CN1683012A - 人参皂甙纳米微粒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参皂甙纳米微粒及其制备方法和用途。将人参皂甙、胆固醇和卵磷脂三者以重量比20∶1∶1混合，用非离子表面活性剂助溶。人参皂甙、胆固醇和卵磷脂三者相互作用，自动形成纳米微粒。然后用透析或者超滤法除去非离子表面活性剂。由此形成的人参皂甙纳米微粒(Ginsome)在电子显微镜下观察为一种直径为60～80nm的球状微粒。Ginsome具有疫苗免疫佐剂的功能，增强疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫功能，只需要10微克就可以显著提高抗原的免疫原性，在疫苗制造上具有广泛用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种人参皂甙纳米微粒(Ginsome)及其制备方法和用途。
技术背景
佐剂是一类可以增强疫苗诱导的免疫反应强度或改变免疫反应类型的物质。自从上个世纪20年代Glenny发现氢氧化铝铝胶具有佐剂以来后，氢氧化铝铝胶是目前唯一经过批准的人用疫苗佐剂，已经广泛用于人兽疫苗的生产。但氢氧化铝铝胶佐剂有许多不足之处(1，2，3，4)，例如，1)它可促进IgE抗体产生，容易诱导机体产生过敏反应；2)注射后局部刺激性较大；3)多次注射含氢氧化铝铝胶的疫苗可以导致铝盐在局部累积，引起局部肌肉疾病；4)氢氧化铝铝胶主要促进Th2类免疫反应，而对Th1类免疫反应促进不大。Th1类免疫反应主要是针对细胞内寄生的病原微生物；Th2类免疫反应主要是针对细胞外寄生的病原微生物和寄生虫。所以，氢氧化铝铝胶主要用于细菌性菌苗的生产，而对于一些病毒疫苗的佐剂意义不大。
传统疫苗一般用全菌体或全病毒制成，含有多种抗原成分，它们当中能够产生保护性免疫反应的只有少部分，其余的抗原非但没有必要，还会引起一定的副反应。随着免疫学基础理论研究的深入，以及抗原提纯技术和基因工程技术的发展，出现了许多亚单位抗原和多肽抗原，有的抗原已经能够人工合成。和传统菌疫苗比较，这些抗原具有分子量小、纯度高、安全性好的优点。但至今为止，开发成功的相关疫苗却为数甚少。其原因之一是纯化后抗原的免疫原性变差，难以诱导机体产生足够的免疫反应。
因此，研究既促进Th1类又促进Th2类免疫反应的新型佐剂或提高亚单位疫苗的免疫效果具有重要意义。我们以前的研究表明，人参皂甙是一个安全的免疫佐剂。它不仅可以提高Th1类免疫反应，还可提高Th2类免疫反应(5，6，7，8， 9)。有关成果已经获得国家发明专利(10)。人参皂甙可以从中草药人参Panaxginseng C.A.Mey的根，西洋参Panax quinquefolium L.的根，三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的根，或者绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Mak.的全草中提取，是一类具有三萜皂甙化学结构的化合物(11)。人参皂甙常用的提取方法是(12)：用乙醇或甲醇溶剂提取，回收溶剂，将残渣溶于水，滤除不溶物，水溶液用石油醚、苯或乙醚等亲脂性有机溶剂作两相萃取，以除去亲脂性杂质。然后改用水饱和的丁醇萃取，使皂甙转移于丁醇。收集丁醇，减压蒸干，的粗制人参皂甙。将粗制的人参皂甙溶解于少量甲醇或乙醇中，然后逐滴加入丙酮，混合均匀，即析出人参皂甙。如此处理数次，即可获得精制人参皂甙。如此获得的人参皂甙需要较大剂量才能发挥佐剂作用，直接作为动物疫苗的免疫佐剂相对成本较高。
