CN115531527A - 一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用，具体涉及免疫生物学领域。包括步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡‑纳米地黄多糖产品。本发明采用超滤法制备的了波氏杆菌的外膜囊泡，并将其通过挤压器，反复挤压，与纳米地黄多糖相结合，构建针对波氏杆菌的纳米亚单位疫苗，旨在增强单独外膜囊泡的稳定性，改善其免疫效果。

Description

一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫生物学领域，具体涉及一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用。
背景技术
细菌外膜囊泡(outer membranevesicles，OMVs)是由革兰阴性细菌以出芽的方式分离出来的直径为20～300nm的球形双层纳米结构。细菌产生的膜囊泡保留了源细菌的理化特性，但不能再生和复制。
由于OMVs中的膜相关蛋白和毒力因子可诱导细胞产生免疫反应，表明OMVs可以作为免疫原性物质刺激组胞阻止病原体入侵。因此，具有高免疫原性和非复制性的OMVs是疫苗的优良候选者之一。
目前波氏杆菌疫苗都是灭活苗，虽能使机体产生抗体，但持续时间短，保护率低，不能有效抵御再次感染。
发明内容
为此，本发明提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品及其制备方法和应用，以解决现有波氏杆菌疫苗持续时间短，保护率低，不能有效抵御再次感染等问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明的第一方面提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，包括：
步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；
步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；
步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品。
进一步的，所述超滤浓缩法为先将单个菌落进行扩大培养；再将扩大培养的滤液进行离心、过滤后超滤、浓缩；浓缩液离心后重悬，得波氏杆菌外膜囊泡。
进一步的，所述扩大培养时，培养液中添加头孢氨苄64μg/mL。
进一步的，所述过滤后超滤的条件为过滤是经过0.45μm的滤器；超滤装置的截留分子量为100kDa。
进一步的，所述重悬为TE缓冲液重悬或PBS缓冲液重悬。
进一步的，所述薄膜分散法结合超声法包括：
大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG 2000溶于甲醇和氯仿混合液中，搅拌溶解，减压旋转蒸发除去有机溶剂；
瓶壁形成一层均匀的薄膜后，导入熟地多糖的水溶液，水化后继续旋蒸；瓶壁薄膜完全洗脱，加入ddH2O继续旋转蒸发；
蒸发结束后，利用探头式超声细胞粉碎机进行超声粒径均一化处理，，再将粒径均一化处理的溶液挤压过微孔滤膜，得纳米地黄多糖免疫佐剂。
进一步的，所述探头式超声细胞粉碎机得强度40％，10s开，10s停，工作时间2min。
进一步的，所述聚碳酸酯膜得粒径为200nm。
根据本发明的第二方面提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品，是由如上所述方法制备而成。
根据本发明的第三方面提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品在制备纳米亚单位疫苗中的应用。
本发明具有如下优点：
本发明采用超滤法制备的了波氏杆菌的外膜囊泡，并将其通过挤压器，反复挤压，与纳米地黄多糖相结合，构建针对波氏杆菌的纳米亚单位疫苗，旨在增强单独外膜囊泡的稳定性，改善其免疫效果。
将本发明的纳米亚单位疫苗应用到动物体内，明确其免疫增强效果和预防细菌感染的功效。
本发明的一种纳米佐剂应用在以外膜囊泡为基础的亚单位疫苗上，研制出针对波氏杆菌病的安全高效的纳米亚单位疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明试验例1提供的OMV、pRL和pRL-OMV的透射电镜图；
图2为本发明试验例1提供的OMV、pRL和pRL-OMV的粒径(A)和电势(B)检测结果；
图3为本发明试验例2提供的小鼠血清OMV和Bb特异性抗体水平；
其中，A-OMV特异性IgG在免疫后第4和6周；B-各组OMV特异性IgG1的水平；C-OMV特异性IgG2a的与IgG的结果；D-Bb特异性IgG在免疫后第2和4周；E-各组Bb-IgG1的水平；F-各组Bb-IgG2a的结果；
图4为试验例2提供的免疫后血清中Th1、Th2和Th17型细胞因子含量；
图5为试验例2提供的免疫后小鼠血常规结果；
