分：

复方姬松茸多糖口服液（口服液为代表）的非临床安全性评价

1 慢性毒性试验结果

1. 1大鼠的临床症状

试验期间，高、中、低剂量组和对照组大鼠精神状况、行为活动良好，毛发光滑，无松毛弓背腹泻现象，摄食和饮水均正常。

1.2复方姬松茸多糖口服液对大鼠体重的影响

灌胃9周，复方姬松茸多糖口服液高、中、低剂量组的大鼠体重，与对照组比较，无显著差异（表1）。

表1各试验组与对照组体重测定结果(n=20)

注:同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。

1.3复方姬松茸多糖口服液对大鼠脏器指数的影响

从脏器指数结果得出，高剂量组中，脏器指数均增高，其中心脏、肝脏、肾脏与对照组比较，具有显著差异性；中剂量组中，脏器指数均增高，其中心脏、肝脏与对照组比较，具有显著差异性(P＜0.05)；低剂量组中，肺脏脏器指数降低，其他都增高，与对照组比较，均无显著差异性(P＞0.05)（表2）。

表2各试验组与对照组脏器指数测定结果(n=20)

1.4复方姬松茸多糖口服液对大鼠血常规的影响

从血常规检查结果可以看出，高剂量组中，各血象指标升高，其中WBC、LYM、MID、GRA、PLT与对照组比较，具有显著差异性(P＜0.05)；中剂量组中，RBC、HGB指标降低，其余都升高，其中WBC、GRA、PLT与对照组比较，具有显著差异性(P＜0.05)；低剂量组中，LYM指标降低，其余都升高，与对照组比较，均无显著差异性(P＞0.05)(表3)。

表3 各试验组与对照组血常规测定结果(n=20)

1.5复方姬松茸多糖口服液对大鼠血液生化指标的影响

给药9周后，高剂量组中，各生化指标均升高，其中Cre、TG与对照组比较，具有显著差异(P＜0.05)；中剂量组中，AST指标降低，其余均升高，其中TG指标与对照组比较，具有显著差异性(P＜0.05)；低剂量组中，各生化指标均升高，其中TG指标与对照组比较，具有显著差异性(P＜0.05)（表4）。

表4 各试验组与对照组生化指标测定结果(n=20)

1.6 复方姬松茸多糖口服液对大鼠的慢性毒性试验

慢性毒性试验是以小于阈剂量的化学物长期与实验动物接触，观察其对实验动物是否产生毒性的试验，是药物非临床型安全性评价的核心内容，是药物从药学研究进入临床试验的重要环节。试验中所用药物为中药复方，其遵循“君臣佐使”配伍，通过配伍组成的复方与单味药相比，有提高疗效，减少毒副作用，以主证为主，兼顾兼证的整体作用，具有不同程度抗炎作用等优越性。

试验对Wister大鼠进行为期60天的灌胃以及对各种试验指标进行了检测，结果表明，复方姬松茸多糖口服液对大鼠的精神状况、行为活动、毛发光泽、摄食和饮水无影响，说明复方姬松茸多糖口服液对大鼠的一般新陈代谢与生理活动无毒害作用。

体重可以直接反映动物机体的营养状况和间接反映机体的生理状况，是慢性毒试验的一个重要指标。试验中，3个剂量组的体重与对照组无明显差异，说明复方姬松茸多糖口服液对大鼠生长无抑制作用。

动物的脏器指数是药理和毒理学研究的一个重要试验观察指标。脏器指数的相对大小，从一定程度上可说明其功能的强弱。姬松茸多糖对肝脏脏有保护作用；黄芪多糖可使肝脏细胞排列紧密有序，枯否氏细胞核小叶间动静脉增多，有助于增强肝脏功能；黄芪多糖能够提高鲤鱼肾脏中IL-1β含量，促进免疫应答。试验中，高剂量组中的心脏、肝脏、肾脏和中剂量组中的心脏、肝脏指数增加，与对照组比较有显著差异性，说明复方姬松茸多糖口服液对增强脏器功能有促进作用。

