JPH10500889A - 水性溶媒封入法、装置およびマイクロカプセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 選択された水溶性陰イオンポリマーまたはその塩と選択された水溶性アミンまたはその塩との反応生成物であるカプセル壁に囲まれた水性コアからなる、実質的に非水性夾雑物を含まないマイクロカプセルであって、該選択された陰イオン性ポリマーおよびアミンは、該ポリマーの水溶液の液滴を選択されたアミンの水溶液中へ導入されたとき、陰イオン性ポリマーのアミン塩の安定なマイクロカプセルが生じるような性質のものである。マイクロカプセルの水性コアは、ロタウイルスのような免疫原性物質を含めて、種々の活性成分のいずれのものを含んでもよい。活性な剤を含むマイクロカプセルを含めて、マイクロカプセルを製造するための本発明の方法および装置、並びにその使用方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 水性溶媒封入法、装置およびマイクロカプセル関連出願のクロス・リファレンス 本出願は、以下の同時係属特許出願：１９９４年４月１５日出願の米国特許出 願第０８／２２８，４８１号明細書；１９９４年４月１８日出願の米国特許出願 第０８／２２９，２８３号明細書；および１９９４年４月１８日出願の米国特許 出願第０８／２２９，５２０号明細書の一部継続出願である。前述の特許出願の 開示はそのまま本明細書中に援用される。発明の分野 本発明は、種々の活性物質を含むことができる水性または実質的に水性のコア を封入した異方性塩膜を有する新規のマイクロカプセルに関する。該マイクロカ プセルは、水性媒質中におけるルイス酸および塩基壁生成反応体の界面反応によ って製造される。発明の背景 マイクロカプセル封入は、比較的薄いコーティングを固体小粒子または液体小 滴の分散系に対して適用し、それによって液体を固体に変換し、コロイド性およ び表面特性を変更し、環境保護を提供し、そして被覆された物質の放出性または 利用可能性を調節するための手段を提供することができる処理である。これらの 特性のいくつかはマクロ包装技術によって達成されうるが、しかしながら、マイ クロカプセル封入の独自性は、被覆粒子の小ささおよびそれらの引き続きの使用 並びに広範囲の剤形および製品用途に対するそれらの適合である。従来、マイク ロカプセルを工業規模で製造する既知の実行可能な方法は、しばしば、有機溶媒 の使用を必要としてきた。しかしながら、有機溶媒の使用は環境上のおよび安全 性の問題を与えることがある。更に、マイクロカプセルから有機溶媒を全て除去 することはしばしば困難であり、したがって有機混入物が残る。 ワクチンを供給する手段としてマイクロカプセルを用いることが提案されてき た。二つの広範な種類の抗原デリバリーシステム、すなわち、固体（すなわち多 孔質）マイクロカプセルおよび物理的に異なる壁によって取り囲まれたコア部分 を含むマイクロカプセルは、免疫を促進するそれらの能力について研究されてき た。固体マイクロカプセルは、コロイドのコアセルベーション（クウォク（Ｋｗ ｏｋ），Ｋ．Ｋ．ら、１９９１年，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，８：３４１〜３４４ ）、物理的手段（例えば、相分離）若しくは化学薬剤（例えば、酸塩化物）によ るタンパク質の沈降（レヴィ（Ｌｅｖｙ），Ｍ．Ｃ．ら、１９９１年，Ｊ．Ｐｈ ａｒｍ．Ｓｃｉ． ，８０：５７８〜５８５）、またはポリエステル皮膜によって 水性分散系を取り囲む溶媒蒸発技術（シンハ（Ｓｉｎｇｈ），Ｍ．ら、１９９１ 年，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，８：９５８〜９６１）を含めた様々な処理によって 製造することができる。抗原デリバリーに有用なことが分かった壁／コアシステ ムとしては、リポソーム（ゲリア（Ｇｅｒｌｉｅｒ），Ｄ．ら、１９８３年，Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ，１３１：４９０）、イスコムス（ＩＳＣＯＭＳ）（クラー セン（Ｃｌａａｓｅｎ），Ｉ．およびオスターハウス（Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ）， Ａ．、１９９２年，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：５３１〜５４１）およ びプロテオソーム（グールド・フォゲライト（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ） ，Ｓ．およびマニノ（Ｍａｎｎｉｎｏ），Ｒ．、１９９２年，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第３版 ，グレゴリアディス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ），Ｇ．（監修），ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ），ボカ・ラション，ＦＬ；ミラ ー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｍ．Ｄ．ら、１９９２年，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６ ：１７３９〜１７４４）がある。 おそらく、抗原デリバリーシステムの内で研究された最良のものは、乳酸およ びグリコール酸の直鎖状ポリマーエステル（すなわち、ポリ（ＤＬ−ラクチドコ グリコリド））（ＰＬＣＧ）に由来するものである（エデルマン（Ｅｄｅｌｍａ ｎ），Ｒ．ら、１９９３年，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：１５５〜１５８；エルドリ ッジ（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ），Ｊ．Ｈ．ら、１９８９年，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ，１４６：５９〜６６；エルドリッジ，Ｊ． Ｈ．ら、１９９０年，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１１：２０ ５〜２１４；エルドリッジ，Ｊ．Ｈ．ら、１９８９年，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．Ｂｉｏｌ． ，２５１：１９１〜２０２；エルドリッジ，Ｊ．Ｈ．ら、１９９１ 年，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ，２８：２８７〜２９４；エルドリッジ，Ｊ．Ｈ．ら 、１９９１年，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：２９７８〜２９８６；マー クス（Ｍａｒｘ），Ｐ．Ａ．ら、１９９３年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１３２ ３〜１３２７；モルドビーヌ（Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ），Ｚ．ら、１９９３年，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． ，１６７：８４〜９０；オーハガン（Ｏ′Ｈａｇａ ｎ），Ｄ．Ｔ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：１４９〜１５４；オーハガン，Ｄ． Ｔ．ら、１９９１年，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７３：２３９〜２４２；レイ（Ｒ ａｙ），Ｒ．ら、１９９３年，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６７：７５２〜 ７５５；レイド（Ｒｅｉｄ），Ｒ．ら、１９９３年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ ５０ ：３２３Ａ；レイド，Ｒ．Ｈ．ら、１９９３年，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：１ ５９〜１６７）。抗原性物質のＰＬＣＧマイクロカプセル中への封入は多数の利 点を与える。第一に、マイクロカプセルは加水分解によって容易に分解されて乳 酸およびグリコール酸を生成する。第二に、５μｍ未満の大きさのＰＬＣＧマイ クロカプセルは、マウスの経口接種後に、パイアー斑、腸間膜リンパ節および脾 臓に容易に浸透する。第三に、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウ イルス、シミアン免疫不全ウイルス、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕ ｓ）エンテロトキシンＢトキソイドおよび卵アルブミンを含めたＰＬＣＧマイク ロカプセル封入抗原を用いるマウスの経口、腹腔内、鼻腔内または皮下接種は、 ウイルスまたはタンパク質不含の同一用量を接種された動物において引き起こさ れるよりも大きい免疫応答を引き起こす。更に、不活化ウイルスを用いるマウス の経口接種は、粘膜表面上での増大した抗原特異的ＩＧａ応答を引き起こす。最 後に、ＰＬＣＧマイクロカプセルは、成人被験者に対して副作用を伴うことなく 経口投与されてきた。 ＰＬＣＧマイクロカプセルの主な欠点は、有機溶媒の不可欠の使用である。有 機溶媒との接触は、ウイルスおよび細菌病原体の感染力を不活性化する傾向があ り、そして更に、体液性または細胞性免疫応答の誘導に臨界的な表面タンパク質 の免疫原性を変更することがある。実際に、ＰＬＣＧマイクロカプセルによって 抗原特異的免疫応答を引き起こすには、多量のウイルスタンパク質が必要とされ てきた。 米国特許第３，１３７，６３１号明細書は、加熱若しくは触媒適用または両方 による架橋合成樹脂による水不溶性有機液体の封入に関する。カプセルシェルは 、共有結合した非イオン材料からまたは熱変性性タンパク質から成形されると記 載されている。結果として得られたカプセルは、架橋剤による第二の処理から利 点を得て、カプセルに対して増加した安定性を与える。 米国特許第４，２０５，０６０号明細書は、ポリマー性イオン樹脂と薬剤との 反応によって生成される、酸性ポリマーと塩基性薬剤との反応によってかまたは 逆に、塩基性ポリマーと酸性薬剤との反応によって生成される水溶性塩を含むコ アを含むマイクロカプセルを開示している。マイクロカプセルの壁は、水不溶性 皮膜生成用ポリマーから生成される。適当な外装剤として定義される水不溶性皮 膜生成用ポリマーは全て、中性非イオン化ポリマーである。その発明のカプセル は、薬剤およびコアポリマーを反応させることによって生成された塩の水溶液を 製造し；水不溶性外装生成用ポリマーの第一水不混和性有機液体中溶液を製造し ；該水溶液を該有機溶液中に分散させ；そして外装生成用ポリマーにとって非溶 媒である第二水不混和性液体に対して該分散液を加えて、分散水性相の小滴のま わりに皮膜を沈降させることによって製造される。 米国特許第４，６０６，９４０号明細書は、封入材料を沈降させるコアセルベ ーションによるマイクロカプセルの製造を開示している。単コロイドを水中に分 散させ、そして水に対する親和性がコロイドよりも大きい化合物を加えることに よってコロイドの周辺から溶媒和の水を除去する。これは、コロイド鎖を互いに より接近させ且つコアセルベートを生成させる。温度変化は、コアセルベーショ ンによる封入を促進するのに必要である。 米国特許第３，９５９，４５７号明細書は、（ａ）有機多官能性ルイス塩基の （ｂ）低沸点極性有機溶媒中水不混和性溶液および（ｃ）部分親水性で部分親油 性の多官能性ルイス酸の水溶液の微細分散エマルジョン中で生成された反応生成 物を含んで成るマイクロカプセルを開示している。その発明のカプセルは、親油 性コアを有する。 米国特許第５，１３２，１１７号明細書は、カプセル状の異方性ルイス塩膜に よって取り囲まれた水性または実質的に水性のコアから成るマイクロカプセルを 開示している。これらの水性コアマイクロカプセルは、適当なルイス酸壁生成用 反応体およびコア材料の水溶液を適当な非水性溶媒中に分散させ、適当なルイス 塩基壁生成用反応体を含む追加の量の非水性溶媒を加え、そして界面反応によっ て生成されたマイクロカプセルを集めることによって製造される。或いは、その 特許の水性コアマイクロカプセルは、適当なルイス酸壁生成用反応体およびコア 材料の水溶液を、適当なルイス塩基壁生成用反応体を含む適当な非水性溶媒中に 分散させ、そして界面反応によって生成されたマイクロカプセルを集めることに よって製造してよい。 Ｆ．リム（Ｌｉｍ）は、ベルギー王国特許第８８２，４７６号明細書（１９８ ０）において、アルギン酸カルシウム微小球を最初に生成した後、それらを表面 処理してポリアルギン酸リシンまたはポリアルギン酸エチレンイミンコアセルベ ートに変換し、そして最後に、カルシウムキレート剤による処理によってコアを 液化する方法を記載している。 ラー（Ｒｈａ）およびロドリクス・サンチェス（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ−Ｓａｎ ｃｈｅｚ）は、米国特許第４，７４４，９３３号明細書（１９８８）において、 一方の電荷のポリマーを反対電荷のポリマーに対して直接的に噴霧することによ ってリムの手順を簡単にして、リムのものと同様の複合コアセルベートを生成し ている。 ドーツェンバーグ（Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ）らは、英国特許出願第２１３５ ９５４Ａ号明細書（１９８４）において、同様に、陰イオンポリマー溶液の２〜 ３ｍｍ小滴を数１０センチメートル落下させて反対電荷のポリ第四アンモニウム 塩溶液中に押し込むことによる複合コアセルベートマイクロカプセルの生成を記 載している。これらの他の方法のいずれにおいても、マイクロカプセルを有効に 製造するのに高粘度ポリマー溶液が必要とされることは明らかであり、いずれも 、２種類の反対電荷のポリマーを用いて複合コアセルベートを生成する。 イトー（Ｉｔｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：６６〜６８（１９９４）は、 経時共焦点レーザー顕微鏡写真を用いて、マイクロ範囲の比較的高いポリマー濃 度およびポリマー不含による他の範囲の発生によって、ポリアクリル酸ナトリウ ムなどの陰イオンポリマーのコロイド溶液が不均一に向かう傾向を実証した。 本発明は、米国特許第３，９５９，４５７号明細書および同第５，１３２，１ １７号明細書に関する上記のものと類似しているが、全ての水性系を用いるとい う点で異なるマイクロカプセル封入技術を提供する。本発明のマイクロカプセル は、多陰イオン高分子の十分に可溶性でない（アミン）塩の生成に基いている。 この処理は、極めて穏やかな条件下において一様な大きさの粒子を生じることが できる。 対照的に、既知の完全な水性系の多くは、単純コアセルベートまたは複合コア セルベートの生成に基き、広範囲の粒度のミクロビーズを提供する。Ｂ．Ｒ．マ シューズ（Ｍａｔｈｅｗｓ）およびＪ．Ｒ．ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）、走査型電 子顕微鏡によるゼラチンマイクロカプセルの表面特性、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌ． ２６：３８３〜３８４（１９７４）。若干の単純コアセルベート は、タンパク質性コアセルベートを沈降させるのに強酸性（例えば、ｐＨ３〜４ ）媒質を必要とする欠点を持っている。水溶液から沈降した複合コアセルベート は、少なくとも２種類の反対電荷のポリマーを必要とする。ヒドロキシエチルア クリレートに基くヒドロゲルの製造のための完全な水性系は、ペルオキシ種また は電離線によって触媒された遊離基重合を伴う。Ｊ．Ｄ．アンドレード（Ａｎｄ ｒａｄｅ）、Ｄ．ゴフ（Ｇｏｕｇｈ）、Ｂ．コルフ（Ｋｏｌｆｆ）、Ｗ．Ｊ．ク ニトモ（Ｋｕｎｉｔｏｍｏ）およびＲ．Ｖ．ウェイジノン（Ｗａｇｅｎｏｎ）、 直接輸血用被覆吸着剤：ＨＥＭＡ活性炭、Ｔｒａｎｓ，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ａｒ ｔｉｆ．Ｉｎｔ．Ｏｒｇａｎｓ １７：２２２〜２２８（１９７１）。このよう な触媒は、不安定なタンパク質分子または自然のままの生物に有害であるらしい 。水性アルギン酸およびカルシウムイオンから製造されたヒドロゲルは、微生物 および多細胞生物（例えば、線虫）両方を最後の放出のために埋め込み且つ生き たまま保存するのに十分に穏やかな処理で製造することができる。Ｆ．リムおよ びＡ．Ｍ．サン（Ｓｕｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：９０８〜９１０（１９８０ ）。更に、アルギン酸カルシウム系はその１種類のアルギン酸塩に限定されるら しく、本発明のアミン塩を提供することはないと考えられる。 多数の最近の論文は、免疫原性材料を封入するが非水性系に頼る他の手段を記 載している。Ｊ．Ｈ．エルドリッジら（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ 上記、Ｒ．エデルマンら（１９９３）、Ｖａｃｃｉｎｅ 上 記、並びにＲ．レディ（Ｒｅｄｄｙ）、Ｓ．ネア（Ｎａｉｒ）、Ｋ．バーンスタ ッド（Ｂｙｒｎｅｓｔａｄ）およびＢ．Ｔ．ルース（Ｒｏｕｓｅ）、ウイルス性 免疫の抗原デリバリーシステムとしてのリポソーム、Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：９１〜９６（１９９２）。免疫原性サブユニットワクチン成分は、ジクロロ メタンまたはクロロホルムなどの揮発性有機溶媒を用いる処理によってポリアク リレートおよびポリグリコリド／ラクチドビーズまたはリポソーム様小胞中に捕 捉されてきた。溶媒は、ポリマー溶液のエマルジョンまたは乾燥脂質皮膜を生成 するのに用いられる。ポリアクリレートおよびポリグリコリド／ラクチド処理は 、典型的に、本発明のまだ最適化されていない処理で見られる比較的高い（約５ ％）効率と比較して、極めて低い（約０．０１％）免疫原または抗原捕捉効率に よってミクロビーズを生じる。 