CN101884788B

CN101884788B - 中药芪藿糖免疫增强剂

Info

Publication number: CN101884788B
Application number: CN2010102119996A
Authority: CN
Inventors: 胡元亮; 王德云; 郭利伟; 刘家国; 张宝康
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-06-28
Also published as: CN101884788A

Abstract

本发明涉及一种由黄芪提取物和硫酸化淫羊藿多糖制成的中药免疫增强剂，简称为芪藿糖增免剂，属于畜禽免疫佐剂领域。每1000ml药液由黄芪40g、淫羊藿120g制成。黄芪水煎3次，合并滤液，浓缩成500ml；淫羊藿水煎醇沉法提取淫羊藿多糖，用氯磺酸-吡啶法修饰，蒸馏水透析后制成500ml硫酸化淫羊藿多糖溶液；将两种溶液混合，滤过，分装，灭菌，获得。通过免疫试验证明，芪藿糖增免剂能显著促进鸡外周血淋巴细胞增殖，增强细胞免疫；配合新城疫疫苗免疫雏鸡，能显著提高血清抗体效价，促进淋巴细胞增殖，增强细胞免疫和体液免疫，提高疫苗的免疫应答。

Description

中药芪藿糖免疫增强剂

一、技术领域

本发明一种由黄芪提取物和硫酸化淫羊藿多糖制成的中药免疫增强剂，简称为芪藿糖增免剂，属于畜禽免疫佐剂领域。

二、背景技术

畜禽传染病一直是危害畜牧业发展的首要问题，尤其是当前流行的重大病毒性传染病，迄今尚无有效的治疗方法，疫苗预防仍是最主要的措施。由于种种原因，多数疫苗只有与免疫增强剂或免疫佐剂配合应用才能发挥良好的防疫效果。但是，目前国内外广泛使用的油乳类、铝胶类等化学性免疫佐剂常有副作用大、局部刺激强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研制开发高效、安全的新型免疫增强剂成为亟待解决的问题。研究表明，许多中药具有免疫增强作用，具备高效、安全的优势。但是尚无名副其实的中药免疫增强剂产品问市，一些具有增强免疫作用的传统方剂多为大复方，传统剂型多为汤剂、散剂，给药不便。本发明通过多年的努力，从组分药筛选到方剂筛选和剂型筛选，结合成本和方便应用等方面综合比较，研制成功由黄芪提取物和硫酸化淫羊藿多糖制成的芪藿糖增免剂。

三、发明内容

技术问题本发明针对当前动物疫病防控现有技术中急需高效、安全的免疫增强剂或疫苗佐剂的问题，提供一种由黄芪提取物和硫酸化淫羊藿多糖制成的新型中药免疫增强剂。

技术方案本发明一种新型中药免疫增强剂，其特征在于，每1000ml药液由黄芪40g和淫羊藿120g制成。药液中的多糖含量不低于0.5％、黄芪甲甙含量不低于0.04％，硫酸基取代度不低于0.35。

生产每1000ml药液的工艺流程为：黄芪加水煎煮3次，合并滤液，85℃减压浓缩至500ml。淫羊藿加水煎煮2次，合并滤液，85℃减压浓缩至120ml，加入95％乙醇使醇含量达70％，静置24h，沉淀60℃真空干燥，加入到1∶8的氯磺酸-吡啶中，80℃振荡反应2h，冰浴中迅速冷却，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入95％乙醇使醇含量达70％，静置24h，沉淀自来水透析48h、蒸馏水透析24h，浓缩至500ml，与黄芪溶液混匀，滤过，分装，灭菌，获得。黄芪提取物的提取工艺为黄芪加10倍质量水、煮沸60min提取，共提取3次；淫羊藿多糖的提取工艺为加淫羊藿20倍质量水、煎煮2次，第一次1.5小时、第二次1小时。

有益效果本发明的基础工作首先选择有增强免疫作用的中药成分，比较它们的增强免疫作用，筛选出作用较好的黄芪多糖、淫羊藿多糖。随后通过多糖修饰研究证明硫酸化修饰能进一步增强黄芪多糖和淫羊藿多糖的增强免疫活性，筛选出作用较好的硫酸化黄芪多糖和硫酸化淫羊藿多糖。以筛选出的两种多糖及其硫酸化多糖组成多个复方，证明复方的增强免疫活性强于单味药，筛选出硫酸化多糖复方的处方。

为简化工艺、节约成本和充分利用资源，以黄芪提取物(含同量黄芪多糖)替代方中的硫酸化黄芪多糖，并与其不同配比的方剂进行比较，证明其增强免疫效果进一步提高(表1)，确定了芪藿糖增免剂的组方。