血常规检测是通过观察数量变化及形态分布，判断疾病的。试验中，高剂量组中的WBC、LYM、MID、GLA、PLT和中剂量组的WBC、GRA、PLT增高，与对照组比较有显著差异性，但均在正常值范围内或接近正常值，这可能是由于姬松茸多糖提高了机体免疫，刺激淋巴细胞、单核细胞等的增殖。

肝脏和肾脏分别是异源物质在机体进行转化和代谢的主要场所。血浆ALT、AST等酶类活性能反映肝脏细胞受损情况及严重程。肌酐和尿素氮是反映肾脏小球滤过功能损伤的重要指标。试验中，3个剂量组的AST、ALT均升高，但与对照组比较无明显差异性，说明肝脏未受到明显损害。病理学检查中，3个剂量组与对照组比较，未见明显差异，说明复方姬松茸多糖口服液对脏器无明显病变。综上所述，复方姬松茸多糖口服液毒性低，安全范围大，具有开发潜力。

第三部分：

复方姬松茸多糖口服液对家禽（典型的以为鸡为代表）免疫功能影响的研究

1材料与仪器

1.1 试验材料

复方姬松茸多糖口服液，由天津农学院兽医学实验室制备。主要成分有姬松茸多糖、黄芪多糖和金银花等。

1日龄海兰褐蛋公鸡80只，购于山东益生种畜禽股份有限公司。

鸡新城疫疫、传染性支气管炎二联活疫苗(批号:201223，LaSota株+H120株)、禽流感H5亚型二价灭活疫苗(批号:2012090，Re-6株+Re-4株)、鸡新城疫灭活疫苗(批号:2013001，LaSota株)，均购于辽宁益康生物股份有限公司；新城疫抗原(批号:201303，中国兽医药品监察所)、禽流感H5亚型抗原(批号:2012001，哈尔滨维科生物技术开发公司)；新城疫、H5亚型禽流感阳性血清由天津中升集团提供；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(批号:201403)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(批号:201402)、尿素(Urea)试剂盒(批号:201304)、肌酐(Crea)试剂盒(批号:201303），均购于中生北控生物科技股份有限公司；瑞氏染液(批号:412111)，购于珠海贝索生物技术有限公司。

1.2 试验仪器

5810R Eppendorf Centrifuge；Microlab 300半自动生化分析仪；Motic数码显微镜(BA-200)；DHG-9143鼓风干燥箱,上海福玛实验设备有限公司；MP-250B微电脑生化培养箱；W-CJ-ID超净工作台；BCD-215KAZ冰箱；A2003电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LEICA TP1020脱水机；LEICA EG1150H包埋机；Leica RM2235切片机；96孔“V”型微量反应板。

2 试验方法

2.1分组及给药

80只1日龄非免疫蛋公鸡，随机分为3个试验组和1个对照组。5日龄开始按高剂量3mL/只.d、中剂量2mL/只.d和低剂量1mL/只.d，连续给药10d，期间按常规程序进行新城疫、H5亚型禽流感疫苗的免疫。

2.2鸡临床症状检查

观察用药组与对照组公鸡在给药结束后30d试验期内体重变化、临床症状、死亡情况；每天观察，每周称体重1次，并做记录。

2.3 抗体效价的测定

给药结束首日起，第10d、20d、30d翅静脉采血，1mL/羽，凝集后离心，分离血清，与-20℃冻存备用。从健康公鸡翅静脉采血，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，2000r/min离心10min，弃上清，去白细胞层；加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，最后一次离心5min。最后根据所需用量，使用灭菌生理盐水配置1%鸡红细胞悬液。采用血凝抑制试验方法，对血清样品进行ND-HI与AI-HI的测定