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9.Rivera，E.，Hu，S.，Concha，C.Ginseng and aluminium hydroxide actsynergistically as vaccine adjuvants.Vaccine 2003，21，1149-1157
10.人参总皂甙和单体皂甙Rb1的疫苗佐剂用途(专利号：ZL02110578.2)；
11.宋小妹，唐志书(主编)，中草药化学成分提取分离与制备(第1版)，人民卫生出版社，北京，2004年，第33页，第51页，第206页，第394页。
12.王宪楷(主编)，天然药物化学，第1版，人民卫生出版社出版，北京，1988年，第549页。
发明内容
本发明的目的是提供一种人参皂甙纳米微粒(Ginsome)及其制备方法和用途。
人参皂甙纳米微粒(Ginsome)是一种含有人参皂甙、胆固醇和卵磷脂的直径为60～80nm的球状微粒。
人参皂甙纳米微粒(Ginsome)的制备方法的步骤如下：
1)人参皂甙溶液的配制：将人参皂甙溶解于蒸馏水，配成50～100mg/ml溶液，过滤除菌，备用；
2)胆固醇/卵磷脂溶液的配制：将非离子型表面活性剂，例如Mega-10，可用Sigma公司产品或辛基葡萄糖甙octylglucoside，配置成20～25％的水溶液，然后将卵磷脂和胆固醇溶解于非离子型表面活性剂溶液中，使其含卵磷脂和胆固醇各10～15毫克/毫升，过滤除菌，备用；
3)将上述人参皂甙溶液和胆固醇/卵磷脂溶液混合，使人参皂甙，胆固醇和卵磷脂三者的重量比为20∶1∶1，加入磷酸缓冲液，pH7～7.4，使混合溶液含人参皂甙20毫克/毫升，胆固醇1毫克/毫升和卵磷脂1毫克/毫升，混匀，置25～50℃恒温水浴0.5～2小时；
4)将混合液体转移至截留分子量为12,000～14,000的透析袋中，然后将透析袋放入磷酸缓冲液，pH7.4，中透析，透析温度为20～40℃，每6小时换一次磷酸缓冲液，连续透析24～72小时，将透析袋中的液体转移到离心管中，离心10～30分钟，离心速度为400～500g，弃沉淀，即可；
或者，将混合液体转移至截留分子量为10,000～100,000的离心超滤管中，离心超滤管可采用Millipore公司产品(MicroconCentrifugal Filter Units，www.millipore.com/puredna)，离心，离心速度为500～14,000g，加生理盐水继续离心洗涤，如此重复2～6次。再加入生理盐水，混匀，即可。
人参皂甙纳米微粒用于疫苗的免疫佐剂。
本发明的优点
1)人参皂甙纳米微粒Ginsome可以作为亚单位疫苗的免疫佐剂；
2)人参皂甙制成纳米微粒Ginsome以后，人参皂甙对亚单位疫苗的佐剂作用增强，而达到发挥佐剂作用所需要的人参皂甙剂量大大减少，因此降低了成本，Ginsome可以作为今后开发亚单位疫苗的新型佐剂；
3)Ginsome可以促进Th1类和Th2类免疫反应，因此，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥更加好的免疫效果；
4)Ginsome可以冰冻保存，解冻后仍保持纳米微球形态不变，可以长时间保存。
附图说明
图1是Ginsome电子显微镜照片(磷钨酸染色，30000倍放大)。人参皂甙纳米微粒(Ginsome)是一种含有人参皂甙、胆固醇和卵磷脂的直径为60～80nm的球状微粒；
图2是二免疫后3次血清抗OVA抗体检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1
人参皂甙纳米微粒(Ginsome)的制备方法一