したがって、活性物質、特に、免疫原性物質のマイクロカプセル封入に有効な システムに対する要求はまだ存在している。発明の概要 一つの態様により、本発明は、水性コアを有し且つ非水性混入物を実質的に含 まない安定なマイクロカプセルを提供する。該マイクロカプセルは、好都合に、 活性物質を含むことができる。更に、本発明は、このようなマイクロカプセルを 製造する高性能の方法を提供する。 本発明は、更に、試薬の完全な水性系を室温またはそれ未満において高圧を必 要とすることなく用いて材料を封入する手段を提供する。それゆえ、大部分の封 入システムにおいて従来用いられた有機溶媒、高温および／または高圧に対して 不安定である多数の物質または材料に対して用いられる。このような物質または 材料の中で最も注目すべきものは、天然に存在するまたは生物工学によって誘導 された酵素、タンパク質およびペプチド、例えば、グルコース６リン酸デヒドロ ゲナーゼ、カルシトニン、エリトロポエチン、ヘモグロビン、インスリン、イン ターロイキンまたはソマトトロピン；天然に存在する非タンパク質性高分子、例 えば、ヘパリン、ワクチン、並びに「裸の」デスオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およ びデスオキシリボ核酸構築物を含めたそのままののまたは免疫原性サブユニット に由来するおよび／または、放線菌、バチルス菌、球菌、真菌、蠕虫、幼虫、プ リオン（ｐｒｉｏｎｓ）、原生動物、リケッチア菌、スピロヘータ菌、ウイルス 、多細胞寄生生物および酵母を含めたそのままの若しくは弱毒化された生物また はそれらの免疫原性サブユニットに由来するワクチン成分；埃、ふけ、花粉、胞 子等に対する免疫感作またはアレルギー反応の弱化に用いられる寛容化された抗 原；並びに細胞、例えば、封入されていない場合に受容者生物に対して異物とし て認識され且つ望ましくない免疫学的攻撃を受けるかもしれない、損傷された、 機能不全のまたは失われた組織および／または器官の代用物として役立つように 内植された場合のヒトまたは他の種に由来する膵島細胞、肝細胞、インターロイ キン−および他のイムノモジュレーター分泌細胞である。 更に、本発明は、フルオロウラシルなどの極めて刺激性の薬物を封入した後、 このような薬物の毒性を低減させる、更には封入する、徐々に放出する、および 多数の薬物（抗炎症薬、例えば、プレドニゾロンおよびインドメタシン；抗体、 例えば、テトラサイクリン；または抗痙攣薬、例えば、テオフィリンで代表され る）の均一な治療的濃度を持続するのに十分に遅い速度で放出するための手段を 提供する。ブルーデキストランまたは木炭などの着色または不透明材料を封入す るのに用いる場合、システムは、生物活性物質、例えば、光に対して不安定であ るイヴェルメクチン（外部寄生生物撲滅薬）およびＢｔタンパク質（バチルス・ トゥリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）幼虫撲 滅性タンパク質）を光防護し且つこのような薬剤を徐々にかまたはトリガーバー ストで放出するのに用いることができる。蛍光標識されたマイクロカプセルを製 造し且つ用いて、封入された製剤をカラーコードし、識別し、そして検出および 位置決定を助けることができる。 もう一つの態様により、本発明は、ロタウイルス粒子、並びに大部分のカプセ ル封入システムにおいて従来用いられた有機溶媒、高温および／または高圧によ って典型的に不安定でありおよび／または変性される他のこのような薬剤のカプ セル封入を提供する。本発明によってカプセル封入されるロタウイルスとしては 、ロタウイルス感染に対して防御するワクチンとして特に有用であるロタウイル スの再構築株がある。 以下の説明から明らかになるように、本発明は、経口接種後に粘膜リンパ球集 団（例えば、パイアー斑）中への抗原の貫入並びに経口または非経口接種後の組 織中での抗原の持続を可能にする方法でのワクチンデリバリーを可能にする。図面の簡単な説明 添付の図１は、本発明のマイクロカプセル材料を製造する好ましい方法で用い られる装置の略側面図である。発明の詳細な説明 本発明のルイス塩壁で囲まれた水性コアのあるマイクロカプセルは、以下に記 載のように製造される。カプセル封入システムは、陰イオンポリマーまたはそれ らの水溶性塩の水溶液小滴と、低分子量陽イオンアミン反応体またはそれらの水 溶性塩の水溶液との本質的に瞬間的な反応を用いて、小滴およびそれらの内容物 のまわりに水不溶性皮膜を生成する。得られたマイクロカプセルのカプセル膜は イオン的に安定化された異方性ルイス塩膜である。 活性物質（例えば、薬物、ワクチンまたは有害生物駆除剤）の水性溶液または 懸濁液および所望ならばアジュバント（光防護剤、着色剤）を、適当な多陰イオ ン高分子（すなわち、ポリマー）の（例えば、ナトリウム塩）水溶液中に溶解さ せるかまたは懸濁させる。次に、得られた溶液／懸濁液を、適当な水溶性アミン の（例えば、塩酸塩）水溶液中に小滴として分散させる。ポリマー小滴およびア ミン溶液の明白な界面において塩交換反応が起こり、（アミンとポリマーとの間 で生成される）極めて可溶性に乏しい塩が生成され、それが沈降して、活性成分 が捕捉されている幾分球状のビーズまたはカプセルを生成する。包まれた活性成 分を含む得られたマイクロカプセル懸濁液を集める。 本発明によっ種々の活性物質をマイクロカプセルに封入することができるが、 本発明は、主として免疫原性物質、特に、ロタウイルスのマイクロカプル封入に 関して以下に記載されるであろう。例えば、一つの実施態様により、本発明は、 予防的免疫感作物質、すなわち、ワクチンとして有用な免疫原性物質の供給およ び／または免疫療法を可能にする。 本明細書中において用いられる「免疫原性組成物」という用語は、免疫原性ペ プチドおよび／またはタンパク質を含む混合物を含めた免疫原性ペプチドおよび タンパク質；自然のままの不活性な、弱毒化したおよび感染性のウイルス粒子； 自然のままの死滅した、弱毒化したおよび感染性の原核生物；任意の生活環段階 を含めた自然のままの死滅した、弱毒化したおよび感染性の原生動物；並びに自 然のままの死滅した、弱毒化したおよび感染性の多細胞病原体を包含する。若干 の実施態様において、エンベロープおよび無エンベロープウイルスによって代表 されるウイルス株を用いて、マイクロカプセル封入ワクチンを提供することがで きる。 免疫原性ペプチドおよびタンパク質としては、免疫応答が望まれる抗原上で示 されたエピトープと同一のまたは実質的に類似したエピトープを少なくとも含む ペプチドおよびタンパク質がある。若干の好ましい実施態様において、免疫原性 ペプチドおよびタンパク質は、免疫応答が望まれる病原体または細胞からの天然 に存在するペプチドおよびタンパク質と同一である。タンパク質は、病原体、例 えば、ウイルス、原核生物、原生動物病原体および多細胞寄生生物に由来しうる 。更に、他の免疫標的、例えば、腫瘍および自己免疫疾患に関係したタンパク質 もまた提供されうる。タンパク質は、天然源から精製されるかまたは組換えＤＮ Ａ技術を用いて生産される。好ましい実施態様において、免疫原性ペプチドおよ びタンパク質は、病原体タンパク質、例えば、ウイルスコートタンパク質、原核 生物外膜タンパク質または、病原体中和免疫応答が引き起こされうる他の抗原性 タンパク質である。このようなマイクロカプセル封入ペプチドおよびタンパク質 は、マイクロカプセル封入サブユニットワクチンである。 本明細書中で用いられる「実質的に類似したエピトープ」という用語は、ある タンパク質のエピトープと同一ではないが、それにもかかわらず、そのタンパク 質に対して交差反応する細胞性または体液性免疫応答を引き起こす構造を有する エピトープを指すことを意味する。 免疫原性ペプチドおよびタンパク質としては、このような成分を他の免疫原性 ペプチドおよびタンパク質並びに／または非免疫原性成分と共に含む混合物があ る。混合物は、他の成分を含む出発材料からの免疫原性ペプチドおよびタンパク 質の部分精製によって得ることもできる。 ウイルスワクチンは周知であり、不活性なまたは「死滅した」ウイルス粒子； 組換え的挿入、欠失若しくは挿入などによってまたは選択的継代技術によって感 染能力が中和されている弱毒化ウイルス粒子；免疫原性タンパク質をコードして いる遺伝子を供給し且つ発現させるために他の種に対してまたは組換え体ベクタ ーとして用いられる感染性ウイルスがある。若干の実施態様において、エンベロ ープおよび無エンベロープウイルスによって代表されるウイルス株を用いて、マ イクロカプセル封入ワクチンを提供することができる。 同様に、原核生物ワクチンは周知であり、死滅した生物；感染能力が中和され ている弱毒化生物；免疫原性タンパク質をコードしている遺伝子を供給し且つ発 現させるための組換え体ベクターを含む感染性生物がある。 組換え体ベクターの場合、ベクター中に挿入された遺伝子によってコードされ たタンパク質は免疫標的である。免疫標的の例としては、限定されないが、病原 体タンパク質、例えば、ウイルス、原核生物、原生動物病原体および多細胞寄生 生物からのタンパク質または腫瘍および自己免疫疾患に関係したタンパク質があ る。 自然のままの死滅したまたは弱毒化された原生動物生物を用いる原生動物病原 体に対するワクチンは、概して、ワクチン接種された生物が通常は宿主である生 活段階にある生物を用いて、適切な免疫標的が示されることを確実にする。 免疫原性タンパク質の生産用ベクターの供給に加えて、マイクロカプセル封入 ベクターはまた、非免疫原性タンパク質をコードする治療的遺伝子を該ベクター が運ぶ遺伝子療法用途において提供されることもありうると考えられる。そのよ うなベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクター、例えば、組換えレ トロウイルスおよび組換えアデノウイルスがある。 もう一つの実施態様により、本発明は、予防的免疫感作物質、すなわち、ロタ ウイルスワクチンとして供給するのに有用なマイクロカプセル封入ロタウイルス エを提供する。 ロタウイルスワクチンは周知であり、ウシＷＣ３（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２ １０２）；ＨＣＲ３ａ（１９９１年５月１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＶＲ −２３２５）；ヒトｖｐ Ｗ１７９によって修飾されたウシＷＣ３；ヒトＷ１７ ８−８によって修飾されたウシＷＣ３；ヒトＷ１７９−９によって（１９８７年 １１月２５日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２１９４およびＶＲ−２１９ ６）またはＳＣ２−９によって（１９９３年７月８日に寄託されたＡＴＣＣ受託 番号ＶＲ−２４１７）修飾されたウシＷＣ３；ヒトＷ１７９−９によって（１９ ９３年７月８日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２４１５）およびＷ１７９ −４によって（１９９２年６月１９日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２３ ７７）修飾されたウシＷＣ３；ヒトｖｐ４ ＤＳ１によって修飾されたウシＷＣ ３（１９９３年７月８日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２４１６）；ヒト ブリコート（Ｂｒｉｃｏｕｔ）Ｂ−９によって修飾されたウシＷＣ３；ヒトｖｐ ４ブリコートＡによって修飾されたウシＷＣ３；ヒトＷ１７９−９によって修飾 されたＨＣＲ３ａ（１９９１年５月１日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２ ３２４）；アカゲザルロタウイルスＲＲＶ；ヒトＷａ−９によって修飾されたＲ ＲＶ；ヒトＤＳ１−９によって修飾されたＲＲＶ；ヒトＰ−９によって修飾され たＲＲＶ；およびヒトＳＴ３−９によって修飾されたＲＲＶがある。 本発明によって有用なロタウイルス株としては、それぞれが本明細書中に援用 される１９８７年１月１３日発行の米国特許第４，６３６，３８５号明細書；１ ９８７年１１月３０日出願の米国特許出願第０７／１２６，４７７号明細書；１ ９９０年７月２６日出願の米国特許出願第０７／５８８，８８４号明細書；１９ ９１年５月１日出願の米国特許出願第０７／６９４，９６８号明細書；および１ ９９２年６月２２日出願の米国特許出願第０７／９０２，３２１号明細書に記載 されたものがある。 免疫原性組成物の水性溶液または懸濁液を、適当な多陰イオン高分子（すなわ ち、ポリマー）の（例えば、ナトリウム塩）水溶液中に溶解させるかまたは懸濁 させる。次に、得られた溶液／懸濁液を、適当な水溶性アミンの（例えば、塩酸 塩）水溶液中に小滴として分散させる。ポリマー小滴およびアミン溶液の見掛け の界面において塩交換反応が起こり、（アミンとポリマーとの間で生成される） 極めて可溶性に乏しい塩が生成され、それが沈降して、免疫原性組成物が捕捉さ れている幾分球状のビーズまたはカプセルを生成する。包まれた免疫原性組成物 を含む得られたマイクロカプセル懸濁液を集める。 陰イオンポリマーおよび反応体アミンは互いに反応した時、可溶性に乏しい沈 降物を速やかに生成し、そして小滴を包み、その前に小滴中のポリマーが拡散し すぎて小滴の形状をかなり歪めたりまたは皮膜を生成するのに必要とされる濃度 より低いポリマー性反応体濃度に低下したりしないものの群より選択される。し たがって、高粘度のポリマー溶液を用いる必要はないが、アミンは、ポリマー小 滴によって画成された偽相境界まで速やかに拡散し且つそこで反応することがで きる必要がある。ポリマー溶液の粘度は、２．５〜１０センチポアズ程度に低く てよい。 ポリマー溶液小滴（免疫原性組成物のポリマー溶液中溶液または懸濁液を含む ）をアミン溶液中に分散させる好都合な手段は、ポリマー溶液のエーロゾルを、 それを撹拌しながらアミン溶液上に／中に落下させることである。エーロゾルを 生じるためのベルヌーイ（Ｂｅｒｎｏｕｌｉ）型ネブライザの使用は、（変動係 数が約１０〜２０％の）平均付近の粒度分布が比較的広い（ガウス）マイクロカ プセルを生じる。より狭い粒度分布が望まれる場合、本明細書中に記載の音響に よって振動される小滴発生器を用いて、（直径の変動係数が約５％の）極めて均 一なマイクロカプセルを提供することができる。 多くの場合、酸に不安定な免疫原性組成物が経口投与される場合のように、マ イクロカプセルを腸溶材料によって被覆して、それらを胃酸から保護するのが望 ましいことがありうる。適当な腸溶コーティング材料としては、酢酸フタル酸セ ルロースおよびポリオキシエチレン架橋ポリメタクリル酸がある。小粒子、錠剤 およびカプセル剤に腸溶コーティングを与える技法は、製薬産業技術分野におい て周知である。 全くの水溶液からマイクロカプセルを製造する場合に用いられる反応体は、多 数の市販元から入手可能であるが、いずれも、フィッシャー・サイエンティフィ ック・カンパニー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）、 Ｆ．Ｍ．Ｃ．コーポレーション（Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ラガー・ケミカル ・カンパニー（Ｒｕｇｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、シグマ・ケ ミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）および ／またはザ・アップジョン・カンパニー（Ｔｈｅ Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎ ｙ）から購入された。 封入材料の速やかな放出は、マイクロカプセルの水性懸濁液に対して水溶性塩 を固体としてかまたは該塩溶液として加えることによって達成される。どちらの 場合にも、用いられる塩は、皮膜生成反応の逆行と同様に、不溶性皮膜と反応し て水溶性イオン生成物を生じることができなければならない。皮膜生成反応が可 逆反応であるということは明らかである。可溶性小分子の遅い放出は、マイクロ カプセル壁を介するそれらの徐々の拡散によって実現される。拡散速度は、拡散 する種の大きさおよび可溶性並びにカプセル壁の厚みおよび密度に依る。したが って、望まれた時に速やかに放出させることに加えて、封入処理は、可溶性封入 材料の徐放が調節されるように行うことができる。 封入用試薬として有用であることが分かった陰イオンポリマーすなわち高分子 は、アルギン酸；フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンイソチオ シアネートなどの発蛍光団に対して結合したアルギン酸；アラビン酸；硫酸セル ロース；カルボキシメチルセルロース；カラゲナン；コンドロイチン硫酸；ヘパ リン；ポリアクリル酸；ポリオキシエチレン架橋ポリアクリル酸（例えば、ロー ム・ファルマ（Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ）製のユードラジット（Ｅｕｄｒａｇｉ ｔ）Ｌ−１００^R）；およびポリビニルカルボン酸（例えば、カルボポル（Ｃａ ｒｂｏｐｏｌ）９３４^R）から成る反応性カルボン酸基または硫酸基を有する水 溶性ポリマーの群より得られる。若干の好ましい実施態様において、陰イオンポ リマーは、それぞれがナトリウム塩として与えられているアルギン酸（フィッシ ャー・サイエンティフィック・カンパニー、フェアローン、ＮＪ）、ポリアクリ ル酸（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ Ｃｏ．）、セント・ルイス、ＭＯ）、硫酸セルロース（アルドリッチ・ケミ カル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）、カルボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ） 米国薬局方（カルボポル９３４^R、Ｂ．Ｆ．グッドリッチ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ） 、クリーヴランド、ＯＨ）、カルボキシメチルセルロース米国薬局方（中程度の 粘度、ラガー・ケミカル・カンパニー・インコーポレーテッド、アービントン、 ＮＪ）、ヘパリン米国薬局方（ザ・アップジョン・カンパニー、カラマズー、Ｍ Ｉ）およびアラビン酸（本明細書中に援用されている米国特許第２，６６６，７ ５９号明細書に記載の方法にしたがって単離された）から成る群より選択される 。