2.4 脏器指数的测定

45日龄时，扑杀全部试验公鸡，进行全面细致的系统尸检。取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊称重，计算脏器指数(脏器系数=脏器质量/动物体重×100%)。

2.5 血液生化学检查

试验结束前，各组动物禁食12h，自由饮水。次日，翅静脉采血，以3500r/min离心分离血清，测定血液生化指标。

2.6 白细胞检查

试验结束前，各组动物禁食12h，自由饮水。次日，翅静脉采血于加有肝素钠抗凝剂的离心管中。将一小滴血均匀涂在洁净、中性、无油脂的载玻片上，呈单层紧密分布，制成血膜片，用瑞氏染液进行染色，镜检血细胞形态并对其计数。

2.7 肠绒毛长度及周长的测定

取各组公鸡距胃端2cm的小段十二指肠，以10%福尔马林溶液进行固定，常规石蜡包埋，HE染色，Motic数码显微镜测绒毛长度及周长。

2.8 病理学检查

取各组公鸡的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊，以10%福尔马林溶液进行固定，常规石蜡包埋，HE染色，镜检，照相。

2.9 统计学分析

数据以±SD表示，采用SPSS11.0进行分析。

3 试验结果

3.1鸡的临床症状

试验期间，高、中、低和对照组鸡精神状况、行为活动良好，羽毛光亮，摄食、饮水和粪便均正常。

3.2 复方姬松茸多糖口服液对鸡体重的影响

试验期间，第2周低剂量组鸡的体重与对照组比较，有显著差异性(P＜0.05)，其余无显著差异(表5)。

表5试验组与对照组体重测定结果(n=20)

组别	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					0周	56.99±3.75^a	55.73±2.79^a	55.43±3.10^a	55.43±5.20^a
1周	194.98±14.49^a	199.61±15.63^a	198.89±11.20^a	195.56±15.79^a
					2周	277.91±19.20^b	293.18±26.30^a	289.25±19.25^ab	290.49±19.82^ab
3周	384.76±30.29^a	388.73±33.17^a	373.72±29.21^a	392.23±33.83^a
					4周	464.97±51.98^a	478.28±49.76^a	466.57±51.60^a	478.88±52.51^a

3.3 复方姬松茸多糖口服液对ND和AI抗体效价的影响

从ND抗体效价结果可知， 10d、30d试验组与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)；20d试验组与对照组比较，有极显著差异(P＜0.01)。从AI抗体效价结果可知，20d中剂量组与对照组比较，有显著差异(P＜0.05)；30d各试验组与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)。

3.4复方姬松茸多糖口服液对鸡脏器指数的影响

由脏器指数结果可知，心脏、肝脏、胸腺、法氏囊各试验组和肝脏、脾脏的高、中剂量组与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)；肝脏低剂量组与对照组比较，有极显著差异(P＜0.01)，脾脏低剂量组与对照组比较，有显著差异(P＜0.05)(表6)。

表6试验组与对照组脏器指数测定结果(n=20)

组别	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					心脏	0.81±0.13^a	0.76±0.12^a	0.77±0.16^a	0.76±0.14^a
肝脏	2.28±0.20^Bb	2.71±0.41^Aa	2.33±0.29^b	2.21±0.20^b
					脾脏	0.21±0.04^b	0.25±0.09^a	0.25±0.05^ab	0.22±0.08^ab
肾脏	0.13±0.03^a	0.14±0.04^a	0.15±0.04^a	0.15±0.02^a
					胸腺	0.23±0.06^a	0.22±0.10^a	0.27±0.10^a	0.23±0.09^a
法氏囊	0.24±0.18^a	0.20±0.12^a	0.16±0.11^a	0.21±0.13^a

3.5 复方姬松茸多糖口服液对鸡血液生化指标的影响

45日龄时，高剂量组中，各生化指标与对照组比较，有显著差异(P＜0.05)；中剂量组中，AST、Crea与对照组比较，有显著差异(P＜0.05)，ALT、Urea与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)；低剂量组中，各生化指标与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)(表7)。