1.人参皂甙溶液的配制：将人参皂甙溶解于蒸馏水，配成50～100mg/ml溶液，过滤除菌，备用。
2.胆固醇/卵磷脂溶液的配制：将非离子型表面活性剂Mega-10(Sigma公司产品)，配置成20％的水溶液，然后将卵磷脂(中国华东师范大学华工厂产品)和胆固醇(上海化学试剂公司产品)溶解于Mega-10(Sigma公司产品)溶液中，使其含卵磷脂和胆固醇各10～15毫克/毫升，过滤除菌，备用。
3.将上述人参皂甙溶液和胆固醇/卵磷脂溶液混合，使人参皂甙，胆固醇和卵磷脂三者的重量比为20∶1∶1，加入磷酸缓冲液，pH7.4，使混合溶液含人参皂甙20毫克/毫升，胆固醇1毫克/毫升和卵磷脂1毫克/毫升，混匀，置37℃恒温水浴1小时。
4.将混合液体转移至截留分子量为12,000～14,000的透析袋中，然后将透析袋放入磷酸缓冲液，pH7.4，中透析，透析温度为37℃，每6小时换一次磷酸缓冲液，连续透析48小时，将透析袋中的液体转移到离心管中，离心20分钟，离心速度为470g，弃沉淀，即可。
实施例2
人参皂甙纳米微粒(Ginsome)的制备方法二
1.人参皂甙溶液的配制：将人参皂甙溶解于蒸馏水，配成50～100mg/ml溶液，过滤除菌，备用。
2.胆固醇/卵磷脂溶液的配制：将非离子型表面活性剂Mega-10(Amresco公司产品)，配置成20％的水溶液，然后将卵磷脂和胆固醇溶解于Mega-10溶液中，使其含卵磷脂和胆固醇各10～15毫克/毫升，过滤除菌，备用。
3.将上述人参皂甙溶液和胆固醇/卵磷脂溶液混合，使人参皂甙，胆固醇和卵磷脂三者的重量比为20∶1∶1，加入磷酸缓冲液，pH7.4，使混合溶液含人参皂甙20毫克/毫升，胆固醇1毫克/毫升和卵磷脂1毫克/毫升，混匀，置37℃恒温水浴1小时。
4.将混合液体转移至截留分子量为10,000～100,000的离心超滤管中，离心超滤管为Millipore公司产品(MicroconCentrifugal Filter Units，www.millipore.com/puredna)，离心，离心速度为8000g，加生理盐水继续离心洗涤，如此重复5次。再加入生理盐水，混匀，即可。
实施例3
人参皂甙纳米微粒(Ginsome)对模式亚单位抗原的卵清白蛋白(OVA)免疫佐剂作用
材料和方法
1.模式抗原和佐剂的混合液：将模式抗原卵清白蛋白(OVA，上海伯奥生物科技公司产品)溶解在生理盐水。然后将OVA和人参皂甙(GS)或人参皂甙纳米微粒(Ginsome)溶液混合，制成每毫升含50μg OVA，以及每毫升含50μg OVA和250μg人参皂甙或Ginsome的溶液，摇床24小时摇动，充分混匀，然后置冰箱(4℃)保存备用。
2.实验动物及其免疫方法：8～10周龄雌性SPF Balb/c小鼠(上海国家啮齿类实验动物种子中心提供)35只。小鼠被随机分成7组，每组5只。每只小鼠颈背部皮下注射模式亚单位抗原的卵清白蛋白(OVA)或OVA和免疫佐剂混合物，间隔28天后再注射一次，每次注射物体积为0.2毫升，见表1。
表1实验动物分组及各组处理方式
| 组别 | 小鼠数(只) | 每次注射含抗原和佐剂剂量 | 免疫方式 | |
| 佐剂 | 抗原 | |||
| 1234567 | 5555555 | 无佐剂人参皂甙(50μg)Ginsome(含人参皂甙10μg)Ginsome(含人参皂甙50μg)Ginsome(含人参皂甙100μg)Ginsome(含人参皂甙500μg)Ginsome(含人参皂甙1000μg) | 10μg10μg10μg10μg10μg10μg10μg | 间隔28天两次颈背部皮下注射 |
3.免疫后观察：观察每次注射后小鼠精神状态、行为变化，每天称一次小鼠体重并记录，记录采血情况和小鼠变化。