若 干の好ましい実施態様において、陰イオンポリマーは、アルギン酸ナトリウムと して与えられるアルギン酸である。 本発明にしたがってマイクロカプセルを製造する場合に有用な陽イオン反応体 は、アルギニン、デシルアミン、ドデシルアミン、エチレンジアミン、ピペラジ ン、メチレンブルー、オクタデシルアミン、トリエチルアミン、トリエチルテト ラミンおよびスペルミンを含むモノ−、ジ−、トリ−およびテトラアミノ化合物 の群より得られる。概して、陰イオンポリマーは、アルカリ金属イオン（例えば 、ナトリウム）を有するそれらの中性塩として用いられ、そして塩基性反応体は それらの塩化物または酢酸塩の形で用いられることが好ましい。若干の好ましい 実施態様において、アミンは塩酸塩として与えられる。若干の好ましい実施態様 において、アミンは、それぞれが塩酸塩として与えられているアルギニン（シグ マ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）、ピペラジン（シグマ・ケ ミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）、エチレンジアミン（アルドリッ チ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）、トリエチルアミン（アル ドリッチ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）、トリエチレンテト ラアミン（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）、メ チレンブルー（フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー、フェアロー ン、ＮＪ）およびスペルミン、並びに酢酸塩として与えられているオクタデシル アミン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）から成る群よ り選択される。若干の好ましい実施態様において、アミンは、スペルミン塩酸塩 として与えられるスペルミンである。 これまでの試験に基いて、本発明によって封入することができる材料には、そ れぞれ以下、すなわち、ブルーデキストラン、木炭、フルオロウラシル、インド メタシン、ニコチンアミド、フェノールレッド、プレドニゾロン、テトラサイク リン、テオフィリン、バチルス・トゥリンギエンシス（Ｂｔ）亜種イスラエレン シス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の幼虫撲滅性タンパク質、並びにエンベロープ および無エンベロープウイルスワクシニアによって代表されるウイルス株および ロタウイルスがある。 捕捉される免疫原性組成物と一緒にマイクロカプセルを生成する前に、陰イオ ンポリマーおよびアミンを個々に試験して、免疫原性組成物の免疫原性に対する それらの作用を確認する。 陰イオンポリマーおよびアミンの感染力および免疫原性に対する作用を確認す るために、当業者は、容易に入手可能な出発材料を用いて日常検定を行うことが できる。例えば、ある選択されたペプチドまたはタンパク質が種々の濃度の評価 される成分の存在下および不存在下で免疫応答を引き起こす能力を確認して、該 成分が該分子の免疫原性に対して有する作用を確認することができる。同様に、 ある選択された感染性物質が細胞または動物に感染する能力を、種々の濃度の評 価される成分の存在下および不存在下において検査して、該成分が感染力に対し て有する作用を確認することができる。ロタウイルスの場合、ロタウイルス原液 を、陰イオンポリマーの水性ナトリウム塩若しくはアミンの水性塩または食塩水 などの対照と混合することができる。ロタウイルス感染力に対する成分の作用は 、標準的なプラーク検定によって確認される。 若干の実施態様において、マイクロカプセル封入ワクチンは経口投与された場 合に有効であることが好ましいので、免疫原性組成物を失活させない陰イオンポ リマーおよびアミンを組合せて試験して、模造胃酸中での分解に耐えるマイクロ カプセルを生成するそれらの能力を確認する。 陰イオンポリマーの水性ナトリウム塩、好ましくは１ｍｌを、水性アミン塩酸 塩（または酢酸塩）、好ましくは１ｍｌに対して滴加して、界面沈降物を生成す る能力を確認する。固形物を生じる組合せを用いて、マイクロカプセルを製造す る。マイクロカプセルは、本明細書中に援用される米国特許第４，７４４，９３ ３号明細書においてアルギン酸カルシウムマイクロカプセルの製造について記載 されたのと同様に、陰イオンポリマーのナトリウム塩を約５μｍの大きさの小滴 としてアミン塩水溶液中に分散させることによって生成される。マイクロカプセ ルの短期安定性は、水溶液中において室温で５日間の観察によって調べられる。 室温で安定なマイクロカプセルは、模造胃酸（ｐＨ１．２）によって３７℃で２ 時間処理される。 次に、免疫原性組成物を失活させない且つ安定なマイクロカプセルを提供する 陰イオンポリマーおよびアミンの組合せを用いて、マイクロカプセル封入ワクチ ンを生成する。最初に、免疫原性組成物を陰イオンポリマーと混合する。次に、 ポリマー／ウイルス混合物を小滴としてアミン中に分散させる。 本発明によって封入することができるヒトおよび家畜用ワクチンおよびロタウ イルス株の更に別の例を以下に挙げる。 １． ヒト用ワクチン ジフテリアトキソイド 百日咳トキソイド 破傷風トキソイド Ｂ型肝炎表面抗原 呼吸シンシチアルウイルス アデノウイルス パラインフルエンザウイルス カナレイポックス（Ｃａｎａｒａｙｐｏｘ）組換え体 Ａ型肝炎ウイルス インフルエンザウイルス、生または不活化 黄熱病ウイルス 生弱毒化ポリオウイルス 狂犬病ウイルス 不活化ポリオウイルス コレラ インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂ型 ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（プラーク） 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）（腸チフス） 麻疹 ＢＣＧ おたふくかぜ 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） 風疹 水痘 ロタウイルス ヒト免疫不全ウイルス 単純ヘルペスウイルス サイトメガロウイルス ２． 家畜用ワクチン ウシ ウシの伝染性鼻気管炎 パラインフルエンザ３型 ウシ下痢症ウイルス ウシの呼吸シンシチアルウイルス ロタウイルス コロナウイルス 狂犬病 ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）／パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅ ｌｌａ）種 レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）種 破傷風トキソイド イヌ イヌのジステンパー／麻疹 イヌの肝炎 パルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ） コロナウイルス 狂犬病 ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ） レプトスピラ属 ネコ ネコの鼻気管炎ウイルス ネコカリチウイルス 汎白血球減少症ウイルス ネコの白血病ウイルス ネコの伝染性腹膜炎ウイルス 狂犬病 ブタ 伝染性胃腸炎 ロタウイルス パルボウイルス属 仮性狂犬病 パスツレラ属 丹毒 レプトスピラ属種 ヘモフィルス属種 ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ） 破傷風トキソイド ウマ ウマの脳脊髄炎 ウマインフルエンザ ウマの鼻肺炎 破傷風トキソイド 狂犬病 ３． ロタウイルス株 ウシＷＣ３ ＨＣＲ３ａ ヒトｖｐ Ｗ１７９によって修飾されたウシＷＣ３ ヒトＷ１７８−８によって修飾されたウシＷＣ３ ヒトＷ１７９−９またはＳＣ２−９によって修飾されたウシＷＣ３ ヒトＷ１７９−９および−４によって修飾されたウシＷＣ３ ヒトｖｐ４ ＤＳ１によって修飾されたウシＷＣ３ ヒトブリコートＢ−９によって修飾されたウシＷＣ３ ヒトｖｐ４ブリコートＡによって修飾されたウシＷＣ３ ヒトＷ１７９−９によって修飾されたＨＣＲ３ａ アカゲザルロタウイルスＲＲＶ ヒトＷａ−９によって修飾されたＲＲＶ ヒトＤＳ１−９によって修飾されたＲＲＶ ヒトＰ−９によって修飾されたＲＲＶ ヒトＳＴ３−９によって修飾されたＲＲＶ ＶＶＵＫｖｐ７と同定されたワクシニアウイルス株と、ＷＣ３およびＲＲＶと 同定された二つのロタウイルス株の２種類のウイルスはうまく捕捉され、持続さ れた後、本発明のマイクロカプセルから放出された。これら２種類のウイルスは 、エンベロープおよび無エンベロープの二つの主要なウイルスの種類である。無 エンベロープウイルス、例えば、ロタウイルス、ポリオウイルス、アデノウイル スは、乾燥剤、洗剤および表面洗浄剤に対して、エンベロープウイルスよりもは るかに感受性が少ない。その結果、エンベロープ以外の無エンベロープウイルス は、下水中および周囲表面上で十分に生存している。エンベロープウイルスは、 それらの表面脂質二重層のために無エンベロープウイルスほど活発ではなく、し かも上記に挙げられた薬剤との接触によって分解されやすい。ワクシニアウイル スは、免疫原性ペプチドおよびタンパク質をコードしているＤＮＡが比較的容易 に挿入されうる組換え体ベクターとしてのその使用のために、封入候補として選 択された。ロタウイルス株は、ロタウイルスがヒトおよび他の幼児において重症 な、そして時々致死的な下痢を引き起こすことが知られているので試みに選択さ れた。 本発明によるマイクロカプセルは、選択可能な中央値粒度での極めて狭い粒度 分布のマイクロカプセルの製造を可能にする本明細書中に記載の装置によって製 造することができる。これは、腸関与リンパ組織（その部分をしばしばパイアー 斑と称する）または呼吸器系の気管支関与リンパ組織を介して注入するためのま たは摂取するためのマイクロカプセルを製造する場合に重要である。静脈内注入 するためのマイクロカプセルは、必然的に、毛細血管床を通過するのに十分に小 さい直径約５ミクロン未満でなければならない。吸入による投与用には、粒子は 約５ミクロン未満の呼吸に適した粒度範囲になければならないし且つ深く肺胞部 位に達するためには、粒子は２ミクロン未満の粒度範囲にあるのが好ましい。パ イアー斑の組織は、取り込む粒子の大きさが極めて特徴的であり、それらは１０ ミクロン、好ましくは約５ミクロン未満の大きさの粒子のみを取り込み且つ選択 する。この装置は、５ミクロンの平均体積直径に近い範囲の０．２５ミクロン未 満の平均からの標準偏差によって、様々な大きさのマイクロカプセル集団を製造 することができる。 本発明のワクチンは、例えば、眼内、鼻腔内、頬、口、吸入、直腸、皮下、筋 肉内、動脈内、静脈内および腹腔内を含めた様々な経路によって投与することが できる。本発明のワクチンは、非経口によって供給することができる。このよう なワクチンの実施例は、カプセル封入されていないウイルスと比較して、実験マ ウスの免疫原性を数百倍〜数千倍に増加させることが分かっている。システムは 、精製ウイルスおよびウイルス組織培養懸濁液両方と共に十分に作用するので、 面倒な且つ費用がかかるウイルス粒子の分離は必要とされない。 マイクロカプセル生成反応： 本発明により、２種類の反応の内の一つを用いて、水性媒質中でマイクロカプ セルを生成することができる。これらは、酸−塩基反応および塩交換反応である 。 酸−塩基反応： いくつかの水溶性酸性ポリマーは、水溶液中において低分子量水溶性モノ−ま たはオリゴ−アミンと反応して、沈降しうる水溶性に乏しい塩を生成するであろ う。この反応で沈降する水溶性酸性ポリマーの群としては、アラビン酸、硫酸セ ルロース、コンドロイチン硫酸、ヘパリンおよび上記酸性ポリマーの蛍光誘導体 がある。この反応で水溶性に乏しい塩を生じるアミンの群としては、デシルアミ ン、ドデシルアミン、エチレンジアミン、ヘキサデシルアミン、メチレンブルー 、オクタデシルアミン、ピペラジン、スペルミン、テトラデシルアミン、トリエ チルアミンおよびトリエチレンテトラミンがある。 塩交換反応： 上記の酸性ポリマーまたはある種の比較的水溶性に乏しい酸性ポリマーをそれ らのそれぞれの中性塩（例えば、ナトリウムまたはアンモニウムイオンとの）溶 液として用い且つ上記のアミンをそれらの水溶性塩（例えば、塩酸塩、酢酸塩） として溶解させる場合、水溶性に乏しい塩の生成を伴って同様の反応が起こる。 この反応は、生成物の一つ（例えば、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム）が 可溶性であり且つアミン−ポリマー塩が可溶性に乏しい塩交換反応と考えること ができる。塩交換反応において水溶性塩として有用な酸性ポリマーの群としては 、上記に挙げられたポリマー、そして更に、ナトリウム塩または水溶性塩の形の 以下の酸性ポリマー、すなわち、アルギン酸および蛍光誘導体、例えば、フルオ レセインイソチオシアネートおよびローダミンイソチオシアネート、アルギン酸 および他の酸の誘導体、カルボキシメチルセルロース、ユードラジットＬ−１０ ０^R（ポリオキシエチレン架橋ポリアクリル酸）、ポリアクリル酸、ポリビニル アクリル酸およびこれらのポリマーの蛍光誘導体がある。酸性ポリマーのこの多 数の群は、塩交換反応においていずれもそれらのナトリウム塩または他の水溶性 塩として、塩酸塩または酢酸塩の形のアミンの群のメンバーの少なくとも一つと 反応して、水溶性に乏しいアミン−ポリマー塩を生成する。しかしながら、可溶 性に乏しい塩を生成する組合せ全部が本発明によるマイクロカプセルを生成する のではない。以下に記載の試験を参照し且つ以下の表１および２を比較されたい 。 本明細書中で用いられる「陰イオンポリマー」、「ポリマー鎖」および「陰イ オンポリマー溶液」という用語は、アミン−ポリマー塩を生成する場合に沈降す るポリマーを指す意味である。同時に生成された交換反応の水溶性生成物（例え ば、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム）に対する論及は、これらの水溶性生 成物を指し示す特別な要求がなければ、本明細書中では特に論及しない。 したがって、本発明によってマイクロカプセル生成物質として用いることがで きる陰イオンポリマーの群は、カルボン酸酸性官能基を有する（アルギン酸、ア ラビン酸、カルボキシメチルセルロース、ユードラジットＬ−１００、ポリアク リル酸およびポリビニルカルボン酸）、硫酸酸性基を有する（カラゲナン、硫酸 セルロース、コンドロイチン硫酸、ヘパリン）、直鎖状または分岐状ポリアルキ レン主鎖を有する（ポリアクリル酸、ポリビニルカルボン酸）、直鎖状炭水化物 主鎖を有する（アルギン酸、硫酸セルロース、コンドロイチン硫酸、ヘパリン） 並びに分岐状炭水化物主鎖を有する（アラビン酸）ポリマー性物質から成る。 本発明のマイクロカプセルにおいて、陰イオンポリマーは、マイクロカプセル 壁の主要な構造成分を構成している。典型的に、ポリマーは、最も近隣の陰イオ ン基間に望ましい範囲の間隔を与えるように選択される。例えば、ポリマーのθ 温度を越えるそれらの広げられた形において、陰イオン間距離は、ポリアクリル 酸で２メチレン基の相当量に近く、アルギン酸、硫酸セルロース、コンドロイチ ン硫酸およびヘパリンで６、カルボキシメチルセルロースで１０、そして高度に 分岐状のアラビン酸で２０〜３０メチレン基の相当量に近い。これは、種々の多 孔度を有するカプセル壁を選択的に生成することを可能にする。Ｔ．Ｊ．スピー カー（Ｓｐｅａｋｅｒ）およびＬ．レスコ（Ｌｅｓｋｏ）、米国特許第３，９５ ９，４５７号明細書、微粒状材料および該材料の製造法、１９７６年５月２５日 、第５節第６〜２０行を参照されたい。 本発明において用いられる陰イオンポリマーはいずれも、１０ｋＤを越える十 分な平均分子量を有するので、それらは多価であり且つ広範囲の化学量論でアミ ンと反応することができる。実際に、陰イオンポリマー反復単位に対するアミン の化学量論の好ましい範囲は約０．２〜約０．６であることが分かった。言い換 えると、ポリマー上の各１０個の陰イオン基と組合せてポリマーの塩を生成する のに約２〜６個のアミン分子が利用可能である。更に、いくつかのアミンは多価 でもあるので、理論上、反応性種は複雑な網状構造を生成することがあり、そこ においてアミンは陰イオンポリマー鎖を架橋するのに役立つ。陰イオンポリマー およびアミンの溶液を一緒に撹拌した場合にほとんど瞬間的に生成する沈降物は 、非晶質、凝集性、接着性、そしてしばしば糸状になりがちである。しかしなが ら、陰イオンポリマーおよびアミンの全組合せが、可溶性に乏しいアミン−ポリ マー塩を生成するのではない。以下の表１に、これまでに試験された反応性種の 二つの群を記載し、そしてこれらの組合せが反応した場合、出願人が沈降物の生 成に成功した組合せを示す。陰イオンポリマーおよびアミンは、アミンおよびポ リマー反復単位の近似当量（括弧内に示された）の増加順に挙げられている。 陰イオンポリマーおよびアミンの組合せの大部分は反応して水溶性に乏しいア ミンポリマー塩を生成するが、少なくともこれまでに試験された条件下において この組合せの内の少数の組合せがマイクロカプセルを生成することができるらし い。したがって、水不溶性アミンポリマー塩を生成する単純な能力それ自体は、 少なくともこれまでに試験された条件下において、マイクロカプセル壁生成成分 を決定的に識別させるものではない。 ある選択されたアミン／ポリマー対がカプセルおよびマイクロカプセルを生成 するかどうかを確認するためには、以下の手順が有用である。アミンおよびポリ マーの別々の水溶液を、酸型のポリマー約１％ｗ／ｖおよびほぼ化学量論的に等 量のアミンを等容量の水中に含むように調製する。或いは、ポリマーおよびアミ ンがこのような程度まで可溶性でない場合、アミンの水溶性塩（例えば、塩酸塩 または酢酸塩）およびポリマーの水溶性塩（例えば、ナトリウムまたはアンモニ ウム）の別々の溶液を調製する。約５ミリリットル容量のアミン溶液に対して、 ２０〜２５マイクロリットル容量のポリマー溶液を連続的に加え、ポリマー溶液 は約１センチメートルの高さから１滴ずつ加えられる。二つの溶液を、一方をも う一方に加えながら目視によって観察する。