表7试验组与对照组血液生化指标结果(n=20)

3.6 复方姬松茸多糖口服液对鸡白细胞百分率的影响

45日龄时，嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞试验组和单核细胞高、中剂量组与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)；单核细胞低剂量组与对照组比较，有显著差异(P＜0.05)(表8)

表8试验组与对照组白细胞计数结果(%)(n=20)

组别	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					嗜酸性粒细胞	0.020±0.015^a	0.022±0.013^a	0.037±0.023^a	0.024±0.017^a
嗜中性粒细胞	0.368±0.180^a	0.470±0.148^a	0.504±0.173^a	0.468±0.245^a
					淋巴细胞	0.509±0.203^a	0.510±0.126^a	0.501±0.134^a	0.601±0.128^a
单核细胞	0.282±0.154^ab	0.047±0.022^a	0.256±0.213^b	0.418±0.214^ab

3.7复方姬松茸多糖口服液对鸡十二指肠绒毛长度及周长的影响

由鸡十二指肠绒毛长度及周长测定结果可知，各试验组肠绒毛长度及周长与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)(表9)。

表9试验组与对照组十二指肠绒毛长度及周长测定结果(n=20)

组别	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					长度(mm)	1.10±0.21^a	1.18±0.29^a	1.10±0.31^a	1.13±0.22^a
周长(mm)	2.43±0.46^a	2.68±0.65^a	2.47±0.59^a	2.66±0.54^a

3.8 病理学检查

取试验组和对照组所有鸡的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊，眼观脏器无明显病理变化。以10%福尔马林溶液将其固定，进行病理组织学检查，结果表明：3个剂量组与对照组比较，无明显病理变化。

4 讨论

试验对蛋公鸡进行30d的观察以及对各种试验指标进行了检测。结果表明，复方姬松茸多糖口服液对蛋公鸡的精神状况、行为活动、羽毛光泽、摄食和饮水无影响，说明复方姬松茸多糖口服液对蛋公鸡的新陈代谢与生理活动无毒害作用。

体重可直接反映机体的生长性能、营养状况和间接反映机体的生理状况。试验中，第2周低剂量组与对照组比较有显著差异，说明复方姬松茸多糖口服液在一定剂量范围内，具有促进鸡生长的作用。

研究发现，多糖能够增强机体免疫力，提高疫苗抗体滴度。例如，Wang M等(2013)研究表明，蛹虫草多糖能够显著刺激淋巴细胞增殖，增强ND疫苗血清抗体滴度，提高血清IFN-γ和IL-4浓度；黄芪多糖在一定剂量范围内能够显著增强FMDV特异抗体滴度。而抗体效价能够直接反映雏鸡对疫苗的免疫应答状态和机体抵抗病原体感染的特异性体液免疫的能力。试验中，蛋公鸡免疫ND疫苗20d时，试验组与对照组抗体水平达到峰值且低剂量组抗体效价最高，与对照组比较，有显著差异。由表2可知，复方姬松茸多糖口服液剂量与抗体水平呈负相关，说明复方姬松茸多糖口服液增强ND疫苗免疫效果的最佳剂量为1mL/只。蛋公鸡免疫AI疫苗20d时，中剂量组抗体效价与对照组比较，有显著差异。30d时，试验组与对照组抗体水平达到峰值。说明复方姬松茸多糖口服液增强AI疫苗免疫效果的最佳剂量为2mL/只。

脏器指数的相对大小，从一定程度上可说明其功能的强弱(魏炳栋等，2011)。其中免疫器官的质量与免疫功能密切相关，指数增加表示机体的免疫机能增强。脾脏是禽类最大的外周免疫器官，参与全身的细胞免疫与体液免疫；肝脏是机体重要的消化和解毒器官(颜新艳等，2010)。试验中，肝、脾指数低剂量组与对照组比较，有显著差异，说明复方姬松茸多糖口服液可以促进免疫、消化器官，增强机体免疫功能。