图6为试验例2提供的免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖率；
图7为试验例2提供的免疫后小鼠淋巴细胞上清细胞因子含量；
图8为试验例2提供的免疫后小鼠攻毒后肺部含菌量检测结果；
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
pRL-表面有PEG修饰的纳米地黄多糖；
OMV-波氏杆菌外膜囊泡；
RL-没有PEG修饰的纳米地黄多糖；
BL-没有包载地黄多糖的空载体；
RGP-地黄多糖；
实施例1
本实施例提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖(pRL-OMV)产品的制备：
1.采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡(OMV)。
具体方法为：挑取单个菌落，接种到摇菌管中，15h后转移至锥形瓶中(v:v＝1:100)扩大培养至对数期末期，培养时间为18h，为了增加OMV产量，在扩大培养时，培养液中添加头孢氨苄64μg/mL；在4℃条件下，以1×104g离心20min，取上清液；经0.45μm的滤器过滤后，收集到超滤装置中(截留分子量为100kDa)，收集浓缩滤液；接着在4℃条件下，以1×105g超速离心2h，弃上清液；沉淀用TE缓冲液重悬，于-80℃条件下冻存备用。
2.pRL采用薄膜分散法结合超声法制得。
具体方法为：称取200mg大豆卵磷脂，12.75mg胆固醇和36mg DSPE-PEG2000溶于甲醇和氯仿混合液中(v:v＝1:1)，磁力搅拌使其充分溶解。置于25mL圆底烧瓶中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂。
当烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜后，导入10mL的含3.7mg·mL-1熟地多糖的水溶液，50℃水化30min，50℃旋转蒸发，使瓶壁薄膜完全洗脱，加入少量ddH2O继续旋转蒸发。
随后置于探头式超声细胞粉碎机进行超声处理(强度40％，10s开，10s停，工作时间2min)，使PEG化纳米地黄多糖(pRL)的粒径均一化，再将得到的pRL溶液分别挤压过孔径为0.45μm、0.22μm的微孔滤膜，各重复三次，即得10mLpRL溶液，置于4℃保存。
RL的制备方法同上，除了不添加DSPE-PEG2000；
BL的制备方法亦同上，除了不添加RGP。
3.将制得的pRL和OMV等体积混合后，通过装有200nm聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合。经挤压器来回挤压10次，即得pRL-OMV溶液；4℃保存备用。
实施例2
本实施例提供一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖(pRL-OMV)产品的制备：
1.采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡(OMV)。
具体方法为：挑取单个菌落，接种到摇菌管中，15h后转移至锥形瓶中(v:v＝1:200)扩大培养至对数期末期，培养时间为18h，为了增加OMV产量，在扩大培养时，培养液中添加头孢氨苄64μg/mL；在4℃条件下，以1×104g离心20min，取上清液；经0.45μm的滤器过滤后，收集到超滤装置中(截留分子量为100kDa)，收集浓缩滤液；接着在4℃条件下，以1×105g超速离心2h，弃上清液；沉淀用TE缓冲液重悬，于-80℃条件下冻存备用。
3.pRL采用薄膜分散法结合超声法制得。
具体方法为：称取大豆磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000(三者摩尔比为200:25:8)溶于甲醇和氯仿混合液中(v:v＝1:1)，磁力搅拌使其充分溶解。置于圆底烧瓶中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂。
当烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜后，导入含熟地多糖的水溶液(磷脂与多糖的质量比为5:1)，50℃水化30min，50℃旋转蒸发，使瓶壁薄膜完全洗脱，加入少量ddH2O继续旋转蒸发。
随后置于探头式超声细胞粉碎机进行超声处理(强度40％，10s开，10s停，工作时间2min)，使PEG化纳米地黄多糖(pRL)的粒径均一化，再将得到的pRL溶液分别挤压过孔径为0.45μm、0.22μm的微孔滤膜，各重复三次，即得pRL溶液，置于4℃保存。
3.将制得的pRL和OMV等体积混合后，通过装有200nm聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合。经挤压器来回挤压10次，即得pRL-OMV溶液；4℃保存备用。
试验例1
本试验例对实施例1提供的pRL-OMV产品的理化性质进行研究：
1.形态学观察