ポリマー溶液の小滴がアミン溶液に 溶け込んで系が均一になるかどうか、またはポリマー溶液小滴のまわりに薄膜が 生成し、そしてそれらが物理的に別個の且つ機械的に分離した材料として保持さ れるかどうかに注目する。 加えられた小滴がこのような薄膜を生成し、しかもアミン溶液と混合されて均 一溶液を生成することがない場合、反応体対はマイクロカプセルを製造するのに 用いることができると考えられる。この可能性を更に厳密に調べるために、一定 範囲の濃度にわたって調製されたポリマー小滴およびアミン溶液を用いる実験を 繰り返して、最適反応体濃度を確定する必要がある。 アミンかまたは酸型のポリマーが、上記の試験を実施するのに十分に可溶性で はない場合、それらの代わりに塩の形の反応体対を互いに用いてよい。 表２は、アミンポリマー塩がこれまでに試験された条件において安定なマイク ロカプセルを有効に生成したものを示す。 安定なマイクロカプセル形状を生成するアミンおよびポリマーの水溶液組合せ の能力は、第一に、反応体が混合されて可溶性に乏しい塩を生成することができ るように、それらが水溶性であり且つ反対に荷電していることが必要である。重 要なことに、溶液中の陰イオンポリマー鎖は、アミン分子（イオン）の拡散する 能力と比較して速やかに拡散する必要はない。更に、陰イオンポリマー溶液の小 滴は、ポリマー小滴が広範囲にわたって歪められたりまたは大量のアミン溶液と 極めて速く混合された状態にならないようにアミン溶液中に導入されるのが好ま しい。これらのいくつかの必要条件は比較的容易に満たされる。これらの必要条 件の根拠は、以下に更に詳細に記載された処理の操作によって理解されうる。 マイクロカプセル製造法の開始時に、陰イオンポリマー水溶液およびアミン水 溶液は機械的に（すなわち、物理的に）分離した相である。室温において、陰イ オンポリマー溶液の水分子は、高い（０．９＋）熱力学的活性係数を有し（水の 寄与分を除く）、且つポリマー分子よりもはるかに速く拡散すると予想される。 ポリマー鎖（１０ｋＤ、１００，０００ａｍｕを越える分子量）はコロイド様の 大きさを有し、しかも他のコロイド粒子と同様に挙動すると予想されうる。特に 、陰イオンポリマーのコロイド溶液は、微小領域の比較的高いコロイドポリマー 濃度および他の領域のポリマーの空隙の発生によって構造的に不均一に向かうで あろうと予想される。コロイドポリマーのこの挙動は、最近、イトーら（１９９ ４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６６〜６８により、経時共焦点レーザー顕微鏡写 真によって示された。顕微鏡写真は、不均一に向かうこのような傾向およ空隙構 造を示している。イトーらは、この挙動を、本発明において用いられたようなイ オンポリマー（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム）によって論及している。対 照的に、アミン反応体（分子量４００未満）は陰イオンポリマー鎖よりも熱力学 的にはるかに活性であり、ポリマー鎖よりもはるかに速く拡散し（水分子よりも 遅いが）、そしてそれらの溶液中に均一に分布していると考えられる。 陰イオンポリマー溶液の小滴を多量のアミン溶液中に導入する場合、それまで 分離していた水性相がほとんど瞬間的に混合して、それまで分離していた水性成 分の相境界が見分けられない単一連続水性相を生成すると予想される。一方、陰 イオンポリマーの低い拡散係数（典型的に、１０ｋＤに近い質量範囲のコロイド ポリマーに対して７ｘ１０^-7ｃｍ²／秒未満）は、ポリマー分子がそれらの最初 の位置から移動するのを残りのポリマー溶液小滴に相対して制限し、そして水分 子とほとんど同程度に速く移動する多数のアミン分子（イオン）がポリマーに接 近して静電気的に引き付けられ、そしてポリマーの陰イオン基と塩を生成するた めの時間を与える。したがって、多数のアミン単位との反応中のポリマー分子の 相対的不動性は、ポリマー鎖のほぼ最初の位置における且つ小滴の形状を保持す るシェルの沈降を可能にする。 小滴のまわりのこのシェルの発生は、１％ｗ／ｖカルボキシメチルセルロース ナトリウム水溶液の約２０マイクロリットルのほぼ球状の小滴を、デシルアミン 塩酸塩の約１％ｗ／ｖ水溶液に対して注意深く加えることによって肉眼で容易に 観察することができる。僅か１秒以内に、加えられた小滴のまわりにかろうじて 見分けられる球状薄膜が生成し、そして更に数秒間で、薄膜はますます厚くなり 且つ更に乳白光を発するようになる。得られたマイクロカプセルは、パスツール ピペットによって回収するかまたは微細ネット上に集めることができる。このよ うなポリマー小滴が数センチメートルの高さからアミン溶液に対して送られる場 合、小滴が歪められて回転楕円面または両凹ディスク様構造を生成し、それが同 じく徐々に更に厚く且つ乳白光を発するシェルになるかもしれないということは 極めてありうることであることに注目すべきである。アミン溶液を撹拌するかま たは急速に注いだ場合、加えられた小滴は、長球または糸状粒子を生成しがちで あり、これらも同様に厚くなる。ポリマー溶液の小滴がより小さい場合、それら はより高い高さからアミン溶液上若しくは中に、または流動アミン溶液上／中に 歪みを生じることなく分散することができる。実際には、直径約５〜７ミクロン の小滴を、約１センチメートル／秒の線速度で流れるアミン溶液表面から５セン チメートルの高さから加えてよく、それでもなおほとんど球状のマイクロカプセ ルを生じる。 ポリマー小滴を取り囲む薄膜が生成し且つ厚くなって、マイクロカプセルがで きる方法を拡散過程のみによって記載するにはおそらく簡単過ぎるが、このよう な説明は、何が起こったかのかなり正確な意味を伝えている。更に詳細な理解は 、液−液界面を越えるイオン輸送の機序および力学の説明によって導かれうる。 Ｉ．ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１５５８〜 １５６０，１９９３年）は、時間平均的には水−ジクロロエタン界面は「分子的 に鋭敏」であるが、短時間にわたってみると、熱変動が一方の液相と他方との毛 管指状構造組合せの生成をもたらすことを示した。これらの毛管「指」は、相が 大部分明確に分離していたとしても、一方の相からもう一方へのイオン輸送を可 能にする。水性相のアミン含有部分のポリマー含有水性相中への同様の毛管侵入 は、同様に、アミンポリマー塩のイオンが相互作用して、ポリマー小滴の保全性 を大きく妨げることなく皮膜すなわち薄膜を生じる機序を与えるかもしれないと 考えられる。 実際上、分離したマイクロカプセルを生成する反応体溶液の能力は、少なくと も一部分は、水性媒質中でのポリマー鎖の相対的不動性およびアミン分子（イオ ン）の相対的にはるかに大きい移動度、そしておそらくもう一部分は、アミンお よびポリマー溶液間の見掛けの界面境界の短時間の熱による変動に依る。それは 、高粘性溶液を必要としないが、むしろ、一方の種が遅く拡散する反応体である ことを必要とする。マイクロカプセル生成機序についてのこの解釈は、他の完全 に水性の封入系において示されたマイクロカプセル生成上の束縛とは全く相反す る。 アミンポリマー塩沈降物の生成をもたらす反応は単純な塩交換であると理解さ れうるし、それゆえ、可逆反応の特性を有する。これがそのようにあることは、 反応で生成された過剰の可溶性塩またはその濃厚溶液（例えば、塩化ナトリウム または酢酸ナトリウム）をマイクロカプセル懸濁液に対して加えることによって 実証できる。マイクロカプセル集団を取り囲む水性媒質中の塩化ナトリウム濃度 を約４％ｗ／ｖまで上昇させることは、概して、それらの急速な溶解を引き起こ す。しかしながら、塩化ナトリウムまたは別の、可溶性ポリマーおよびアミン塩 を生成することができる電解質（例えば、４％ｗ／ｖ溶液を生成するリン酸ナト リウム）による処理は、極めて可溶性に乏しいアミン（例えば、ヘキサデシルア ミン、オクタデシルアミン）によって生成されたマイクロカプセルを完全に破壊 しないかもしれないし、そしてこのようなマイクロカプセルを、例えば、分析目 的のために破壊するためには、アミンの水性濃度を減少させることができる溶媒 （例えば、シクロヘキサン）を加えることが有用である。 本発明のマイクロカプセルを生成するための現在のところ好ましい方法は、こ の目的のために開発された音響小滴生成装置を用いることである。 この装置は、陰イオンポリマー溶液の均一な微細小滴流を生じ、そしてそれら を、陽イオン反応体溶液の絶えず再生される表面上におよびそれを介して導いて 、新たにやって来る小滴が、先に与えられた小滴に衝突しないようにする。それ によって、装置は、（１）マイクロカプセル集合体を生じる性質を減少させ、そ して（２）極めて狭い粒度分布範囲を有する大集団のマイクロカプセルを生じる 手段を与える。装置は、下方に流れる垂直流のポリマー溶液を、それが狭いオリ フィスから出てくる直前に音波によって振動させることによって操作するので、 液体流による音波伝達は、流れに一連の狭窄を起こした後、液体の表面張力の影 響下において流れを均一な小滴の列に分散させる。小滴列は、連続流の陽イオン 反 応体を側面開口部（またはその位相同等物）から供給される細い円筒管中へ共軸 方向的に導かれる。したがって、新たにやって来るポリマー小滴はそれぞれ、陽 イオン反応体の新しい表面に出会い、そしてそれがそれ自体のカプセル壁を生成 し始め且つ管の下方端から出る前に別の小滴と衝突し且つ合体する機会はごく僅 かである。 マイクロカプセル製造用の音響装置の主要成分は、おそらく、２種類の液体流 を一緒に導いてマイクロカプセルを生成させるようなその機能的配列順序によっ て最もよく記載されるかもしれない。この装置において、陰イオンポリマーおよ びアミンの水溶液は別々の貯槽に貯蔵され、別々の輸送ラインを介してポンプ輸 送される。アミン溶液は、主要な反応容器として役立つ改良されたＴ形管の縦棒 部分へ供給され且つそこに入る。Ｔ形管は、Ｔの横棒の円筒軸が垂直方向に向け られるように固定されている。Ｔ形管の縦棒部分に入ったアミン溶液は、水平方 向に数ミリメートル流れた後、Ｔ形管横棒の下半分から重力によって流出する。 （実際には、単純なＴ形管ではなく、むしろ臨床化学実験室においてしばしば「 カクタス管」と称される種類の一つを用いることが有用であった。カクタス管は 、小文字のｈの概形を有し、本出願において、該管は、ｈ形がさかさまになるよ うに配置されている。カクタス管の直線部分は約２ｃｍ長さであり且つ内径は約 ２ｍｍである。）Ｔ形管から流れたアミン溶液は、貯槽へ戻され且つ再循環する ことができる。 ポリマー溶液は、（８ミクロンまたはより微細な保持力のある）膜フィルター を介し、続いてガラス毛管を介して、名目直径が２０〜２５ミクロンに狭められ ているその末端にポンプ輸送され、そして微細な連続液体ジェットの形で出て来 る。（狭められた毛管は、Ａ．Ｈ．トーマス・カンパニー（Ｔｈｏｍａｓ Ｃｏ ．）などの実験用品供給施設から一般的に入手可能な種類の容量２５、５０また は１００マイクロリットルのガラス毛細管から容易に加工される。狭窄は、ポリ マー溶液が１〜２ミリリットル／分でポンプ輸送される場合にポリマー溶液ジェ ットが４〜５メートル／秒の範囲の速度で出て来るようにするのが好ましいが、 当然ながら、これらの範囲外の流量および速度を用いてよい。） 毛管は、金属ブロック中の浅いＶ形溝中に合わせられ、そして（例えば、名目 エネルギー出力４０ワットで操作される実験用超音波プローブの）音響変換器の 軸方向に振動する先端に対して圧縮ばねによってしっかりと保持されているので 、音響エネルギーは毛管壁を介して流動ポリマー溶液に対して伝達されて、ポリ マー溶液ジェットを均一な大きさの小滴列に分散させる。 変換器−毛管−圧縮ブロック集成装置は、ポリマー溶液小滴の出て来る列が空 気中を約３ｃｍ進み且つＴ形管横棒の上端へ軸方向に導かれて、Ｔ形管の側面（ 縦棒部分）から入ったアミン溶液上に衝突する。ポリマー溶液小滴はアミン溶液 と反応してマイクロカプセルを生成し、それらはアミン溶液と一緒にＴ形管横棒 の下端から流出する。 音波刺激の不存在下においても、上記のように毛管狭窄から出て来るポリマー 溶液ジェットは、通常、液体流およびジェットが出てくる雰囲気の種々の自然の 不安定性、いわゆる、液体ジェットのレイリー分裂の結果として、種々の大きさ の小滴列に自然に分散すると考えられる。しかしながら、均一な大きさのマイク ロカプセルを製造するためには、均一な大きさの小滴が生じることが望ましい。 その理由のために、本発明の好ましい実施態様においては、液体流を周期的に音 波によって乱すことによって均一な大きさの小滴を生じさせて、ジェットの軸に 沿った一連の十分に強い圧縮（音）波を開始させる。一連の音波は、液体媒質を 介して進み且つ液体自体よりもはるかに速くオリフィスから離れる。（ジェット は４〜５メートル／秒の速度で出て来る。）ジェットの長さに沿った波列の伝播 は、ジェット路に沿った連続ノードでの増加する構成的振幅の干渉パターンを発 生する。オリフィスからある程度の距離において、表面波の振幅は液体の表面張 力より大きくなり、そしてソニケーター周波数でポリマー溶液の小滴が生成する 。この方法での均一な大きさの小滴列の生成は、Ｐ．Ｊ．ガレー（Ｇａｌｌｅｙ ）およびＧ．Ｍ．ハイフチェ（Ｈｉｅｆｔｊｅ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔ ｒｏｓｃｏｐｙ ４５：１４６０〜１４６３（１９９２）によってある程度詳細 に報告されている。 前述の方法および装置を例証するために、添付の図１を参照するが、そこには 「ｈ」形管状部材１０が示されており、側脚入り口セグメント１４および垂直交 差セグメント１２があり、アミン溶液１６は、管セグメント１４の上端に下向き にポンプ輸送されるので、それは垂直セグメント１２に入るように、そしてセグ メント１４およびセグメント１２の交差点において下方に流れる部分へとそれて 、そこから管状セグメント１２の下端に出ていく。セグメント１４および１２の 交差点より上において、ポリマー溶液２２は毛管部材１８を介して導入され、該 毛管の下端は、セグメント１４および１２の交差点より上の予め決定された距離 （上記の典型的な説明においては約３センチメートル）におかれ、該交差点でア ミン溶液流は下方にそれるので、ポリマー溶液の１滴ずつに処理された部分２２ は、下方に流れるアミン溶液とその地点で混合される。 上記のように、ポリマー溶液の１滴ずつ下方に流れる部分２２の均一性を増加 させるために、毛管１８は、Ｖ形溝保持スロット（図面には示されなかった）に よって金属ブロック２４中に堅く保持され且つ断続的に音響によって刺激される る。その目的のために、音響プローブ２０は、毛細管１８の下端近くで接触して いる。 単示時間当たりに生じる個々の小滴数は、ソニケーターの周波数から推定する ことができる。大抵の場合、周波数２０ＫＨｚのソニケーターを用いた。生成さ れる小滴数の推定値は、連続の小滴が互いに衝突し且つ合体するかまたは互いに 付着して凝集したマイクロカプセルを生成することがある場合のために僅かに誤 りがあるかもしれない。実際には、１％よりはるかに少ない小滴が、融合したま たは合体した形として存在している。全ての小滴が別個に生成されると仮定する と、個々の小滴の大きさは、ポリマー流量の情報から計算することができる。名 目陰イオンポリマー流量１ミリリットル／分において、個々の小滴の体積は０． ０５マイクロリットル（立方ミリメートル）であり、球状小滴直径４．５７ミク ロンに相当する。１ミリリットル／分に近い流量および２０ＫＨｚの音響周波数 で生成されたマイクロカプセルの直径は、体積直径分粒（クールター（Ｃｏｕｌ ｔｅｒ）理論）から推定される約５ミクロンである。 或いは、本質的にどんな大きさのポリマー溶液小滴も、陽イオン反応体溶液中 に（例えば、噴霧によってまたはピペットから１滴ずつ与えることによって）導 入してマイクロカプセルを生成することができる。多数の用途において、生成さ れたマイクロカプセルは極めて均一な大きさを有することが望ましく、したがっ て、この均一性を誘導するいくつかの手段、例えば、上記の音響法が好ましい。 このような用途としては、しばしばパイアー斑と称される腸のリンパ組織への供 給がある。パイアー斑のＭ細胞は、約１０ミクロンより大きい粒子を優先的に拒 絶するが、約１０ミクロン未満の粒度範囲の粒子を取り込み且つそれらを他のリ ンパ組織へと運ぶ。 概して、本発明のマイクロカプセルは、０．１〜２，０００ミクロンの大きさ であってよい。一般的な経口投与に有用な好ましい粒度範囲は５００〜１，００ ０ミクロンである。若干の実施態様において、その範囲は１００〜２００ミクロ ンである。他の実施態様において、例えば、腸のリンパ組織中のパイアー斑への 供給のための物質の投与において、特に好ましい粒度範囲は１〜１０ミクロンで ある。 一部分は製造用流体が除去される程度に、そして一部分はコア溶質の性状に応 じて、水性コアマイクロカプセルは、易流動性懸濁液として、粘着性の流動性濃 厚物として、ペーストとして、脆いフレークとして、または更に処理してリオケ ーキとして集めることができる。凍結乾燥は、極めて水溶性のコア材料を用いて 安定なマイクロカプセルを提供するのに特に望ましい。 いったん封入されたら、ロタウイルスなどのコア材料は周囲環境から保護され ているが、半透過性マイクロカプセル壁を介してコア材料が活発に拡散しうる水 性媒質中にカプセルを懸濁させることにより、マイクロカプセルから徐々に放出 される。概して、壁生成用反応体の性状が一定に保持されている場合、極めて水 溶性のコア材料は、水溶性に乏しいコア材料よりも速やかに放出されることが観 察され、そして概して、低分子量の物質は、高分子量のものよりも速やかに放出 される。若干の実施態様において、マイクロカプセルのリオケーキへの変換およ び水性媒質中の再懸濁が好ましい。 本発明によるワクチンは、少なくとも１種類のマイクロカプセルに封入された 免疫原性組成物、例えば、ロタウイルスおよび薬学的に許容しうる担体または希 釈剤を含む。場合により、ワクチンは、マイクロカプセルに封入されたおよびマ イクロカプセルに封入されない免疫原性組成物および／またはアジュバントを含 めた追加の成分を含んでいてよい。 本発明のワクチンは、一般的慣例にしたがって、緩衝剤、安定化剤、保存剤、 可溶化剤および徐放を容易にするのに用いられる組成物を用いて配合することが できる。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロ ース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。