通过正交试验确定了黄芪提取物和淫羊藿多糖的提取条件，优化了淫羊藿多糖的硫酸化修饰条件，确定了芪藿糖增免剂的生产工艺。

测定了芪藿糖增免剂的体外增强免疫作用，证明芪藿糖增免剂在体外能显著促进淋巴细胞增殖，从而增强细胞免疫(表2)。

比较了芪藿糖增免剂不同剂量对鸡新城疫苗免疫效果的免疫增强作用，证明合适的剂量能显著提高免疫雏鸡的血清抗体效价，促进淋巴细胞增殖，增强鸡的细胞免疫和体液免疫，提高新城疫苗的免疫应答；5mg为雏鸡的最佳剂量(表3～表4)。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.与化学佐剂相比，芪藿糖增免剂效果可靠，而且来源于天然中药，无毒副作用，无药残隐患，保障动物源食品安全；生产对环境无污染，符合绿色环保的要求。

2.与传统中药方剂相比，芪藿糖增免剂处方精练，成分明确，质量可控，剂型先进，给药方便。

3.与同类中药成分方剂相比，芪藿糖增免剂功效提高，单用或配合新城疫疫苗免疫雏鸡，能显著增强细胞免疫和体液免疫，提高疫苗的免疫应答。

四、具体实施方式

1.制备工艺

(1)黄芪提取物的制备以提取物中的黄芪多糖得率为指标，对加水量、提取时间、提取次数进行正交试验，确定黄芪提取物的最佳提取工艺为加10倍水、煮沸60min、提取3次。取黄芪饮片40g，按以上工艺水煎，合并滤液，85℃减压浓缩至500ml，得到黄芪提取物溶液。

(2)淫羊藿多糖的提取以淫羊藿多糖的得率为指标，对加水量、煮沸时间和提取次数进行正交试验，确定淫羊藿多糖的最佳提取工艺为加20倍水、煎煮2次，第一次1.5h、第二次1h。称取淫羊藿饮片120g，按以上工艺水煎，合并2次滤液，85℃减压浓缩至120ml，加入95％乙醇使醇含量达70％，静置24小时，沉淀60℃真空干燥，得到淫羊藿多糖。

(3)淫羊藿多糖的硫酸化修饰用氯磺酸-吡啶法。以产物的硫酸基取代度和糖质量分数为指标，对反应温度、试剂配比和反应时间进行正交试验，确定适宜的修饰条件为氯磺酸与吡啶的体积比1∶8、80℃反应2h。按上述条件对淫羊藿多糖进行硫酸化修饰，反应结束移冰浴中迅速冷却，加饱和氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加95％乙醇使醇含量达70％，静置24h，沉淀经自来水透析48h、蒸馏水流水透析24h，浓缩至500ml，得到硫酸化淫羊藿多糖溶液。

(4)药液制备将黄芪提取液和硫酸化淫羊藿多糖溶液混合，过滤，分装，灭菌。用苯酚-硫酸法测定多糖含量，TLC分光光度法测定黄芪甲甙含量，氯化钡-明胶法测定硫酸基取代度。药液中的多糖含量不低于0.5％、黄芪甲甙含量不低于0.04％，硫酸基取代度不低于0.35。

2.增强免疫效果比较

(1)体内增强免疫试验

方法：以芪藿糖增免剂为试验材料，另制备对照方1(黄芪多糖6份+硫酸化淫羊藿多糖4份)和对照方2(黄芪多糖4份+加硫酸化淫羊藿多糖6份)。取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡100羽，随机均分为5组，除空白组外均用新城疫IV苗滴鼻、点眼免疫，3羽份/羽，28日龄二免。在首次免疫的同时，3个中药组同时肌肉注射相应药物，0.5mL/羽，疫苗对照组和空白对照组注射等量生理盐水，分别于免疫后第7(D₇)、14(D₁₄)、21(D₂₁)和28(D₂₈)天每组随机抽取6羽翼下静脉采血，分离血清，用β-微量法检测ND-HI抗体效价。

结果：芪藿糖增免剂组的抗体效价除首次免疫后第7天(D₇)稍低于对照方1外，其余时间点的的抗体效价均最高，在首次免疫后第14天(D₁₄)显著高于其余各组(P＜0.05)，分别比对照方1、对照方2高2.0、1.67个滴度；在D₂₁显著高于除对照方1外的其余各组(P＜0.05)，分别比对照方1、对照方2高0.53、1.0个滴度；在D₂₈显著高于其余各组(P＜0.05)，分别比对照方1、对照方2高1.0、1.83个滴度(表1)。表明芪藿糖增免剂能显著提高血清抗体效价，效果优于两个对照方。

表1各组血清抗体效价的变化(Log₂)

注：同列数据标注不含相同字母者差异显著(P＜0.05)，以下表同。

(2)体外增强免疫试验

方法：将芪藿糖增免剂用细胞培养液(RPMI1640)自600μg·mL^-1倍比稀释至0.586μg·mL^-1共11个浓度，分别加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中，用MTT法测定其对淋巴细胞的最大安全浓度为18.75μg·mL^-1。再将芪藿糖增免剂用RPMI1640培养液自10μg·mL^-1倍比稀释至0.625μg·mL^-1共5个浓度，分别加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中，另一半并同时加入PHA(T淋巴细胞丝裂原)，用MTT法测定淋巴细胞增殖(A570值)的变化。