4.血样采集：于第二次免疫后的1，2，3周，每只小鼠无菌室内用毛细管眼窝血管采血，血液置0.5mL塑料离心管，于4℃冰箱过夜，第二天离心，离心速度为6000转/分，离心20分钟，将血清转移至0.2mL塑料管分装，-20℃保存，备用。
5.抗体检测：在96孔酶标板上每孔加入100μl包被液(含1.4mgOVA/ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)，置4℃孵育24小时后，用洗涤液(0.01mol/LPBS-0.05％吐温-20，pH7.4)洗涤3次(每孔200μl)，每次3分钟。每孔加入300μl封闭液(0.01mol/L PBS-3％吐温-20溶液)，室温孵育1小时后，用洗涤液洗涤3次(每孔300μl)，每次3分钟。加入待检血清和阴性血清(1∶100稀释)，每孔100μl。室温孵育2h后，用洗涤液洗涤3次(每孔200μl)，每次3分钟。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Chemi con International，Inc.产品；1∶500稀释)，100μl/孔。室温孵育2小时后，用洗涤液洗涤3次(每孔200μl)，每次3分钟。加入四甲基联苯二胺(TMB，SIGMA-ALDRICH公司产品)溶液显色，100μl/孔，37℃孵育30分钟后，加2M H2SO4溶液50μl/孔终止反应。置酶标仪(Multiskan MK3)测定OD450(吸光度，OD)值。
结果和分析
1.人参皂甙纳米微粒(Ginsome)皮下注射对鼠是安全性的
两次免疫后，各组小鼠在食欲、精神状态、行动能力等方面均无异常变化。体重除第1次免疫后有所下降外，一周后就基本呈增重趋势；二免后无体重下降情况。表2为小鼠4次体重称量每组的平均体重。各组小鼠体重变化无显著性差异。
表2每组小鼠的平均体重(单位：g)
组别 一免前1天 一免后1周 二免前1天 二免后1周
1 24.6 25.6 27.3 28.3
2 24.5 23.5 26.2 27.3
3 24.7 24.6 26.7 27.5
4 23.7 23.4 26.5 26.9
5 23.4 25.3 25.8 26.5
6 24.7 25.0 26.1 27.7
7 24.5 24.2 27.4 27.4
2.免疫后血清抗OVA抗体水平
图2为二免疫后3次血清抗OVA抗体检测结果，说明：1)二免疫后3次检测，第2组的抗体水平均低于第1组，但无统计学差异，表示人参皂甙在剂量为50微克时，无佐剂作用；2)第3、4、5、6、7组的抗体水平显著高于第1、2组，说明人参皂甙纳米微粒(Ginsome)有佐剂作用；3)第2组的人参皂甙剂量为50微克，而第3、4组Ginsome所含的人参皂甙剂量分别为10、50微克。Rivera等人报道(Rivera，E.，Hu，S.，Concha，C.Ginseng and aluminiumhydroxide act synergistically as vaccine adjuvants.Vaccine 2003，21，1149-1157)，人参皂甙在剂量为160微克时无佐剂作用，在830微克时有佐剂作用。本试验将人参皂甙制备成人参皂甙纳米微粒(Ginsome)，在含人参皂甙10～1000微克的剂量范围均有显著佐剂作用，因此，人参皂甙做成纳米微粒(Ginsome)以后，佐剂作用增强，而人参皂甙用量减少。
实施例4
人参皂甙纳米微粒(Ginsome)对裂解流感病毒疫苗的佐剂作用
实验方法