安 定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンがある。アジュバントを用いてよい 。アジュバントの例としては、ＲＩＢＩ（リビ・イン−コーポレーテッド（Ｒｉ ｂｉ Ｉｎｃ．））、アルム（Ａｌｕｍ），完全フロイント、不完全フロイント 、ブロックコポリマー（シトルクス（ＣｙｔＲｘ）、アトランタ ＧＡ）、ＱＳ −２１（ケンブリッジ・バイオテク・インコーポレーテッド（Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ケンブリッジ ＭＡ）およびＳＡＦ−Ｍ（カ イロン（Ｃｈｉｒｏｎ）、エメリービル ＣＡ）を挙げることができる。ワクチ ンは溶液中で維持されてよいし、または多くの場合、特に組換え体ワクチンの場 合、凍結乾燥されていてよい。凍結乾燥ワクチンは好都合に貯蔵され、投与前に 滅菌溶液と混合されることができる。 マイクロカプセル封入免疫原組成物の投与量は免疫原組成物の性質、ワクチン 接種される動物の種、年齢、重量及び一般的な物理的特徴並びにワクチンの組成 に依存する。各パラメーターに関する最適用量の決定はルーチン方法によって行 うことができる。一般に、本発明の幾つかの実施態様によると、ワクチンは免疫 原組成物０．０５〜５０００μｇ／ｍｌ無菌溶液、好ましくは１０〜１０００μ ｇ／ｍｌ無菌溶液を含む。約０．５〜２ｍｌのタンパク質含有溶液を投与する。 感染剤(infectious agent)の投与量は所望の感染(infectivity)レベル、ワクチ ン接種される動物の種、年齢、重量及び一般的な物理的特徴並びにワクチンの組 成に依存する。各パラメーターに関する最適用量の決定はルーチン方法によって 行うことができる。 本発明によるワクチンは、例えば経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内又は皮下投与 のような、適当な経路によって投与されることができる。幾つかの実施態様では 、経口投与が好ましい。最初のワクチン接種後に、哺乳動物を再ワクチン接種に よってブーストする(boosted)ことができる。 種々な有効剤の投与に対する本発明のマイクロカプセルの有用性は下記実施例 で実証される。 実施例１ プラセボマイクロカプセル 工程１：便宜的に、最初にアニオンポリマーを水中１％ｗ／ｖ溶液として調製 して、必要に応じて、希水酸化ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムによって７． ０±０．１のｐＨに調節した。例えばアクリル酸と酢酸フタル酸セルロースのよ うな、弱水溶性アニオンポリマーはそれらのナトリウム塩として溶液にした。新 鮮なポリマー溶液を使用前に一晩水和させ、冷蔵庫の温度で貯蔵し、試験前又は 使用前に室温に平衡させた。 工程２：アミン溶液を水中１％ｗ／ｖ溶液として調製して、希塩酸（又は、幾 つかの長鎖脂肪族第１級アミンの場合には、酢酸）を用いて、７．０±０．１の ｐＨに調節した。例えばオクタデシルアミンのような、難溶性アミンは必要に応 じて加熱して、それらの塩として溶液にした。 工程３：アミンとポリマーの組合せが不溶性沈殿と有用なマイクロカプセルと を形成するか否かを、アニオンポリマー溶液の約５０μｌ小滴を小試験管内の約 ５ｍｌ量のアミン溶液に加えることによって評価した。添加したアニオンポリマ ー溶液が不溶性沈殿を生じなかった場合には、この反応物対はもはや考察に値し ないと見なされた。不溶性沈殿を生じた反応物の組合せは以下の工程４に進めた 。 工程４：上記工程３でさらに試験するように選択した各反応物対に関しては、 ５ｍｌ量のアニオンポリマーを等量の水で希釈し、１０ｃｍの高さから、１０ｃ ｍペトリ皿（蓋なし）に含まれる電磁気撹拌したアミン溶液２５ｍｌ上に噴霧し た。噴霧はアニオンポリマー溶液を１８ゲージ皮下注射針に通して１ｍｌ／分の 速度で供給し、空気流を４リットル／分の速度で１２ゲージ皮下注射針からポリ マー供給針の先端を通過させることによって、実施した。 ポリマー溶液の再現可能な細い円錐状分散を形成するために、１８ゲージ針の 先端を７５度角度にやすりをかけ(filed)、１２ゲージ針の先端を９０度にやす りをかけた。１８ゲージ針を水平に取り付け、長円形の開口を１２ゲージ針の方 向に上向きに配向させ、１２ゲージ針は垂直に配置した。空気流の先端（１２ゲ ージ針）をポリマー供給針の先端の上方２ｍｍの位置に、針の胴部をステンレス 鋼クロスブレースにスポット溶接することによって固定して、ポリマー流が修正 １８ゲージ針から出るときに空気流がポリマー流を横切って流れるようにした。 このネブライザーを最適化する（例えば、ポリマー供給針先端の角度）ためには 、一連の試行実験が必要であった。これらの試行には、水の代わりに、染料水溶 液を用いて、ポリマー溶液を希釈して、着色ポリマーを濾紙の１２ｃｍ円上に噴 霧した。 混合物がペトリ皿のガラス面に付着してチンダル効果を表示することができる 分散粒子から構成されるかどうか及び／又は混合物が１００ｘ倍率で顕微鏡検査 したときに大ざっぱに偏球状粒子と見えるかどうかを知るために噴霧中と噴霧後 に反応混合物を検査することによって、アミンポリマー組合せのマイクロカプセ ル形成における有用性を評価した。結果は表２に要約する。識別可能な偏球状粒 子を生じたような反応物組合せはさらに、本明細書に述べるような多様な活性コ ア物質のためのカプセル材料としての安定性と有用性とに関して評価した。 或いは、反応物対をそれらがマイクロカプセルを形成することができるか否か に関して空気駆動式(air-driven)噴霧デバイスによって試験するために、一定数 のアミンポリマー組合せを上記音響装置を用いて評価した。 実施例２ アルギン酸ナトリウムの０．５％水溶液１０ｍｌ量を約５μ直径小滴として、 スペルミン（塩酸塩として）０．０５％溶液２０ｍｌ量の穏やかに撹拌した表面 に約１０分間にわたって分散させた。この混合物を遠心分離し（２０００重力分 ）、得られたマイクロカプセル状ペレットから上清を捨てた。ペレットの小部分 を１００ｘ倍率で検査したところ、無数の小さい偏球状粒子から成ることが見ら れた。 実施例３ 数日間水中に貯蔵した、実施例１と２に記載したようなプラセボマイクロカプ セルの、人工胃液及び高い電解質濃度に対する安定性を検査するために、実施例 ２に述べたように製造したスペルミンアルギネートマイクロカプセルの懸濁液を 水２０ｍｌ中に再懸濁させ、４等分した。 １部分は対照として留保した。 新鮮な懸濁液の数μｌの第２アリコートを取り出し、残りは室温において栓を して保存した。次に続く４日間の各日に、この部分の残部を撹流(vortexing)に よって再懸濁させ、数μｌを取り出した。このμｌサンプルを迅速に顕微鏡スラ イドに供給し、検査し、１００ｘ倍率で写真撮影した。得られた顕微鏡写真を比 較して、個々の粒子の外観が変化したか又は放置中に凝集したか否かを検査した 。 第３アリコートを等量の人工胃液と混合して、直ちに検査し、３７℃における ２時間インキュベーション後に再び検査して、マイクロカプセルが胃の環境のよ うな酸性環境に暴露されたときに溶解するかどうかを調べた。 固体塩化ナトリウムの１８０ｍｇ部分を第４アリコートに加えて、塩化ナトリ ウムが溶解するまで、混合物を撹流した。塩化ナトリウムを加えた部分を１００ ｘ倍率で目視検査して、加えた塩がマイクロカプセルの安定性に影響するかどう かを検査した。 結果： ５日間貯蔵した部分の検査は目視検査したときに又は顕微鏡写真を比較したと きに検知されうる変化を示さなかった。酸で処理した部分は直ちにも２時間イン キュベートしたときにも溶解しなかった、但し、約４ｘノルマルオスモル(norma l osmolar)の塩化ナトリウムによって処理した部分は全ての塩が溶解する前に清 澄化した。塩処理部分を顕微鏡検査したときにマイクロカプセルは見られなかっ た。スペルミンアルギネートマイクロカプセルはヒト組織のノルマルオスモラリ ティ(normal osmolarity)よりも数倍高い電解質濃度に対しては不安定であると 判定された。 実施例４ 形成されるマイクロカプセルの収率に関してアミンとアニオンポリマーとの種 々な組合せの化学量論の影響を調べることは重要であった。このために、図１に 関連して本明細書で述べた音響装置によって得られるマイクロカプセルの一連の サンプルを、アニオンポリマーの連続希釈物と一定濃度のアミンとの反応によっ て下記のように調製した： 工程１：１％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウム水溶液を調製して、少なくとも２４ 時間水和した後に、８μフィルターに通して濾過した。 工程２：０．０５％ｗ／ｖスペルミン（塩酸塩として）２６０ｍｌ量を調製し た。 工程３：アルギン酸ナトリウム溶液１０ｍｌ量を等量の水で希釈し、混合した 後に、希釈物１０ｍｌをスペルミン溶液４２ｍｌ量と一緒に用いて、上記アコー スティックデバイスによってマイクロカプセルを製造した。残りのアルギン酸ナ トリウム希釈物は工程４で用いるために保存した。 工程４：工程３からのアルギン酸ナトリウム希釈物をさらに１０ｍｌの水によ って希釈し、混合後に、新たな希釈物の１０ｍｌをスペルミン溶液４２ｍｌ量と 一緒に用いて、上記アコースティックデバイスによってマイクロカプセルを製造 した。残りのアルギン酸ナトリウム溶液は工程５で用いるために留保した。 工程５：上記工程４に述べたプロセスを引き続いて繰り返して、連続的に低濃 度のアルギン酸ナトリウム溶液から一連のスペルミンアルギネートマイクロカプ セルを製造した。 工程６：工程４と５において製造したスペルミンアルギネートマイクロカプセ ルの連続的バッチを撹流して、それらを完全に混合し、各懸濁液の見かけの吸光 度(apparent absorbance)を５５０ｎｍ（反応物自体が測定可能な吸光度を有さ ないことを予め調べたスペクトル領域）において直ちに測定した。各懸濁液の数 μｌのアリコートを顕微鏡スライドに供給し、１００ｘ倍率で写真撮影した。残 りのサンプルは栓をして、室温において貯蔵し、５０時間後に再検査して、写真 撮影した。 結果： この吸光度測定値は、スペルミンアルギネートマイクロカプセルの最大密度が アルギネート反復単位１モル対スペルミン１６モルの濃度比での反応物の使用に 由来することを実証する。 実施例５ 反応混合物中の反応物の比が必ずしも、化学反応の生成物として結合した反応 物の比と全く同じではないことは周知である。ある場合には、目的生成物の収率 を改良する方向に反応を推し進めるために一方の反応物の過剰量が必要であるか 又は望ましい。この実施例では、反応物の好ましい化学量論比は下記のように決 定した： 上記実施例４の工程６に述べたように最高密度のマイクロカプセル収量を生じ る反応物濃度を用いて、スペルミンアルギネートマイクロカプセルのバッチを調 製して、生成物を遠心分離と新鮮水中での再懸濁とによって反復して回収した。 洗浄したサンプルを風乾させ、燃焼分析をこのような研究を専門とする外部企業 によって受けさせた。この企業にはサンプルを一定重量になるまで５０℃未満の 温度（炭水化物誘導ポリマーの無水誘導体の形成を避けるため）において乾燥さ せるように指示した。 この燃焼分析は生成物が約２５％スペルミン（又は各４アルギネート反復単位 に対して約１スペルミン分子）の相当物を含むことを示した。したがって、マイ クロカプセルを形成する反応は高いアミン対アニオン反応物比において最適化さ れるが、必ずしも全ての有効アミンがアミンポリマー塩を形成するために反応す るとは限らない。この多重官能性(polyfunctional)アミンの各アミノ基が１つの 酸性アルギネート反復単位と反応するように思われる。 実施例６ 本明細書に開示するように製造したマイクロカプセルの望ましい性質は、マイ クロカプセルが安定な個々の粒子として留まり、経時的に凝集する傾向を殆ど又 は全く示さないことである。この性質を評価するために、異なる化学量論の一連 のマイクロカプセル製剤(formulation)を製造後に連続的な間隔をおいて試験し た。 上記実施例４で調製した製剤をテフロンライニング付きねじ込みキャップ管(t eflon lined screw cap tube)に入れて、２１〜２５℃の温度範囲内で貯蔵した 。６か月間の期間にわたって約２か月間の間隔を置いて、サンプルを３回約３０ 秒間撹流し、数μｌのアリコートを１００ｘ倍率で検査した。 ０．５０％アルギネートと０．２５％アルギネートとから製造された製剤は最 初の２か月間隔の最後に大規模に凝集し、その後に全てが凝集した。０．１２５ ％アルギネートによって製造したサンプルは２か月目に単分散性であるが、４か 月目及び６か月目に若干凝集した（それぞれ、１０〜２０個の粒子の凝集物）。 試験した最低濃度（０．０６％と０．０３％）で製造した製剤は６か月後も単分 散性に留まった。 実施例７ 完全に水性のカプセル封入系に効果的に用いられるコア物質の範囲をある程度 推定するために、２種類の水溶性薬物と、２種類の水溶性アジュバント物質と、 ２種類の水不溶性固体と、２種類のウイルスと、壁形成材料としてのスペルミン アルギネート、スペルミンコンドロイチンスルフェート、エチレンジアミンセル ローススルフエート又はオクタデシルアミンカルボキシメチルセルロースとを用 いて、一連のカプセル封入を実施した。 実施例７ａ 工程１：テトラサイクリン塩基（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の １５ｍｇサンプルを０．０６％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｍｌ中に溶解し 、上記アコースティックデバイスを用いて、この溶液を塩酸スペルミンの０．０ ５％水溶液２０ｍｌと一緒にして、テトラサイクリンを含むマイクロカプセルを 形成した。 工程２：マイクロカプセル懸濁液を遠心分離し（５，０００重力分）、上清を デカントした後に、ペレット化マイクロカプセルを５ｍｌにするために充分な水 中に再懸濁させることによって５回洗浄し、再ペレット化し（遠心分離によって ）、デカントし、各場合にデカントされた液体を保存した。最終ペレットを１０ ｍｌにするために充分な水中に再懸濁させ、これに５００ｍｇの固体塩化ナトリ ウムを加えた。この混合物を短時間撹流して、マイクロカプセルと添加塩との溶 解を助成した。塩酸約１μｌ量を溶解マイクロカプセルと、保存されたデカント 液体の各々とに加え、各溶液の吸光度を２６８ｎｍにおいて測定した。 ３回洗浄した後に得られた上清液はテトラサイクリンに特徴的な顕著な吸光度 を示さなかったが、２６８ｎｍにおける溶解マイクロカプセルの溶液の吸光度は 、テトラサイクリンの初期量の１／２より多くが反復洗浄中にマイクロカプセル 中に保存されることを実証した。 実施例７ｂ 工程１：テトラサイクリン塩基の代わりにフルオロウラシル（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて、上記実施例７ａの工程１に述べたようにカ プセルに封入した。 工程２：上記工程１で得られたマイクロカプセル懸濁液を、吸光度測定を２６ ５ｎｍにおいて実施した以外は、上記実施例７ａの工程２に述べたように処理し た。３回洗浄した後に得られた上清液は有意なフルオロウラシル吸光度を示さな かったが、２６５ｎｍにおける溶解マイクロカプセルの溶液の吸光度は、フルオ ロウラシルの初期量の１／２より多くが反復洗浄中にマイクロカプセル中に保存 されることを実証した。 実施例７ｃ 工程１：テトラサイクリン塩基の代わりにブルーデキストラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（平均分子量２，０００，０００）の１００ｍｇサ ンプルを用いて、上記実施例７ａの工程１に述べたようにカプセルに封入した。 工程２：上記工程１で得られたマイクロカプセル懸濁液を、吸光度測定を６２ ０ｎｍにおいて実施した以外は、上記実施例７ａの工程２に述べたように処理し た。 ３回洗浄した後に得られた上清液はブルーデキストランの特徴的な、有意な吸 光度を示さなかったが、マイクロカプセルを溶解した後に６２０ｎｍにおける吸 光度は、ブルーデキストランの初期量の１／２より多くが反復洗浄中にマイクロ カプセル中に保存されることを実証した。 実施例７ｄ 工程１：ブロムフェノールブルー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ ｏ．）の１００ｍｇサンプルをナトリウムカルボキシメチルセルロース（中粘性 、Ｒｕｇａｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の０．１％溶液２５ｍｌ中に溶解し 、得られた溶液を、微細な先端（０．１ｍｍ外径）に延伸された毛管に通して徐 々に供給した（約１ｍｌ／分）。出現する小滴をｐＨ７．０の酢酸塩として可溶 化されたオクタデシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の 緩慢に撹拌された０．１％水溶液中に約１ｃｍの距離落下させた。 工程２：得られた約１．５ｍｍ直径マイクロカプセルをさらに１時間撹拌して 、微細な網(netting)を用いて分離した。これらのマイクロカプセルを水２ｘ１ ００ｍｌ量で洗浄した。マイクロカプセルの約１／２を湿式貯蔵し、用いるまで 冷凍した。マイクロカプセルの他の１／２を凍結乾燥させ、用いるまで乾式貯蔵 した。 工程３：数ダースの凍結乾燥マイクロカプセルを数ｍｌの水中で１時間再水和 させ、湿式貯蔵マイクロカプセルと同時に用いて、それらのｐＨ感受性を試験し た。塩酸の希釈物を用いて２、３及び４のｐＨ値を有する溶液を形成した。これ らの塩酸溶液に、若干の再水和マイクロカプセルと若干の湿式貯蔵マイクロカプ セルとを一度に１個ずつ加えた。マイクロカプセルが周囲の媒質に、カプセル封 入されたブロムフェノールブルー指示薬のｐＨ４における青色からｐＨ３におけ る黄色までの予想変化と一致して変色することによって反応するかどうかを知る ために、マイクロカプセルを観察した。 最初はしわのよった凍結乾燥マイクロカプセルは、水に加えると約２０分間の 期間にわたって偏球状形状を呈した。再水和マイクロカプセルと湿式貯蔵マイク ロカプセルの両方がｐＨ４媒質に加えた場合に青色に留まったが、ｐＨ３溶液に 加えると数分間内に黄色に変化した。カプセル封入したブロムフェノールブルー はマイクロカプセル内部のｐＨ値の指示薬として役立つが、マイクロカプセルか ら拡散しなかった。 実施例７ｅ 工程１：微粉状木炭の２００ｍｇサンプルをナトリウムカルボキシメチルセル ロースの０．