结果：芪藿糖增免剂在5.0～0.625μg·mL^-1组的A₅₇₀值均显著大于细胞对照组(P＜0.05)，表明芪藿糖增免剂单独能显著刺激淋巴细胞增殖，从而增强细胞免疫。芪藿糖增免剂+PHA在5.0～0.625μg·mL^-1组的A₅₇₀值大于PHA对照组，但差异不显著(P＜0.05)，表明说明芪藿糖增免剂在这些浓度有一定的协同PHA刺激T淋巴细胞增殖的作用(表2)。

表2芪藿糖增免剂刺激淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

3.芪藿糖增免剂最佳剂量的筛选

方法：将芪藿糖增免剂制成24、20、16、12、8、4、1mg/ml 7种浓度。取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡450羽，随机均分为9组，除空白组外均用新城疫IV苗滴鼻、点眼免疫，3羽份/羽，，28日龄二免。在首次免疫的同时，芪藿糖增免剂的7个剂量组分别同时肌肉注射相应浓度的药物0.5mL，即分别为每羽12、10、8、6、4、2、0.5mg，疫苗对照组和空白对照组注射等量生理盐水，分别于首次免疫后第7(D₇)、14(D₁₄)、21(D₂₁)和28(D₂₈)天每组随机抽取6羽翼下静脉采血，分离血清，用β-微量法检测ND-HI抗体效价；每组随机抽取4羽心脏采血，用MTT法测定淋巴细胞增殖(A₅₇₀值)。

结果：(1)血清抗体效价的变化芪藿糖增免剂各剂量组在各时间点的抗体效价多明显或显著高于疫苗对照组和空白对照组。在首次免疫后第7天(D₇)，6mg组的抗体效价最高，其次为10、2mg组，3组显著高于免疫对照组(P＜0.05)，3组之间差异不显著(P＞0.05)；在D₁₄，8mg组的抗体效价最高，其次为6mg组，两组显著高于其余各组(P＜0.05)，两组之间差异不显著(P＞0.05)；在D₂₁，6mg组的抗体效价最高，显著高于除8mg外的其余各组(P＜0.05)；在D₂₈，6mg组的抗体效价仍最高，其次为4mg组，两组显著高于免疫对照组(P＜0.05)，两组之间差异不显著(P＞0.05)(表3)。

表3各组血清ND-HI抗体效价的变化(log₂)

以上结果表明，芪藿糖增免剂在合适的剂量能显著提高新城疫疫苗免疫雏鸡的血清抗体效价，提高雏鸡的体液免疫功能。各剂量相比，6mg的作用最好，其次为8mg和4mg。

(2)淋巴细胞增殖的变化芪藿糖增免剂各剂量组在各时间点的A₅₇₀值多明显或显著高于免疫对照组和空白对照组。在首次免疫后第7天(D₇)，12mg组的A₅₇₀值最大，显著大于免疫对照组(P＜0.05)；在D₁₄，6mg组的A₅₇₀值最大，显著大于其余各组(P＜0.05)，其次为与4、12、2mg组，4个组显著大于免疫对照组(P＜0.05)；在D₂₁，4mg组的A₅₇₀值最大，其次为6、8mg组，3个组显著大于免疫对照组(P＜0.05)，3组之间的差异不显著(P＞0.05)；在D₂₈，4mg组的A₅₇₀值最大，其次为6mg组，两组显著大于免疫对照组(P＜0.05)，两组之间差异不显著(P＞0.05)(表4)。

表4各组淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

以上结果表明，芪藿糖增免剂在合适的剂量能显著提高新城疫疫苗免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖，提高雏鸡的细胞免疫功能。各剂量相比，以4mg的作用最好，其次为6mg。

综合考虑细胞免疫和体液免疫的测试结果，雏鸡每次肌肉注射5mg为最佳剂量。

Claims

1.一种中药芪藿糖免疫增强剂，由黄芪提取物和硫酸化淫羊藿多糖制成，简称为芪藿糖增免剂，其特征在于，每1000ml药液由黄芪饮片40g和淫羊藿饮片120g制成。

2.权利要求1所述芪藿糖增免剂的制备方法，其特征在于，黄芪水煎3次，合并滤液，85℃减压浓缩至500ml，淫羊藿加水煎煮2次，合并滤液，85℃减压浓缩至120ml，加入95％乙醇使醇含量达体积比70％，沉淀60℃真空干燥，加入到1∶8的氯磺酸-吡啶中，80℃振荡反应2h，冰浴迅速冷却，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入95％乙醇使醇含量达体积比70％，沉淀用自来水透析48h、蒸馏水透析24h，浓缩至500ml，与黄芪溶液混匀，滤过，分装，灭菌，获得。

3.根据权利要求2所述芪藿糖增免剂的制备方法，其特征在于，黄芪提取物的提取工艺为黄芪加10倍质量水、煮沸60min提取，共提取3次；淫羊藿多糖的提取工艺为加淫羊藿加20倍质量水、煎煮2次，第一次1.5小时、第二次1小时。