1.抗原和佐剂的混合液：将裂解流感病毒(H3N2毒株，杭州天元生物公司提供)用生理盐水稀释或和Ginsome或和氢氧化铝混合，配制成每0.2毫升液体中含以下物质：1)裂解流感病毒，50血凝单位(HAU)；2)裂解流感病毒，100HAU；3)裂解流感病毒，500HAU；4)裂解流感病毒，100HAU+Ginsome(含人参皂甙10微克)；5)裂解流感病毒，100HAU+50微克氢氧化铝。充分混匀，然后置冰箱(4℃)保存备用。
2.实验动物及其免疫方法：体重18～20克的雌性SPF Balb/c小鼠(上海国家啮齿类实验动物种子中心提供)30只。小鼠被随机分成5组，每组6只。每只小鼠腹股部皮下注射上述5种液体，间隔21天后再注射一次，每次注射物体积为0.2毫升，见表1。
血样采集和血凝抑制效价检测
于第二次免疫后的4周，每只小鼠无菌室内用毛细管眼窝血管采血，血液置0.5mL塑料离心管，于4℃冰箱过夜，第二天离心，离心速度为6000转/分，离心20分钟，将血清转移至0.2mL塑料管分装，-20℃保存，备用。采用血凝抑制法检测小鼠血清血凝抑制效价(HI)。
结果和分析
二免后血凝抑制效价检测结果表明，单纯增加抗原剂量，HI抗体效价变化不大；常规佐剂氢氧化铝铝胶和对照组比较无显著差异；疫苗中加入人参皂甙纳米微粒Ginsome之后，HI效价显著高于对照组(表3)。
表3注射不同剂量和含不同佐剂的流感疫苗后，小鼠血清HI效价(n＝6)
| 灭活流感病毒剂量(HAU，每次注射剂量) | 佐剂 | 血凝抑制效价(HI，几何平均值) |
| 50 | 无佐剂 | 1∶256 |
| 100 | 无佐剂 | 1∶256 |
| 500 | 无佐剂 | 1∶469 |
| 100 | Ginsome(含10微克人参皂甙) | 1∶683 |
| 100 | 氢氧化铝铝胶(50微克) | 1∶329 |
Claims (4)
1.一种人参皂甙纳米微粒，其特征在于，它是一种含有人参皂甙、胆固醇、卵磷脂的直径为60～80nm的球状微粒。
2.一种人参皂甙纳米微粒的制备方法，其特征在于，方法的步骤如下
1)人参皂甙溶液的配制：将人参皂甙溶解于蒸馏水，配成50～100mg/ml溶液，过滤除菌，备用；
2)胆固醇/卵磷脂溶液的配制：将非离子型表面活性剂Mega-10或辛基葡萄糖甙，配置成20～25％的水溶液，然后将卵磷脂和胆固醇溶解于非离子型表面活性剂溶液中，使其含卵磷脂和胆固醇各10～15毫克/毫升，过滤除菌，备用；
3)将上述人参皂甙溶液和胆固醇/卵磷脂溶液混合，使人参皂甙，胆固醇和卵磷脂三者的重量比为20∶1∶1，加入磷酸缓冲液，pH7～7.4，使混合溶液含人参皂甙20毫克/毫升，胆固醇1毫克/毫升和卵磷脂1毫克/毫升，混匀，置25～50℃恒温水浴0.5～2小时；
4)将混合液体转移至截留分子量为12,000～14,000的透析袋中，然后将透析袋放入磷酸缓冲液，pH7.4，中透析，透析温度为20～40℃，每6小时换一次磷酸缓冲液，连续透析24～72小时，将透析袋中的液体转移到离心管中，离心10～30分钟，离心速度为400～500g，弃沉淀，即可；
或者，
将混合液体转移至截留分子量为10,000～100,000的离心超滤管中，离心，离心速度为500～14,000g，加生理盐水继续离心洗涤，如此重复2～6次，再加入生理盐水，混匀，即可。
3.根据权利要求2所述的一种人参皂甙纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的人参皂甙是人参的根、西洋参的根、三七的根或绞股蓝的全草提取物，它是具有三萜皂甙化学结构的化合物。
4.一种人参皂甙纳米微粒的用途，其特征在于，用于疫苗的免疫佐剂。
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