１％溶液２５ｍｌ中に溶解し、上記実施例７ｄの工程１に述べたよ うにカプセル封入した。 工程２：得られた約１．５ｍｍ直径マイクロカプセルをさらに１時間撹拌して 、微細な網を用いて分離した。これらのマイクロカプセルを水２ｘ１００ｍｌ量 で洗浄し、室温において２か月間湿式貯蔵した。木炭含有マイクロカプセルを２ 週間毎に試験して、マイクロカプセルが完全に留まるか又はカプセル封入固体の 幾らかが失われるかを調べた。 木炭含有マイクロカプセルは観察期間にわたって完全に留まり、この期間中に マイクロカプセルから固体コア物質が漏出する証拠は存在しなかった。 実施例７ｆ 工程１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ｉｓｒａｅｌｅ ｎｓｉｓ（Ｅｃｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の菌株から単離した結晶質毒素の１０ｍｇ サンプルをナトリウムセルローススルフェート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｃｏ．）の１％溶液２５ｍｌ中に懸濁させ、上記実施例７ｅの工程１に述 べたように、ｐＨ７の塩酸塩として可溶化されたエチレンジアミンの１％水溶液 ５０ｍｌ中に滴加した。 工程２：得られた結晶質毒素含有マイクロカプセルをさらに１時間撹拌し、微 細な網を用いて分離した。これらのマイクロカプセルを水２ｘ１００ｍｌ量で洗 浄し、乾燥ドレインさせ(drained dry)、凍結乾燥させた。残留エチレンジアミ ン溶液と両方の洗浄液とを保存した。 工程３：凍結乾燥マイクロカプセル５０個を数ｍｌの水中で１時間再水和させ 、再水和流体をドレインさせ、保存した。 工程４：再水和マイクロカプセルを溶解し、これらに１モルのリン酸三ナトリ ウム１０ｍｌを加え、この混合物を１００ｍｌに希釈することによって、結晶質 毒素を溶解した。 工程５：残留反応流体と、両方の洗浄液(wash)と、再水和流体と、溶解したマ イクロカプセルとのタンパク質含量を、タンパク質−銅（Ｉ）複合体の吸光度を ４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビキノリンによって５６２ｎｍにおいて測 定することによって算出した。マイクロカプセル中に結晶質毒素の初期量の９０ ％を充分に越える量がマイクロカプセル中に保存され、マイクロカプセル形成反 応中にごく小部分が失われたに過ぎない。 実施例７ｇ ウイルスのカプセル封入のための本発明の有用性を実証するために、数セット の試薬と、しばしば異なるロットのウイルスとを用いて３種類の実験を実施した が、１種類の実験の範囲内では各試行の目的と方法論とは同じであった。これら の３種類の実験は（１）プラセボと、ウイルス含有マイクロカプセルとの調製、 （２）マイクロカプセルからのウイルスの放出、及び（３）プラセボと、ウイル スマイクロビーズとの滴定であった。 ２種類のウイルス［５．４ｘ１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ（プラーク形成単位／ｍｌ） のタイターを有するロタウイルス菌株ＷＣ−３と、８．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ のタイターを有するワクシニアウイルス菌株ＶＶＵＫｖｐ７］をカプセルに封入 した。 工程１：アニオンポリマー（例えば、アルギン酸ナトリウム）の１％ｗ／ｖ中 性水溶液の５ｍｌサンプルを水５ｍｌで希釈し、撹流によって混合する。希釈し たサンプルをネブライザーに移し、上記実施例１の工程４で述べたように、希釈 物を塩酸アミン（例えば、塩酸スペルミン）の中性０．２ｍＭ水溶液の電磁気撹 拌した２５ｍｌ量の約４０ｃｍ²表面に噴霧することによってマイクロカプセル を製造する。 工程２：ネブライザーを水１ｍｌによってすすぎ洗いし、このすすぎ洗い液を 上記工程１と同様にアミン溶液上に噴霧する。 工程３：得られたマイクロカプセルを目盛り付き遠心管に移し、マイクロカプ セルを遠心分離によって分離し、全液体量と沈降マイクロカプセル量とを測定す る。 工程４：マイクロカプセルを使用の準備ができるまで冷凍貯蔵し、次に、撹流 によって再分散させる。 工程５：上記工程１における水５ｍｌの代わりにウイルス懸濁液（例えば、ロ タウイルスＷＣ−３）を用いて、上記工程１〜４を繰り返す。 工程６ａ：マイクロカプセルを１５００ｇｘｍ（重力ｘ分）においてペレット 化し、デカントし、最初の量の１／５に等しい量の蒸留水中に再懸濁させること によって洗浄する。プラセボカプセルのみに関しては、カプセル封入ウイルスと 大体等しいと推定されるウイルス懸濁液のチャージ(charge)を工程１３に詳述す るように再懸濁カプセルに加える。長鎖アルキルアミン（例えば、酢酸塩として のオクタデシルアミン）から製造したプラセボ又はウイルスマイクロカプセルを 迅速に破壊するために、等量のマイクロカプセル懸濁液を３００ｍｏｓｍｏｌ（ ミリオスモル）ｐＨ７．０水性リン酸塩緩衝液又は新鮮な０．５Ｍ水性炭酸水素 ナトリウムと混合して、等量のシクロヘキサンによって被覆する。この混合物を １分間置きに５分間短時間撹流する。次に、シクロヘキサン層を吸引する。ウイ ルスは、存在するならば、水相中に存在する。 工程６ｂ：多重官能性アミン（例えば、塩酸塩としてのスペルミン）から製造 したプラセボ又はウイルスマイクロカプセルを迅速に破壊するために、等量の１ ２００ｍｏｓｍｏｌ塩化ナトリウムとマイクロカプセル懸濁液とを混合する、又 は充分な固体の塩化ナトリウムをマイクロカプセル懸濁液に加えて、生成溶液に ４％塩化ナトリウムを含ませる。 工程７：未加工サル腎臓の単層培養物を多重孔（２．５ｃｍ）組織培養プレー ト中で、マイクロカプセルの破壊前の７２時間から出発して調製する。 工程８：約１０⁷プラーク形成単位／ｍｌ（ｐｆｕ／ｍｌ）を含むストックウ イルス懸濁液と、別に、マイクロカプセル洗浄液の上清と、破壊したマイクロカ プセル懸濁液（工程６ａ）との６種類の連続１０倍希釈物をＡＶＮ培地中に調製 する。 ＡＶＮ培地は下記成分： １．塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナトリウム、デキストロース 、硝酸第２鉄、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、ビタミン、アミノ酸、炭酸 水素ナトリウム、フェノールレッド指示薬を全て蒸留水中に溶解して含む、商業 的に入手可能なＳｔｏｋｅｒ培地、 ２．トリプトースホスフェートブロス、 ３．グルタミン、及び ４．ペニシリンとストレプトマイシンとの混合物 を含む。 工程９：細胞を生理的食塩水によって２回洗浄し、洗浄液を捨てる。 工程１０：連続した隣接孔に連続ウイルス希釈物の２００μｌアリコートを接 種し、３７度において３０分間インキュベートする； 工程１１：細胞を最小塩とアガロース／トリプシンとの１：１混合物で被覆す る。被覆細胞を３７℃において７２時間インキュベートする。 工程１２：細胞をアガロースと、中性レッドを含む２ｘＥａｒｌ平衡溶液との １：１混合物の１．５ｍｌ／孔で着色する。細胞を３７℃において２４時間イン キュベートし、プラーク／孔を存在するならば計数する。細胞を３７℃において さらに２４時間インキュベートし、存在する場合には、新たなプラーク／孔を計 数し、オリジナルのウイルス懸濁液のｐｆｕ数を算出する。 工程１３：プラセボマイクロカプセル滴定に関しては、上記工程７を繰り返す 。次に、約１０⁵ｐｆｕ／ｍｌのウイルス濃度を与えるために適切なストックウ イルス懸濁液の既知量をプラセボマイクロカプセル懸濁液約２５ｍｌ量に加え、 懸濁液を撹流によって混合する。 工程１４：懸濁液を遠心分離し、水相を実行可能な限り完全に吸引する。マイ クロカプセルと吸引物の両方を保存する。 工程１５：マイクロカプセルを１０倍量の水中に再懸濁させ、再び遠心分離し 、水相を吸引する。マイクロカプセルと吸引物の両方を保存する。 工程１６：工程１５を繰り返す。 工程１７：マイクロカプセルサンプルを二等分して、上記工程６ａ又は６ｂで 述べたように破壊する。 工程１８：上記工程７と、工程９〜１２とを繰り返し、工程１２ではウイルス 懸濁液の連続希釈物の代わりに連続吸引物、残留マイクロカプセル懸濁液及び破 壊したマイクロカプセル調製物(preparation)を用いる。 工程１９：ウイルス含有マイクロカプセルを滴定するために、工程１３〜１９ を繰り返し、プラセボマイクロカプセル懸濁液の代わりにウイルスマイクロカプ セル懸濁液を用いる。 対照、ウイルスマイクロカプセル及びプラセボ（試薬ブランク）マイクロカプ セル滴定の工程の上記順序は下記のように要約することができる。ウイルス学で は、滴定は細胞培養物中のウイルスプラークの計数である。 プラセボ（スペルミンアルギネートマイクロカプセル）、ウイルス（スペルミ ンアルギネートマイクロカプセル中に封入されたＷＣ−３）及び対照（カプセル に封入されないＷＣ−３）の結果は下記表に要約する。 対照、ウィルスマイクロカプセルおよびプラセボマイクロカプセルを用いた予 備試験によれば、ウィルスの感染力および免疫原性がカプセル封入後でも維持さ れておりそしてウィルス充填の本質的部分が繰り返し洗浄後でもマイクロカプセ ルに維持されていることがわかった。ワクチニアウィルスの捕捉効果はロタウィ ルスのものより優れていた。両方とも感染力を維持していた。 実施例８ マウス：8 -12 週齢 C57BL/6（H-2^bハプロタイプ）のマウスおよびCD2（F1） マウス乳児(タコニック ブリーディング ラボラトリーズ(Taconic Breeding L aboratories)(ニューヨーク州、ジャーマンタウン(Germantown，NY))から購入) を、別々の隔離されたユニットに住まわせた。成人および雌親からの血清をELIS A によりロタウィルス特異的抗体の存在について試験し、そしてこれらの実験で は血清反応陰性の動物のみ使用した。 細胞：胎児ミドリザル- 腎細胞（MA-104）をオフィット、ピィ．エー．（Offi t,P.A.）ら、1983 Infect.Immun．42:293-300 に記載のように増殖した。 ウィルス：ウシロタウィルス菌株 WC3をクラーク、エッチエフ.(Clark，H F.) ら、1986 Am．J．Dis．Child．140:350-356 に記載のように我々の実験室で単離 した。シミアン株 RRV(MMU 18006)をナサレー シュミット(Nathalie Schmidt) （カリフォルニア州、バークレーのウィラル アンド リッケティシアル ディ ジーズ ラボラトリー(Viral and Rickettsial Disese Laboratory，Berkeley， CA)から得た。これらの研究に使用するためのロタウィルスのプラーク精製スト ックをMA-104細胞において調製した。ロタウィルスを増殖させ、精製し、分光分 析により定量化し、そしてオフィット、ピィ．エー．ら 1983 Infect．Immun．4 2:293-300 およびオフィット、ピィ．エー．ら 1983 J．Virol．Methods 7:29-4 0に記載のようにプラーク分析により感染力を測定した。 マイクロカプセルを形成するための陰イオンポリマーおよびアミンの選択：こ られのナトリウム塩として試験された陰イオンポリマーは、アルギン酸(ニュー ジャージィー州フェアローンのフィッシャー サイエンティフィック社(Fisher Scientific Co.，Fairlawn，N.J.))、ポリアクリル酸およびセルローススルフェ ート(ミズリー州セントルイスのアルドリッチ ケミカル社(Aldrich Chem ical Co.，St.Louis，MO.))、セルロースアセテートフタレート(ニューヨーク州 、ロチェスターのイーストマンオーガニックケミカルズ、(Eastman OrganicChem icals，Rochester N.Y.))、カルボマー(Carbomer)USP(カルボポール(Car Goodrich，Cleveland，OH.))、カルボキシメチルセルロース USP(中粘度、ニュ ージャージィー州、イルビントンのルガーケミカル社(Ruger Chemical Co．Inc. ,Irvington，N.J.))、ヘパリン USP(ミシシッピィ州、カラマゾーのジアップジ ョン社(The Upjohn Co.，Kalamazoo，MI))および米国特許第2,666,759号の方法 に従って単離されたアラビン酸である。マイクロカプセル壁の基本的構造成分を 構成する陰イオンポリマーは、最も近い隣接するカルボキシレート基の間に一定 のスペースを空けるように選択された。したがって、ポリマーの延長されたシー タ形において、陰イオン相互の距離はポリアクリル酸では2 個のメチレン基、ア ルギン酸およびセルローススルフェートでは6 個、カルボキシメチルセルロース では10個そして高度に枝分かれしたアラビン酸では20-30 個の等価物と近似して いる。 アセテート(ミズリー州セントルイスのシグマケミカル社(Sigma Chemical Co ．St．Louis，MO．))として使用されるオクタデシルアミンを除いて、以下のア ミンをこれらの塩酸塩として試験した：アルギニン、ドデシルアミン、およびピ ペラジン(ミズリー州セントルイスのシグマケミカル社)、エチレンジアミン、ト リエチルアミンおよびトリエチレンテトラアミン(ミズリー州セントルイスのア ルドリッチ ケミカル社)、およびメチレンブルー(ニュージャージィー州フェア ローンのフィッシャー サイエンティフィック社)。塩基は、１分子当たり反応 性第一、第二または第三アミノ基1-4 個をもたらすように選択され、したがって 多官能性アミンの場合、酸性ポリマー鎖の間およびその中で複数の塩橋の形成が できるようになる。 ロタウィルス感染力における様々な陰イオンポリマーおよびアミンの効果：ウ シロタウィルス菌株 WC3(5.0 ×10⁸pfu/ml)の細胞培養ストックを、0.9 % NaCl 、陰イオンポリマーの0.05N 水性ナトリウム塩、またはアミンの水性0.05M 塩の いずれかで1:50に希釈した(pH 7.0 に調節)。混合物を、プラーク分析により ロタウィルス感染力におけるこれらの効果について滴定した。 水溶性ポリマーおよびアミンのマイクロカプセル形成能力および疑似胃酸にお ける分解に耐える能力：ロタウィルスを不活化しないポリマーおよびアミンを、 疑似胃酸中での分解に耐えるマイクロカプセルを形成する能力を測定するために 、組合せて試験した。６個の水溶性陰イオンポリマーを7 個の水性アミンと組合 せて試験した(42 個の組合せが可能)。最初に、陰イオンポリマーの水性ナトリ ウム塩1 mlを、水性アミン塩酸塩（または酢酸塩）1 mlへ滴加して界面沈殿を形 成する能力を測定した。次いで、固体物質を生じる組合せを用いてマイクロカプ セルを作った。マイクロカプセルは、アルギン酸カルシウムマイクロカプセルの 製造について既に記載されたものと同様の方法（米国特許第4,744,933 号）で、 アミン塩の水溶液へほぼ5 μmの大きさの小滴として、陰イオンポリマーのナト リウム塩を分散させることにより形成された。マイクロカプセルの短期安定性は 、水溶液中で5 日間室温で観察することにより試験された。室温で安定なマイク ロカプセルは37℃で2 時間疑似胃酸(pH 1.2)で処理された。 安定なモノ- またはオリゴ- 分散マイクロカプセルを提供する酸性ポリマーお よびアミンの組合せは、ポリマーの酸性繰り返し単位の当量に対するアミンの化 学当量の比を32:1から1:32の範囲で変えることにより最適化された。マイクロカ プセルの最大安定容量を提供する反応物の比を選択した。 マイクロカプセルのサイズは、光学顕微鏡により公知サイズのラテックスビー ズ(カリフォルニア州パロ アルトのデューク サイエンティフィック社(DukeSc ientific Corp.，Palo Alto，CA)と比較することにより測定された。 感染ウィルスを捕捉するためのアルギン酸ナトリウム- スペルミン塩酸塩マイ クロカプセルの能力： WC3 の透明な細胞培養物ストック(6 x10⁶pfu/ml)の5ml アリコートを、0.68 m M アルギン酸ナトリウム 5mlへ添加し、0.55 mM スペルミン塩酸塩 20ml へ、名 目上5 μm の小滴として分散させた。ロタウィルスを含有するはずのマイクロカ プセルを600 xgで遠心分離し、蒸留水で数回洗浄し、8.0M燐酸ナトリウム（pH 7 .0）で分解させた。分解（ロタウィルス含有マイクロカプセルの）後に得られる 洗浄液および液体からの上澄み液をプラーク分析により感染ウィルスの存在に ついて試験した。上記実験において放出されたウィルスがマイクロカプセルのマ トリックス表面またはその中に存在するかどうかを測定するために、細胞培養物 由来のWC3 の3 x 10⁷pfu（1 ml の容量）を、予め形成したウィルスを含まない スペルミン- アルギネートマイクロカプセル（プラセボビーズ）へ添加した。ウ ィルスは室温で30分間吸着した。ウィルスを添加したプラセボビーズを洗浄し、 分解させそして上澄み液を上記したように感染ウィルスの存在について試験した 。 コア充填の測定およびマイクロカプセル封入方法のコア充填効率：マイクロカ プセルに含まれるロタウィルス抗原の量をELISA で測定した。簡単に言えば、96 - 凹部を有する、平底プレート（コースター）の個々の凹部に、1.5mM Na₂CO₃お よび3.5 mM NaHCO₃中に1:1,000 に希釈したモルモット抗- WC3 高度免疫抗血清1 00 μl を一晩塗布した。凹部を、蒸留水に1.73 M NaCl、0.03 M KH₂PO₄、0.13 M Na₂HPO₄および0.025 % トゥイーン20を含む緩衝液（洗浄緩衝液）で5 回洗浄 した。BPS 中に0.5%(v/v)ゼラチンおよび0.05 %トゥイーン20を含む緩衝液(ブロ ック緩衝液)200 μl を、各凹部へ添加した。凹部を洗浄緩衝液で3 回そして蒸 留水で2 回洗浄し、そして分解したロタウィルス含有マイクロカプセル調製物か らの液体100 μl を各凹部へ添加し、室温で1 時間インキュベーションした。凹 部を洗浄緩衝液で5 回洗浄し、そしてウサギ抗WC3 高度免疫抗血清100 μlを各 凹部へ添加し、そして室温で1 時間インキュベーションした。凹部を洗浄緩衝液 で5 回洗浄し、ホスファターゼ結合ヤギ抗- ウサギ IgG（ノースカロライナ州、 ダルハムのオルガノンテクニカ(Organon Teknika,Durham，N.C.)）の1:2,000 希 釈液(1 % BAS中)100 μl を各凹部へ添加し、室温で1 時間インキュベーション した。