透射电镜(transmission electron microscope，TEM)下观察pRL-OMV的形态。取10μL样品滴在蜡纸上，将铜网与样品液表面接触，静置3～5min，用滤纸吸去多余的样品。用2％的磷钨酸对样品进行负染色，晾干后在Hitachi H7650透射电镜下观察OMV的形态，用高灵敏度电荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)相机记录试验结果。实验结果见图1所示。
pRL-OMVTEM结果：见图1所示。
电镜下可见，波氏杆菌OMV呈单层膜结构的脂质纳米囊泡，单独pRL则是具有多层膜结构的脂质纳米球。二者通过挤压法相融合，形成同心圆结构。
2.NTA检测pRL-OMV的Zeta电位、粒径和分散系数
1)采用纳米颗粒跟踪分析仪(Particle Metrix，德国)检测pRL-OMV的Zeta电位、粒径分布和分散系数(PDI)。
2)pRL-OMV粒径和电势结果：见图2所示。
NTA结果显示OMV直径在114nm左右，Zeta电势为-38.6±3.88mV。单独pRL直径在109nm左右，Zeta电势为-29.5±0.59mV。NTA结果显示pRL-OMV直径在126nm左右，表面电势为-40.4±1.59mV。
试验例2
本试验例提供实施例1制备的pRL-OMV疫苗进行实验：
1.1动物分组及免疫
将5周龄Balb/c小鼠(购自杭州子源实验动物科技有限公司)经一周环境适应后，随机分7组，每组6只。第一组小鼠皮下免疫pRL为佐剂的波氏杆菌的OMV疫苗，每只0.4mL(1mg/只RGP+1μg/mLOMV)；第二组皮下免疫RL为佐剂的OMV疫苗，0.4mL/只；第三组免疫BL为佐剂的OMV疫苗；第四组免疫RGP为佐剂的OMV疫苗；第五组免疫铝为佐剂的OMV疫苗；第六组为无佐剂的OMV疫苗；第七组为空白对照组，注射0.4mL/只的PBS。
分别进行两次免疫，时间间隔两周。在二免后第2、4、6周分别进行眼球采血，分离血清，检测血清中IgG、IgG1、IgG2a及IFN-γ、IL-4等细胞因子含量。
有些试验中，无菌分离小鼠的腹股沟淋巴结和脾脏，流式检测其中记忆淋巴细胞、活化的DC细胞的含量。
1.2抗感染试验
小鼠的分组和免疫方法同1.2所述。在二免后7天，通过尾静脉，注射波氏杆菌的活菌，2.7*106CFU/只。攻毒后第6天，无菌分离小鼠肺脏，Hank’s液洗去表面血液，置于5mL无菌管中，加入2mLHank’s液和钢珠，在组织破碎仪上加工成肺组织液。将组织液用培养液按照1：10、1：100、1：1000倍比稀释，各取100μL的稀释液涂布于TSA平板中，置于37℃培养，24h后计数肺组织中菌落数。
1.3补体介导的小鼠血清杀菌活性检测
检测血清杀菌活性前，首先检测补体自然杀菌率。在96孔板中加PBS溶液(40μL/孔)，20μL未灭活或灭活(恒温金属浴56℃30min)的豚鼠补体，最后加入20μL103CFU/mL的波氏杆菌。充分混匀后，于37℃恒温摇床内以100rpm培养1h后取出，取50μL的混合液涂布于TSA培养基，置于37℃恒温培养箱内过夜培养，24h后计算平皿内的菌落数并计算平均值。按如下公式计算：
补体的自然杀菌率＝(灭活补体的菌落数-补体的菌落数)/灭活补体的菌落数×100％
判断标准为补体的杀菌率不超过30％，则补体合格。
将实验动物在二免后第4周收集的血清，置于56℃30min灭活补体。在96孔板中，每孔依次加入40μLPBS溶液，将灭活的血清按照2、22、23、24、25……210依次倍比稀释。吸取检测合格的豚鼠补体、103CFU/mL的波氏杆菌菌液各20μL到每个孔中，同时设置灭活补体对照：PBS 40μL，灭活豚鼠补体和波氏杆菌菌液各20μL，每组重复三次。混合均匀后，于37℃恒温摇床内以100rpm培养1h之后取出，吸取50μL的混合液涂布于TSA培养基，倒置于恒温培养箱内37℃过夜培养，次日使用Scan1200全自动菌落计数仪记录菌落数并计算平均值。按如下公式计算：
免疫血清的杀菌率＝(阴性血清的菌落数-免疫血清的菌落数)/阴性血清的菌落数×100％
1.4数据的统计与分析
用GraphPad Prism 8进行统计分析和作图。各组数据以平均值±标准误表示。两组间差异采用t检验，多组间差异采用One-wayANOVA和Turkey多重比较进行分析。当P<0.05时表示结果有统计学意义，表示为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
2.试验结果：pRL为佐剂的OMV疫苗能显著提升免疫后血清抗体和细胞因子水平：
小鼠两次免疫后，在第二次免疫后第2、4和6周，分别收集小鼠血清，检测血清中OMV特异性和Bb特异性抗体及其亚型的水平。结果如图3所示，OMV特异性IgG在免疫后第4和6周，pRL-OMV组的水平均显著高于RL-OMV组。相较于BL-OMV和单独OMV组，免疫后第2-6周，pRL-OMV组显示出显著的优势(图3A)。各组OMV特异性IgG1的水平，以pRL-OMV组为最高，显著高于BL-OMV、RGP-OMV和单独OMV组(图3B)。OMV特异性IgG2a的与IgG的结果类似(图3C)。