肝脏和肾脏分别是异源物质在机体进行转化和代谢的主要场所。血浆ALT、AST等酶类活性能反映肝脏细胞受损情况及严重程度(王晶等，2013)。肌酐和尿素氮是反映肾脏小球滤过功能损伤的重要指标(罗爱琼等，2013)。试验中，高剂量组各生化指标、中剂量组AST、Crea与对照组比较，有显著差异，说明高、中剂量的复方姬松茸多糖口服液对鸡的肝、肾功能造成了损伤

白细胞是机体的免疫细胞，其形态和数量变化是反映机体免疫功能的重要指标。复方姬松茸多糖口服液是由姬松茸、黄芪多糖和多种植物成分组成，它们能够促进单核细胞增殖，增强白细胞的吞噬能力(孙惠玲等，2005)。例如，Liao HF等(2010)研究表明，中药配方CUC能够提高单核细胞百分比，并能够激活Raw264.7巨噬细胞。试验中，单核细胞低剂量组与对照组比较，有显著差异，说明低剂量组的复方姬松茸多糖口服液能够明显促进机体的非特异性免疫。

肠绒毛高度的增加能够使小肠吸收营养物质的面积增大，因此其长度直接影响鸡的生长发育。试验中，试验组肠绒毛长度及周长与对照组比较，无显著差异。但从数值上看，3个试验组都大于对照组且低剂量组的肠绒毛长度及周长最高，说明复方姬松茸多糖口服液在一定程度上，能够促进肠绒毛的生长。

病理学检查中，3个试验组与对照组比较，无明显病变，说明复方姬松茸多糖口服液对脏器无明显病变。

结果表明，复方姬松茸多糖口服液能够增强鸡的免疫功能，其最佳给药剂量为0.28g/Kg-2.8g/Kg。

本发明公开的复方姬松茸多糖口服液所具有的积极效果在于：

复方姬松茸多糖口服液生产工艺简单，易被采用，试验通过对复方姬松茸多糖口服液进行的稳定性、安全性和药理药效学研究，展示了新复方中药显著的药用价值，而且新复方中药价格低廉，经计算为22.61元/L，市场潜力巨大。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为本发明的范围内，本发明的范围和实质都有权利要求来限定；其中所述中草药材、所用到的试剂均由市售。

实施例1

复方姬松茸多糖提取物的制备

（1）姬松茸多糖的提取

称取姬松茸蘑菇20斤，粉碎粒度为40目，粉碎后1斤留样，19斤干粉用做提取多糖。料水比为1：20，即7斤姬松茸干粉比140斤水，浸提温度为100℃，浸提时间为3h；2500r/min离心10分钟，减压浓缩；95%乙醇醇沉浓缩液，醇沉比为1:3，醇沉时间为24小时；多糖沉淀进行干燥。

（2）黄芪多糖的提取

（3）香菇多糖的提取

（4）复方姬松茸多糖口服液的制作工艺

配方	黄芩	板蓝根	金银花	甘草
					（1）	10	15	8	20
（2）	8	20	10	15
					（3）	15	8	15	8
（4）	10	10	20	10
					（5）	4	15	10	15

与上述药渣加水煎煮二次，每次0.5h，合并煎液，静置过滤；滤液减压浓缩至约800mL，浓缩液加入姬松茸粗多糖1g，香菇粗多糖2g，黄芪粗多糖2g，混合均匀，既得到复方姬松茸多糖提取物；

（5）将复方姬松茸多糖提取物药学上可接受的药用载体混合制成口服制剂为或注射剂。

实施例2

（1）姬松茸多糖的提取

称取姬松茸蘑菇10kg，粉碎粒度为40目，粉碎后0.5kg留样，9.5kg干粉用做提取多糖。料水比为1：20，即3.5姬松茸干粉比70kg水，浸提温度为100℃，浸提时间为3h；2500r/min离心10min，减压浓缩；95%乙醇醇沉浓缩液，醇沉比为1:3，醇沉时间为24h；多糖沉淀进行干燥。