洗浄緩衝液で5 回洗浄後、1 M ジエタノールアミン＋0.1 %(wt/wt)p-ニト ロフェニルホスフェート100 μl を各凹部へ添加し、プレートを37℃にて1 時間 140rpmで攪拌した。エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム50μl を各凹部へ 添加し、比色の変化を、マイクロプレートリーダー（Microplate reader）2000( メリーランド州ウォーカーズビレのバイオホワイタッカー(BioWhittaker，Walke rsville，MD))において、450nm で分析した。ロタウィルス抗原濃縮物を、公知 濃度の精製ロタウィルスを用いて生じる標準曲線と比較することにより測定した 。 ローダミン標識化マイクロカプセルを用いたマウスの接種および腸間附属リン パ組織(GALT)におけるマイクロカプセルの分布：50 mM 重炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 9.5)中の濃度1 mg/ml のローダミンイソチオシアネート(RITC，ミズリー州 、セントルイスのシグマケミカル社)を等量で混合してアルギン酸ナトリウムと 結合させた；反応は室温で2 時間暗所で行った。次いでアルギン酸ナトリウム- RITCを消滅するまで蒸留水で透析し、スペルミン- アルギネートマイクロカプセ ルの形成に使用した。RITC標識化マイクロカプセルを、使用前に蒸留水で5 回洗 浄した。 8 週齢の雌 C57BL/6マウスに、20mgのローダミン標識化マイクロカプセルまた は20mgのローダミン標識化アルギン酸ナトリウムを、近位食道挿管法(proximale sophageal intubation)により経口接種した。接種後 1、4、7、14、21および28 日目に各グループから二匹のマウスを屠殺し、パイエル班(Peyer's patches)(PP )、腸間膜リンパ節(MLN)および脾臓を摘出しそして手で裂いた。（脾臓赤血球は AKC培地(0.16M NH₄Cl,0.01 M KHCO₃，pH 7.2)で溶解させた）。すべての組織か らの細胞を、5 分間600 xgにて遠心分離し、RPMI 1640(メリーランド州ガイサー スバーグのジブコ(GIBCO，Gaithersburg，MD))中で3 回洗浄し、滅菌した非吸収 性綿のカラムに通過させた。各組織(100ｌの容量)からの1x10⁴細胞をサイトスピ ン(Cytospin)2（ペンシルバニア州、ピッツバーグのシャンドン社(Shandon Inc. ,Pittsburgh，PA.)）を用いて、1200rpm の速度で5 分間遠心分離して顕微鏡ス ライドへ移した。スライドを24時間風乾して、各細胞集団におけるローダミン標 識化細胞の頻度を、520 nmの波長にて蛍光顕微鏡で測定した(ディアルックス（D ialux）20、ドイツ国、リッツ（Leitz，Germany））。 腹膜滲出物細胞によるローダミン標識化マイクロカプセルの吸収：腹膜滲出物 細胞を、RPMI1640培地 5mlで腹腔内接種後に成人C57BL/6 マウスから得た。滲出 物細胞をRPMI1640で2 回洗浄し、10% FBS を含むRPMI1640 1ml につき1x10⁵細胞 の濃度で再懸濁した。1x10⁴個の細胞を、5%CO₂インキュベーターにおいて37℃に て10分間ローダミン標識化スペルミン- アルギネートマイクロカプセルほぼ5mg とともにインキュベーションした。細胞をPBS で2 回洗浄し、フルオレセインイ ソチオシアネート(イリノイ州、インディアナポリスのベーリンガーマンハイ ム(Boehringer Mannheim，Indianapolis,IN.))と結合した抗- MAC 1(抗- CD11b) 抗体のPBS において1:100 希釈液で室温で1 時間染色した。細胞をPBS 中で洗浄 し、グリセロール- PBS（英国、ロンドンのシティフロール社(Citifluor,Citifl uor Ltd.，London，U.K.)）に入れ、波長580nm（フルオレセイン標識物の検出の ため）および520nm（ローダミン標識物の検出のため）で蛍光顕微鏡により検査 した。 ロタウィルス含有マイクロカプセルまたは遊離ウィルスをマウスに接種後の間 接免疫蛍光法によるGALTにおける細胞内ロタウィルス特異的たんぱく質の検出： 8 週齢のC57BL/6 マウス4 匹からなる二グループに、遊離またはマイクロカプセ ル封入したWC3 ウィルスのいずれかを、マウス1 匹当たりほぼ1x10⁷pfu で経口 接種した。各群からの一対のマウスを接種後1 または4 日してから屠殺し、PP、 MLN および脾臓を摘出した。これらの組織からの細胞を集め、前記したように顕 微鏡スライドへ遠心分離した。スライドをメタノール中で10分間固定し、風乾し 、そしてPBS 中で1:2,500 に希釈したウサギポリクローナル高度免疫抗- WC3 血 清100 μl で1 時間インキュベーションした。スライドをPBS で洗浄し、PBS 中 で1:100 に希釈したフルオレセイン結合ブタ抗- ウサギ免疫グロブリン（カリフ ォルニア州、カーペンテリアのダコ社(Dako corporation，Carpenteria，CA)）1 00 μl で1 時間インキュベーションした。スライドをPBS で洗浄し、グリセロ ール- PBS で固定し、そして蛍光顕微鏡により検査した。 マイクロカプセル封入または遊離ウィルスを用いたマウスの経口または腸管外 接種後のELISA によるロタウィルス特異的抗体の検出：2 -4匹のマウスの群は、 1）マイクロカプセル封入 WC3ロタウィルスまたは遊離 WC3のマウス一匹あたり5 x10⁴または1x10⁴pfuで腹腔内接種したもの、2）マイクロカプセル封入 WC3また は遊離WC3 をマウス一匹あたり2.5x10⁶または6.25x10⁵pfuで経口接種したもの、 3）マイクロカプセル封入 RRVロタウィルスまたは遊離 RRVをマウス一匹あたり6 .25x10⁴または1.25x10⁴pfuで経口接種したもの、または 4）疑似感染細胞培養物 上澄み液の等量で経口接種したものであった。接種後3 週間してから血清を眼窩 後部毛管網状組織穿刺により得、以下のようにELISA によりロタウィルス結合Ig G の存在について試験した：96凹部を有する平底プレートの個々の凹部に、 いずれかPBS または容量100 μl のPBS 中で希釈した精製 WC3もしくは RRV200n gを塗布した。プレートを4 ℃で一晩貯蔵した。プレートをPBS で4 回洗浄し、P BS 中で希釈した1% BSA 200μl を各凹部へ添加して室温で1 時間インキュベー ションした。複数の凹部をPBS で4 回洗浄し、抗血清の2 倍の希釈物（1:100の 希釈率で開始）100 μl を各凹部へ添加して室温で1 時間インキュベーションし た。凹部を PBSで4 回洗浄し、そして1% BSAにおいて1:2,000 に希釈されたホー スラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗- マウスIgG(アラバマ州、ビルミン ガムのサザンバイオテクノロジー社（Southern Biotechnology Associates，Bir mingham，AL.）)を、各凹部へ添加して室温で1 時間インキュベーションした。 凹部を PBSで4回洗浄し、そして0.04 %テトラメチルベンジジンペルオキシダー ゼ溶液(メリーランド州、ガイザースバーグのキールケガードアンドペリー(Kier kegaard and Perry，Gaithersburg，MD.))100 μl を添加し、5 分間インキュベ ーションした。85% 燐酸溶液75μl を各凹部へ添加して、マイクロプレートELIS A リーダーにおいて450nm の波長で比色の変化を測定した。血清は、ウィルス塗 布凹部におけるOD値がウィルス抗原で塗布してない凹部のOD値より >0.1大きい 単位である場合、陽性と考えられた。 結果- ロタウィルスにおけるウィルス水溶性陰イオンポリマーおよびアミンの効 果：ロタウィルス感染力における効果が実質的にないことがアルギン酸、セルロ ルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、メチレンブルーおよびスペルミン について見出された。感染力における2.5-10倍の低下がヘパリン、トリエチルア ミン、トリエチレンテトラミン、アルギニン、エチレンジアミンおよびオクタデ シルアミンについて記載された。感染力における30倍の低下がピペラジンで観察 され、アラビン酸については300 倍の低下、およびドデシルアミンについては感 染力の完全な除去が観察された。 水溶性ポリマーおよびアミンの疑似胃酸による分解に耐性のあるマイクロカプ セル形成能力：ロタウィルス感染力における最低効果を示す6 個の水溶性陰イオ ンポリマーおよび7 個の水性アミンを、疑似胃酸による分解に耐性のある安定な 、オリゴ- 分散マイクロカプセルを形成する能力について組合せて試験した（42 個 の組合せが可能）；ポリマーおよびアミンの42個の可能性のある組合せのうち14 個は疑似胃酸において安定なマイクロカプセルを形成した。これらの組合せは、 メチレンブルーとセルローススルフェートまたはセルロースアセテートフタレー トのいずれか、スペルミンとアルギン酸またはセルローススルフェートのいずれ か、トリエチレンテトラミンとアルギン酸またはセルローススルフェートのいず れか、またはオクタデシルアミンとアルギン酸、セルローススルフェート、カル ボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリアクリル酸、 アルギン酸ナトリウム- スペルミン塩酸塩マイクロカプセルの感染ウィルスを 捕捉する能力：アルギン酸ナトリウムおよびスペルミン塩酸塩から作られたマイ クロカプセルは、1）アルギン酸ナトリウムもスペルミン塩酸塩のいずれもロタ ウィルスの感染力を低下させない、2）この組合せは単分散のマイクロカプセル を最も簡単に形成する、3）この組合せはカプセル材料の最大容量を提供するの で、さらに研究するために選択された。感染ロタウィルスがマイクロカプセル内 に含まれるかどうかを測定するために、WC3 ウィルスをスペルミン- アルギン酸 塩マイクロカプセルに封入しそしてマイクロカプセルを数回洗浄した後で分解す ることにより感染ウィルスの存在について試験した。感染ウィルスは3 回洗浄後 に上澄み液には検出されなかったが、しかしマイクロカプセル分解時には明らか に放出された。さらに、感染ウィルスがマイクロカプセルの中または表面上に位 置するかどうかを測定するために、ウィルスを、同様の方法で洗浄しそして分解 した予め形成されたマイクロカプセルへ添加した。感染ウィルスは、ウィルスを 添加した予め形成されたマイクロカプセルの分解後に放出されなかった。したが って、感染ロタウィルスはマトリックス内に位置し、スペルミン- アルギン酸塩 マイクロカプセルの表面だけではなかった。 カプセル封入方法の効率、コア充填能力およびマイクロカプセルの物理的特性 ：三つの別々の実験において、感染ウィルスの初期量の1.0%、2.0%および6.3%が スペルミン- アルギン酸塩マイクロカプセルのマトリックス内に封入されている ことが見出された。同様に、ウィルス抗原の初期量の2.0%- 5.0%がマイクロカプ セルに捕捉されていた。したがって、コア充填効率は両方の感染ウィルスおよび ウィルス抗原についても同様であった。コア充填能力（すなわち、ビーズ材料の 量で割ったウィルス抗原の量(wt/wt)）は、ほぼ2.0%- 3.0%であった。光学顕微 鏡による公知サイズのラテックスビーズと比べて、マイクロカプセルの大多数は ほぼ2 μm の大きさであり、1-10μm の範囲の大きさであった。 腹膜マクロファージによるローダミン標識化マイクロカプセルの吸収：ローダ ミン標識化スペルミン- アルギン酸塩マイクロカプセルは、その表面にMAC 1(CD 1 lb)を有する腹膜滲出細胞においてのみ検出された。腹膜滲出細胞の調製物に おいて、すべてのMAC１を有する細胞のほぼ50%- 60%がローダミン標識化マイク ロカプセルを吸収した。 マウスの経口接種後のGALTにおけるローダミン標識化マイクロカプセルの分布 ：成人 C57BL/6マウスに、各々ローダミン標識化スペルミン- アルギン酸塩マイ クロカプセルほぼ20 mg を経口接種した。ローダミン標識化マイクロカプセルは 、経口接種後少なくとも28日までに、PP,MLNおよび脾臓の細胞内で検出された。 PPおよび MLNにおけるマイクロカプセルの最大量は接種後4 日で検出され、脾臓 では接種後14日で検出された。ローダミン標識化細胞は、ローダミン標識化アル ギン酸ナトリウムを各々20 mg 経口接種した動物のPP、MLN または脾臓では検出 されなかった。したがって、ローダミン標識化マイクロカプセルで接種後のGALT におけるローダミン標識化細胞の存在は、腸管粘膜表面でのマイクロカプセルの 分解およびローダミン標識化アルギン酸ナトリウムの吸収のためではなく、むし ろビーズの活性貪食のためであった。 ロタウィルス含有マイクロカプセルまたは遊離ウィルスでマウス接種後の間接 的イムノフルオレセインによるGALTにおけるロタウィルス特異的たんぱく質の検 出：成人 C57BL/6マウスに、遊離またはマイクロカプセル封入ロタウィルス菌株 WC3 のいずれかを、マウス一匹に付き1.0x10⁷pfuの投与量で経口接種した。接種 後1 日および4 日してから、動物を屠殺し、PP、MLN および脾臓の細胞を間接的 イムノフルオレセインによりロタウィルス特異的たんぱく質の存在について試験 した。マイクロカプセル封入ウィルス接種後1 日および4 日の両方とも、PP、ML N および脾臓から得られた10⁴個細胞につき、ロタウィルス特異的たんぱく質を 含む細胞3-5 個が検出された。細胞含有ロタウィルス抗原は遊離ウィルスを接種 した動物からのリンパ組織には検出されなかった。 ロタウィルス免疫原性におけるマイクロカプセル封入の効果：感染ロタウィル スのカプセル封入がロタウィルスの免疫原性を強化するかどうかを測定するため に、成人 C57BL/6マウスにマイクロカプセル封入または遊離RRV を腹腔内接種し 、７日齢の CD2(F1)乳児マウスに遊離もしくはマイクロカプセル封入 WC3または RRV のいずれかの異なった投与量を経口接種した。３週間後に血清を得、ELISA によりロタウィルス特異的IgG の存在について試験した。疑似感染した動物は一 様にロタウィルス特異的IgG 力価が <1:100 であった。動物は、力価が1:400(す なわち、疑似感染動物において検出されたもの以上に力価が少なくとも4 倍上昇 )以上またはそれと同等である場合ロタウィルス特異的免疫反応を有すると考え られた。マイクロカプセル封入 WC3を 5.0x104または1.0x104 pfu で腸管外接種 された動物4 匹のうち3 匹は検出可能なロタウィルス結合IgG を発現したが、遊 離WC3 の等量を接種された動物4 匹はいずれも発現しなかった。同様に、マウス 1 匹あたり1.25x10⁴pfu の投与量でRRV を経口接種されたマウス3 匹のうち3 匹 ともロタウィルス特異的IgG を発現したが、遊離ウィルスを同等量で接種したマ ウスではいなかった。マウス1 匹あたり6.25X10⁵pfuの投与量でマイクロカプセ ル封入WC3 を経口接種されたマウス4 匹のうち3 匹はロタウィルス特異的IgG を 発現したが、遊離ウィルスを同等量で接種したマウスは4 匹中 0であった。 この実施例は、感染ロタウィルスが水系システムを用いてマイクロカプセル封 入されうることを示す。充填したフィルムマイクロカプセル封入方法の穏やかな 性質は、有機溶媒の使用を必要とする方法よりもヒトおよび細胞免疫反応の誘起 に必要なウィルスエピトープを保持することが期待できる。充填フィルムマイク ロカプセルのさらに幾つかの特長は抗原伝達システムとしての使用に魅力的であ る。先ず、マイクロカプセルは安全で生物分解可能として一般的に考えられる材 料から水性媒体中で作られる。アルギン酸ナトリウム、ケルプから抽出されるゲ ル化多糖類は、通常アイスクリーム、ソフトドリンク、およびサラダドレッシン グに安定剤および増粘剤として使用される。スペルミン、スペルミジンの誘導体 は、実際にはすべての哺乳動物細胞において見出されるポリアミンである。第二 に、マイクロカプセルは胃酸による分解に抵抗するように作ることができる。第 三に、マイクロカプセルは抗原の効率的捕捉ができるような内部容量フラクショ ンを有する。 インフルエンザたんぱく質含有PLCGマイクロカプセルに対しほぼ1%であること と比べ2.0-3.0%のロタウィルス抗原に対するコア充填能力が見出された。第四に 、マイクロカプセル封入は室温またはそれ以下で行われる；カプセル封入されな い感染ウィルスを直ちに除くことができる。最後に、マイクロカプセルは簡単に 凍結乾燥することができ、安価に作られ、容易に市販の規模拡大に適合させるこ とができ、そして滅菌調製することができる。 マウスへ投与する場合、より多数の蛍光スペルミン- アルギン酸塩マイクロカ プセルが、経口接種してから4 日目にPPおよびMLN で検出され、そして接種後14 日目に脾臓で検出された。これらの見地は、PLCGマイクロカプセルを経口接種さ れたマウスにおいてすでに記載されているものとほぼ同じである(エルドリッジ 、ジェイ．エッチ.（Eldridge，J.H）ら、1989 Curr．Top．Microbiol．Immunol ．146:59-66; エルドリッジ、ジェイ．エッチ．ら、1990 J．Controlled Relea se 11：205-214; エルドリッジ、ジェイ．エッチ．ら、1991 Mol．Immunol．28: 287-294)。PLCGマイクロカプセルのPPへの吸収は、マイクロカプセルのサイズお よび疎水性に依存する。10μm 以上の直径を有するPLCGマイクロカプセルはM 細 胞には吸収されずPPへ吸収された。直径5-10μm の範囲のPLCGマイクロカプセル はPPにおいて検出されるだけで、直径 <5 μm のものはPP、MLN および脾臓にお いて検出された。スペルミン- アルギン酸塩マイクロカプセルの平均粒径(すな わち、2 μm)は、PP、MLN および脾臓へのビーズの吸収と一致する。 蛍光スペルミン- アルギン酸塩マイクロカプセルは、たぶんPP内でマクロファ ージにより吸収される。その表面にMAC 1(CD11b)を有するこれらの腹膜滲出細胞 においてのみローダミン標識化マイクロカプセルが検出されることは、これを支 持する。