Bb特异性IgG在免疫后第2和4周(图3D)，pRL-OMV组显著高于出除铝佐剂(Alum-OMV)之外的其他各组，第6周，pRL-OMV组与Alum-OMV组差异显著。Bb-IgG1的水平，同样以pRL-OMV为最高，第2到第6周逐步升高，第6周显著高于RL-OMV、Alum-OMV和单独OMV等组(图3E)。Bb-IgG2a的结果与Bb-IgG的类似(图3F)。
免疫后第六周，对各组小鼠血清中细胞因子水平通过ELISA法进行了定量分析。由图4可见，pRL-OMV免疫后小鼠血清中Th1(IFN-γ和IL-12p70)、Th2(IL-4和IL-5)以及Th17(IL-17和TNF-α)型细胞因子的水平相较于铝佐剂组(Alum-OMV)和单独OMV组均得到显著提升。pRL-OMV免疫组相较于RL-OMV免疫组，各细胞因子均得到提升，但差异不显著。由此PEG修饰能有效改善RL的免疫增强作用。
免疫后第4周，采集各组免疫后小鼠的全血，收集到抗凝管中，在血细胞分析仪上检测各组血细胞含量，并作比较分析。由图5可见，pRL-OMV免疫后小鼠血液中的白细胞总数(WBC)、淋巴细胞总数(SCC)、单核细胞(MCC)和中性粒细胞总数(LCC)均得到显著增加。pRL-OMV相较于RL-OMV，淋巴细胞水平显著提升，由此可见PEG修饰能显著改善纳米地黄多糖的免疫佐剂活性。
二免后4周，无菌分离小鼠脾脏，制成细胞悬液，分别经LPS、ConA、OMV刺激24h后，比较各组细胞增殖率。由图6可见，经pRL-OMV免疫后小鼠脾脏淋巴细胞经ConA、LPS和OMV抗原刺激后的增殖水平显著提高，表明pRL-OMV能有效提高动物细胞免疫水平。
二免后4周，无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞，并采用ELISA法检测淋巴细胞上清细胞因子含量检测。由图7可见，pRL-OMV免疫组小鼠脾脏细胞IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-17的分泌水平均显著提升。
对各组免疫后小鼠，经尾静脉注射波氏杆菌，由图8可见，pRL-OMV可显著降低小鼠攻毒后肺部含菌量。
由此可见，pRL-OMV免疫小鼠，可有效预防细菌的再次感染。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一，采用超滤浓缩法制备波氏杆菌外膜囊泡；
步骤二，采用薄膜分散法结合超声法制备纳米地黄多糖免疫佐剂；
步骤三，将制得的波氏杆菌外膜囊泡和纳米地黄多糖免疫佐剂等体积混合后，通过装有聚碳酸酯膜的纳米粒挤压器进行融合，经挤压器来回挤压，即得细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品。
2.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩法为先将单个菌落进行扩大培养；再将扩大培养的滤液进行离心、过滤后超滤、浓缩；浓缩液离心后重悬，得波氏杆菌外膜囊泡。
3.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述扩大培养时，培养液中添加头孢氨苄64μg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述过滤后超滤的条件为过滤是经过0.45μm的滤器；超滤装置的截留分子量为100kDa。
5.根据权利要求2所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述重悬为TE缓冲液重悬或PBS缓冲液重悬。
6.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述薄膜分散法结合超声法包括：
大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG 2000溶于甲醇和氯仿混合液中，搅拌溶解，减压旋转蒸发除去有机溶剂；
瓶壁形成一层均匀的薄膜后，导入熟地多糖的水溶液，水化后继续旋蒸；瓶壁薄膜完全洗脱，加入ddH2O继续旋转蒸发；
蒸发结束后，利用探头式超声细胞粉碎机进行超声粒径均一化处理，再将粒径均一化处理的溶液挤压过微孔滤膜，得纳米地黄多糖免疫佐剂。
7.根据权利要求6所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述探头式超声细胞粉碎机得强度40％，10s开，10s停，工作时间2min。
8.根据权利要求1所述的一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品的制备方法，其特征在于，所述聚碳酸酯膜得粒径为200nm。
9.一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品，其特征在于，是由权利要求1-8任一方法制备而成。
10.一种细菌外膜囊泡-纳米地黄多糖产品在制备纳米亚单位疫苗中的应用。
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