（2）黄芪多糖的提取

（3）香菇多糖的提取

（4）黄芩、板蓝根、甘草加水煎煮1.5h，过滤，滤液另器收集；金银花与上述药渣加水煎煮二次，每次0.5h，合并煎液，静置过滤；滤液减压浓缩至约800mL，浓缩液加入姬松茸粗多糖1g，香菇粗多糖2g，黄芪粗多糖2g，加入蒸馏液至1000ml，灌装，高压灭菌即得。

实施例3

取复方姬松茸多糖20g，加入0.32L的无菌去离子水稀释，（即20g多糖粉末制成约320ml），冷藏24小时，离心去沉淀，最终清液加入木糖醇5g，冷藏过滤，获得澄明滤液，向清液中，再加入无菌去离子水至400mL,装入无菌瓶中制成口服液，装量每支10 ml。

实施例4

取复方姬松茸多糖30g，加入0.38L的无菌去离子水稀释，（即20g多糖粉末制成约380ml），冷藏24小时，离心去沉淀，最终清液加入木糖醇7.5g，冷藏过滤，获得澄明滤液，向清液中，再加入无菌去离子水至400mL,装入无菌瓶中制成口服液，装量每瓶100ml。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims

1.一种复方姬松茸多糖口服液，其特征在于它是由下述重量份数的中药材组成：

姬松茸 1-20 黄芪 1-50

黄芩 2-20 香菇 1-50

板蓝根 5-30 金银花 2-25

甘草 1-40。

2. 权利要求1所述的复方姬松茸多糖口服液，其特征在于它是由下述重量份数的中药材组成：

姬松茸 1-15 黄芪 1-45

黄芩 2-18 香菇 1-38

板蓝根 5-30 金银花 2-20

甘草 1-35。

3. 权利要求1所述的复方姬松茸多糖口服液，其特征在于它是由下述重量份数的中药材组成：

姬松茸 5-15 黄芪 15-45

黄芩 5-18 香菇 10-38

板蓝根 10-30 金银花 10-20

甘草 10-35。

4. 权利要求1-3任一项所述复方姬松茸多糖口服液的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）姬松茸多糖的提取

称取姬松茸蘑菇10kg，粉碎粒度为40目，粉碎后1斤留样，9.5kg干粉用做提取多糖，料水比为1：20，即3.5kg姬松茸干粉比70kg水，浸提温度为100℃，浸提时间为3h；2500r/min离心10分钟，减压浓缩；95%乙醇醇沉浓缩液，醇沉比为1:3，醇沉时间为24小时；多糖沉淀进行干燥；

（2）黄芪多糖的提取

称取黄芪50g, 粉碎粒度为40目，干粉加入8倍量水浸泡12h,回流提取2h,滤出溶液,药材再加入5倍量的水回流提取2h,弃去滤渣合并滤液,浓缩得到浓缩液50mL；浓缩液进行超速离心,分离过滤的滤液并进行75%乙醇醇沉，室温静置12h；沉淀干燥；

（3）香菇多糖的提取

称取香菇50g，粉碎粒度为40目，干香菇粉按1:25料液比，于95℃水浴浸提3h，提取两次；抽滤,上清液加入3倍95%乙醇，醇析；离心醇析液，将所得沉淀于50℃鼓风干燥箱中干燥；

（4）复方姬松茸多糖提取物：

5.权利要求1-3任一项所述复方姬松茸多糖口服液在制备提高家禽、家畜机体免疫药物中的应用。

6.权利要求1-3任一项所述复方姬松茸多糖口服液在制备促进家禽、家畜生长的方面的应用。

7.权利要求8-9任一项所述的应用，其中的家禽指的是：鸡、鸭、鹅；家畜指的是：马、牛、羊、驴、骡、猪、狗。