同様に、マクロファージは、フルオレセイン標識化PLCGマイクロカプセ ルを含む細胞の表面においてMAC１の存在により測定されるように、PLCGマイク ロカプセルを飲み込む。PP内でマイクロカプセルを含むマクロファージがMLN お よび脾臓へ移行するかまたは遊離マイクロカプセルがリンパ系を介してMLN へ移 行するか血液流れを介して脾臓（ここでこれらは局所マクロファージにより飲み 込まれる）へ移行するかを測定することが残っている。マクロファージはPPにお いてすべての細胞の約5-9%である。したがって、PPにおけるすべての細胞の1.8% までにローダミン標識化スペルミン- アルギン酸塩マイクロカプセルが検出され ることは、マイクロカプセルが利用可能なマクロファージの20-35%に吸収されて いることを示す。 ロタウィルス特異的たんぱく質は、遊離ウィルスではなくマイクロカプセル封 入ロタウィルスを経口接種されたマウスのGALTにおいて検出された。マイクロカ プセル封入ロタウィルスを接種後のロタウィルス特異的たんぱく質の検出は、遊 離ウィルス接種後に吸収されるより多量のウィルスの抗原表示細胞（ビーズを吸 収）への伝達と一致する。しかしながら、これらの実験において接種された遊離 ウィルスの量は、ヒト免疫反応を引き起こすのに適切であった。GALT抗原表示細 胞（遊離ウィルスを接種された動物において）内でのロタウィルス特異的たんぱ く質を検出することが不可能であることは、多分、抗原が異種宿主ウィルス感染 後に検出されるのにあまりにも少ない量で生じるかまたは細胞の数があまりにも 少ないという事実を反映する。ロタウィルス特異的抗原は、同種宿主（すなわち ネズミ）ロタウィルスでマウス乳児に経口接種後にGALTにおいて検出された。 マイクロカプセル封入ロタウィルスをマウスに経口または腸管外接種すると、 ウィルス特異的抗体反応を引き起こす。これは遊離ウィルスの同じ量を接種後に 起こされるよりも大きな規模であった。 上記に本発明の特定の実施態様が記載されおよび／または例示されているが、 様々な他の実施態様も外部の開示から当業者には明らかである。したがって、本 発明は記載および／または例示されている特定の実施態様に制限されるものでは ないが、しかし添付の請求の範囲から逸脱することのない限りかなりの変形およ び修正も可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/505 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/505 31/52 9454−4Ｃ 31/52 31/57 9454−4Ｃ 31/57 31/65 9454−4Ｃ 31/65 31/70 9551−4Ｃ 31/70 35/76 8115−4Ｃ 35/76 38/00 9455−4Ｃ 39/00 Ｇ 38/16 9455−4Ｃ 39/39 38/27 7433−4Ｃ 47/40 Ｂ 38/28 9051−4Ｃ 37/02 38/46 9051−4Ｃ 37/54 39/00 9051−4Ｃ 37/26 39/39 9051−4Ｃ 37/36 47/40 9051−4Ｃ 37/14 (31)優先権主張番号 ０８／２２９，５２０ (32)優先日 1994年４月18日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クラーク，フレッド・エイチ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19130, フィラデルフィア，コリンシアン・ストリ ート 836 (72)発明者 オフィット，ポール・エイ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19146, フィラデルフィア，サウス・トゥエンティ フィフス・ストリート 410 (72)発明者 モサー，シャーロット・エイ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19020, ベンサレム，エサン・アレン・コート 3240 (72)発明者 スピーカー，タリー・ジェイ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19103, フィラデルフィア，チェリー・ストリート 2112

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カプセル壁に囲まれた水性コアを含むマイクロカプセルであって、前記マイ クロカプセルが非- 水性汚染物質を実質的に含まず、前記カプセル壁が選択され た水溶性陰イオンポリマーもしくはその水溶性塩と選択された水溶性アミンまた はその水溶性塩との反応生成物からなり、前記陰イオンポリマーおよび前記アミ ンは、対となるポリマーの水溶液の小滴が対となるアミンの水溶液へ導入された 時に陰イオンポリマーのアミン塩の安定したマイクロカプセルが形成されるよう な特性を有する一対の陰イオンポリマーとアミンから選択されるものである前記 マイクロカプセル。 ２．陰イオンポリマーが反応性カルボキシレートまたはスルフェート基を有し、 アルギン酸、発蛍光団と結合したアルギン酸、アラビン酸、セルローススルフェ ート、カルボキシメチルセルロース、カラジーナン、コンドロイチンスルフェー ト、ヘパリン、ポリアクリル酸、ポリオキシエチレン架橋ポリアクリル酸および ポリビニルカルボン酸からなる群から選択される請求項1 のマイクロカプセル。 ３．発蛍光団が、フルオレセインイソチオシアネートおよびローダミンイソチオ シアネートから選択される請求項2 のマイクロカプセル。 ４．塩基が、アルギニン、デシルアミン、ドデシルアミン、エチレンジアミン、 ピペラジン、メチレンブルー、オクタデシルアミン、トリエチルアミン、トリエ チレンテトラミンおよびスペルミンからなる群から選択されるモノ-、ジ-、トリ - またはテトラ- アミノ化合物である請求項1 のマイクロカプセル。 ５．陰イオンポリマーが、ポリアクリル酸、ポリビニルカルボン酸、アルギン酸 、ポリオキシエチレン架橋ポリアクリル酸、セルローススルフェート、カルボキ シメチルセルロース、ヘパリンおよびコンドロイチンスルフェートから選択され 、そしてアミンがスペルミン、デシルアミン、ドデシルアミン、テトラデシルア ミン、メチレンブルー、ヘキサデシルアミンおよびオクタデシルアミンから選択 される請求項1 のマイクロカプセル。 ６．陰イオンポリマーが、ポリアクリル酸、ポリビニルカルボン酸およびセルロ ーススルフェートから選択され、そしてアミンがエチレンジアミンおよびトリエ チレンテトラミンから選択される請求項1 のマイクロカプセル。 ７．陰イオンポリマーが、ポリビニルカルボン酸、ポリアクリル酸またはアルギ ン酸であり、アミンがトリエチルアミン、アルギニンまたはピペラジンである請 求項1 のマイクロカプセル。 ８．陰イオンポリマーがアラビン酸であり、アミンがデシルアミン、ドデシルア ミン、テトラデシルアミン、メチレンブルー、ヘキサデシルアミンおよびオクタ デシルアミンから選択される請求項1 のマイクロカプセル。 ９．前記マイクロカプセルが非- 水性汚染物質を実質的に含まず、カプセル壁が 以下の反応生成物： a) メチレンブルーまたはその水溶性塩とセルローススルフェートまたはその 水溶性塩； b) メチレンブルーまたはその水溶性塩とセルロースアセテートフタレートま たはその水溶性塩； c) スペルミンまたはその水溶性塩とアルギン酸またはその水溶性塩； d) スペルミンまたはその水溶性塩とセルローススルフェートまたはその水溶 性塩； e) スペルミンまたはその水溶性塩とコンドロイチンスルフェートまたはその 水溶性塩； f) トリエチレンテトラアミンまたはその水溶性塩とアルギン酸またはその水 溶性塩； g) トリエチレンテトラアミンまたはその水溶性塩とセルローススルフェート またはその水溶性塩； h) オクタデシルアミンまたはその水溶性塩とアルギン酸またはその水溶性塩 ； i) オクタデシルアミンまたはその水溶性塩とセルローススルフェートまたは その水溶性塩； j) オクタデシルアミンまたはその水溶性塩とカルボキシメチルセルロースま たはその水溶性塩； k) オクタデシルアミンまたはその水溶性塩とセルロースアセテートフタレー トまたはその水溶性塩； l) オクタデシルアミンまたはその水溶性塩とポリアクリル酸またはその水溶 性塩；または またはその水溶性塩； を含む前記カプセル壁に囲まれた水性コアを含む請求項1 のマイクロカプセル。 10．前記カプセル壁がスペルミンまたはその水溶性塩とアルギン酸またはその水 溶性塩との反応生成物である請求項9 のマイクロカプセル。 11．前記カプセル壁がスペルミンまたはその水溶性塩とコンドロイチンスルフェ ートまたはその水溶性塩との反応生成物である請求項9 のマイクロカプセル。 12．陰イオンポリマーが平均分子量10 kD以上である請求項1-10のいずれか1 の マイクロカプセル。 13．0.1-2,000 μの範囲の粒子径を有する請求項1-10のいずれか1 のマイクロカ プセル。 14．前記水性コアに有効成分を含む請求項1-10のいずれか1 のマイクロカプセル 。 15．前記有効成分が、天然産生およびバイオテクノロジー技術により誘導される たんぱく質性物質；天然産生およびバイオテクノロジー技術により誘導される非 - たんぱく質性巨大分子；細胞；薬物および抗生物質；ならびに染料および顔料 からなる群から選択される請求項14のマイクロカプセル。 16．前記たんぱく質性物質がグルコース6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、カル シトニン、エリスロポイエチン、ヘモグロビン、インシュリン、インターロイキ ン、ソマトトロピン、およびバチルス スリギエンシス(Bacillus thurigiensis )の殺幼虫性たんぱく質から選択される請求項15のマイクロカプセル。 17．前記非- たんぱく質性巨大分子がヘパリンである請求項15のマイクロカプセ ル。 18．前記細胞がヒトまたは他の種からの膵臓ランゲルハンス島細胞、肝細胞およ びインターロイキン- および他の免疫調節因子- 分泌細胞から選択される請求項 15のマイクロカプセル。 19．前記薬物および抗生物質がフルオロウラシル、プレドニゾロン、インドメサ シン、テトラサイクリン、テオフィリンおよびニコチンアミドから選択される請 求項15のマイクロカプセル。 20．前記染料および顔料がブルーデキストラン、フェノールレッドおよび活性炭 から選択される請求項15のマイクロカプセル。 21．前記有効成分が免疫原性物質である請求項14のマイクロカプセル。 22．前記免疫原性物質が、たんぱく質、ペプチド、ウィルス粒子、原核生物、原 生動物および多細胞寄生生物からなる群から選択される少なくとも一つの構成員 である請求項21のマイクロカプセル。 23．前記有効成分がロタウィルスである請求項14のマイクロカプセル。 24．前記ロタウィルスが以下のもの：ウシ WC3（ATCC 受託番号 VR-2102）；HC R3a（ATCC 受託番号 VR-2325）；ヒト vp4 W179 で修飾されたウシ WC3；ヒトW 178-8で修飾されたウシ WC3；ヒトW179-9で修飾されたウシ WC3、(ATCC 受託番 号 VR-2194およびVR-2196)またはSC2-9(ATCC 受託番号 VR-2417)；ヒトWI79-4, 9で修飾されたウシ WC3(ATCC 受託番号 VR-2415)およびWI79-4で修飾されたも の(ATCC 受託番号 VR-2377)；ヒトvp4 DS1 で修飾されたウシ WC3(ATCC 受託 番号 VR-2416)；ヒトブリコウト(Bricout)B-9 で修飾されたウシ WC3；ヒト vp4 ブリコウト Aで修飾されたウシ WC3；ヒトW179-9で修飾された HCR3a(ATCC 受託番号 VR-2324)；アカゲザルロタウィルス RRV ;ヒトWa-9 で修飾されたRRV ；ヒトDS1-9 で修飾されたRRV ；ヒトP-9 で修飾されたRRV ；およびヒトST3-9 で修飾されたRRV から選択される請求項23のマイクロカプセル。 25．500-1,000 μの範囲の粒子径を有する請求項14のマイクロカプセル。 26．1-10μの範囲の粒子径を有する請求項14のマイクロカプセル。 27．凍結乾燥形である請求項14のマイクロカプセル。 28．腸溶性皮膜を有する請求項14のマイクロカプセル。 29．前記腸溶性皮膜がセルロースアセテートフタレートおよびポリオキシエチレ ン架橋ポリメタアクリル酸から選択される物質からなる請求項28のマイクロカプ セル。 30．次の工程： a) 選択した陰イオンポリマーまたはその塩を水に溶かして陰イオンポリマー 溶液を作り； b) 選択したアミンまたはその塩を水に溶かしてアミン溶液を作り； c) 陰イオンポリマー溶液をアミン溶液へ小滴状でまたは中断される細い流れ で添加し； d) マイクロカプセルを得る からなる請求項1 の水性コアのマイクロカプセルの製造方法。 31．前記陰イオンポリマー溶液が少なくとも2.5 センチポアズの粘度を有する請 求項30の方法。 32．工程 c)を行う前に工程 a)の陰イオンポリマー溶液に有効成分を溶解また は懸濁させる工程をさらに含む請求項30の方法。 33．陰イオンポリマー溶液が添加されるアミン溶液の少なくとも一部が動いてい る請求項30の方法。 34．陰イオンポリマー溶液を前記アミン溶液へ加える時に前記ポリマー溶液へ超 音波刺激を加える請求項30の方法。 35．前記ポリマー溶液を前記アミン溶液へ添加する直前に前記ポリマー溶液の細 く流れる流れを機械的に中断することにより殆ど均一な径のポリマー溶液の小滴 を作ることからなる請求項30の方法。 36．前記ポリマー溶液の細い流れを超音波刺激により中断することからなる請求 項35の方法。 37．以下の工程： a) 水溶性陰イオンポリマーまたはその水溶性塩および水溶性アミンまたはそ の水溶性塩を選択し、前記陰イオンポリマーおよび前記アミンは対となるポリマ ーの水溶液の小滴を対となるアミンの水溶液へ入れた時に陰イオンポリマーのア ミン塩の安定したマイクロカプセルが形成されるような特性を有する一対の陰イ オンポリマーとアミンから選択され； b) 前記選択した陰イオンポリマーまたはその塩を水に溶かして少なくとも2. 5 センチポアズの粘度を有する陰イオンポリマー溶液を作り； c) 前記選択したアミンまたはその塩を水に溶かしてアミン溶液を作り； d) 前記陰イオンポリマー溶液の小滴を作り； e) 陰イオンポリマー溶液の前記小滴を前記アミン溶液へ添加し； f) 前記小滴および前記アミン溶液を互いの界面で殆ど即座に反応させて前記 選択した酸および選択した塩基の塩のフィルムを含むマイクロカプセルを作るか らなる少なくとも一つのマイクロカプセルの製造方法。 38．さらに次の工程： a) 前記陰イオンポリマー溶液の連続する小滴の接触を、前記連続する小滴の 各々に関して前記工程 f)が実質的に終了するまで避けるような方法で前記工程( d)- (f)を迅速な順番で繰り返し実施し、 b) 前記マイクロカプセルを集める を含む複数のマイクロカプセルを作る請求項35の方法。 39．前記工程 d)を、前記陰イオンポリマー溶液の下に向かって流れる流れへ脈 動するエネルギーを施すことにより実施する請求項38の方法。 40．前記脈動するエネルギーが音波信号の使用によりもたらされ、その際前記得 られたマイクロカプセルが均一な粒子径である請求項39の方法。 41．前記工程 d)が前記陰イオンポリマー溶液の細かいスプレーを形成すること により実施される請求項38の方法。 42．さらに工程 d)を実施する前に、工程 b)の陰イオンポリマー溶液中に有効成 分を溶解または懸濁する工程を含む請求項37の方法。 43．さらに、工程 d)を実施する前に、工程 b)の陰イオンポリマー溶液中に有効 成分を溶解または懸濁する工程を含む請求項38の方法。 44．請求項1 のマイクロカプセルを製造するための装置において、前記マイクロ カプセルが均一径であり、前記装置は選択した陰イオンポリマー溶液の小滴を選 択したアミン溶液の流れへ導入するために適合するようにしたものであって、該 装置が次のもの： 管状部材であって、該記部材は前記アミン溶液のための側肢入口セグメント および交差する垂直セグメントを含み、該垂直セグメントは前記側肢セグメント と連結する側入口および陰イオンポリマー溶液を受ける上面開口部を有し、 底部を有しそしてアミン溶液がその中を流れる時に前記垂直セグメントへ陰 イオンポリマー溶液の小滴を導入するための前記垂直セグメントの上部に位置す る毛管部材であって、前記毛管部材の前記底部は前記垂直セグメントの上面開口 部の上に予め決めた距離で固定されている からなる上記の装置。 45．さらに、前記毛管部材の前記底部にまたは底部近くに前記毛管部材に接する 音響プローブを有する請求項44の装置。 46．以下のもの： 上部管および下部管であって、前記管は垂直に配置されそして直列状であり 、前記管の両方とも上端部および下端部およびその中で反応が生じる小滴の予め 選択した最大寸法の桁の直径を有するもの、 前記上部管の下端部付近へ脈動する機械的エネルギーを付与する手段； 前記上部管を通り下向きに流れる第一の反応溶液の流れを起こさせる手段； 前記機械的エネルギーの頻度および強度、前記第一の反応溶液の流体力学的 特性および前記上部管の下端部の表面特性は、前記脈動するエネルギーに相当す る頻度および前記管の直径に相当する寸法を有する離れた小滴の列として前記上 部管を出すために前記第一の反応溶液の流れを起こさせるために一まとめに選択 され； 第二の反応溶液の流れを下向きでない方向から前記管の下部へ入れ次いでそ の中で下向きに流れさせる手段； 上部管の下端部から下向きに滴下する前記第一の反応溶液の小滴がその上端 部で前記下部管へ入りそして前記第二の反応溶液の流れが下向きでない方向から 下向きに向かう地点で前記第二の反応溶液の流れと接触するような空間的関係を 有する前記上部管および下部管 からなる二つの反応物間の滴下反応を提供する装置。 47．請求項21の複数のマイクロカプセルを含むワクチン。 48．前記マイクロカプセルの免疫原性物質がロタウィルスである請求項47のワク チン。 49．前記マイクロカプセルの免疫原性物質が肝炎B 表面抗原である請求項47のワ クチン。 50．前記マイクロカプセルの免疫原性物質が生きた弱毒化ウィルスである請求項 47のワクチン。 51．500 - 1,000 μの範囲の粒子径を有する請求項13のマイクロカプセル。 52．1 - 10μの範囲の粒子径を有する請求項13のマイクロカプセル。